本发明属于生物检测，特别是一种用于细菌TreS途径海藻糖产生菌筛选中快速定量检测海藻糖合酶酶活力的方法。
背景技术：
海藻糖（trehalose）又称α-D-吡喃葡糖苷基-α-D-吡喃葡糖苷，是一种安全、可靠的天然糖类，海藻糖对多种生物活性物质具有非特异性保护作用。海藻糖对生物体具有神奇的保护作用，是因为海藻糖在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下在细胞表面能形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活，从而维持生命体的生命过程和生物特征。而自然界中如蔗糖、葡萄糖等其它糖类，均不具备这一功能。这一独特的功能特性，使得海藻糖可以作为蛋白质、酶、疫苗和其他生物制品的优良活性保护剂。海藻糖因此在科学界素有“生命之糖”的美誉。国际权威的《自然》杂志曾在2000年7月发表了对海藻糖进行评价的专文，文中指出：“对许多生命体而言，海藻糖的有与无，意味着生命或者死亡”。同时海藻糖安全无公害，作为一种绿色食品添加剂已通过美国和欧盟的认证，而且有很大的市场需求量。
在不同生物中，海藻糖生物合成主要有三种途径：1）OtsA-OtsB途径，即以UDP-葡萄糖和6-P-葡萄糖为底物，通过TPS(Trehalose-6-phosphate synthase，6-磷酸海藻糖合成酶)和TPP(Trehalose-6-phosphate phosphate，6-磷酸海藻糖磷酸酯酶)两种酶催化合成海藻糖；2）TreY-TreZ途径，即以淀粉为底物，利用麦芽寡糖基海藻糖合成酶（maltooligosyl trehalose synthase,MTSase,TreY基因编码）和麦芽寡糖基海藻糖水解酶（maltooligosyl trehalose hydrolase,MTHase,TreZ基因编码）的协同作用，将淀粉转化为海藻糖；3）TreS（Trehalose synthase，海藻糖合酶）途径，即以麦芽糖为底物，利用菌株内特异的海藻糖合酶分子内转糖基化作用，将麦芽糖转化为α，α-1,1-糖苷键连接而成的海藻糖。
海藻糖的各种生产方法，包括微生物酵母抽提法、微生物发酵法、天然生物提取法、酶转化法、化学合成法、基因重组法等，酶法转化海藻糖一直是工业生产海藻糖的主要途径，TreS途径海藻糖合酶单酶转化法生产海藻糖，不需要任何辅酶，以麦芽糖为底物，一步转化生成海藻糖，底物专一性强，工艺简单，易于调控，在工业化生产海藻糖中具有良好的应用前景，适于工业化生产海藻糖，在工业酶法生产海藻糖中最具优势，但仍有许多问题需要研究解决，其中海藻糖合酶是至关重要，而筛选产海藻糖合酶高产菌株关键。目前在TreS途径海藻糖合酶产生菌筛选过程中海藻糖合酶酶活力分析工作繁重，海藻糖合酶酶活力定量检测通过分析产物海藻糖的含量来获得，用于海藻糖合酶酶解麦芽糖产物海藻糖的定量分析方法中，主要借助高效液相色谱（HPLC），高效液相色谱（HPLC）是最理想的方法，能快速、准确测定样品中的海藻糖，但存在设备昂贵等特点（繆静，2004），这些方法的推广不仅受到实验室设备条件的限制，而且对样品的纯度要求高，无法对提取过程中的中间试样品进行测定，并且对于菌种筛选、培养及提取过程中大量的海藻糖快速定性定量测定工作，完全依赖于HPLC并不是一个高效经济的方法，给科研工作带来一定困难（周坚，1997）（毛忠贵，1997）（段峰，2008）。高效液相色谱（HPLC）是最理想的方法，能快速、准确进行定量分析，但存在设备昂贵、操作成本高、样品处理制备比较繁琐等特点，不仅需要昂贵的仪器和试剂，而且在测定前，还需对样品进行多步处理，耗时多，操作繁琐，不适用于海藻糖生产菌的筛选（安宁，2011）（王雷，2004）。寻找一种应用于海藻糖生产菌株的筛选中，能够准确、快捷地检测海藻糖合酶酶活性的方法且设备简单、操作简单易行、费用低、易于海藻糖生产菌种初筛和中间试样的测定，作为海藻糖产生菌筛选及工艺参数确定的常规手段很需要。
技术实现要素：
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种用于细菌TreS途径海藻糖产生菌筛选中快速定量检测海藻糖合酶酶活力的方法，可有效解决TreS途径海藻糖产生菌筛选中快速定量检测海藻糖合酶酶活力的分析工作繁重、使用仪器和试剂昂贵、操作成本高、样品处理繁琐的问题。
本发明解决的技术方案是，包括以下步骤：
A、制作标准曲线：将麦芽糖250.00mg，溶于蒸馏水中，制成麦芽糖含量为1mg/mL的麦芽糖溶液，吸取麦芽糖溶液0.0mL、2.0mL、4.0mL、6.0mL、8.0mL、10.0mL，分别加入蒸馏水定容至100mL，配制不同浓度的梯度麦芽糖溶液，取6支试管编号为1、2、3、4、5、6，分别吸取梯度麦芽糖溶液2.5mL，各加入2.5mL的3,5-二硝基水杨酸显色液，沸水浴5分钟，冷却至室温，于540nm波长下比色，记录各管的OD值，以光密度OD值为纵坐标，2.5mL梯度麦芽糖溶液中麦芽糖含量，单位为mg/mL为横坐标，制作成标准曲线；
所述的3,5-二硝基水杨酸显色液是：酒石酸钾钠182.0g溶于蒸馏水700mL中，加热，趁热加入3,5-二硝基水杨酸6.3g、氢氧化钠20.96g、苯酚5.0g和亚硫酸钠5.0g，搅拌溶解均匀，冷却后加蒸馏水定容至1000mL；
B、制备待测海藻糖合酶酶液：发酵液于4℃、6000r/min离心15min，弃上清液，获得的菌体用0.05mol/L（pH7.0）磷酸缓冲液振荡洗涤2-3次，收集湿菌体；称取1.000g湿菌体加入0.05mol/l（pH7.0）磷酸缓冲液定容至原发酵液体积，制成菌悬液，每克干菌体加入20000U活力单位的溶菌酶，37℃振荡破壁30min，将破壁后的菌悬液于4℃、12000r/min离心15min去沉淀，收集上清液即为海藻糖合酶酶液；
所述的发酵液的制备方法是，在无菌操作下，从产海藻糖合酶菌株试管斜面菌种挑取2-3环，接种于60mL发酵产酶培养基中，37℃、160r/min摇床振荡培养48h制成；所述的发酵产酶培养基是由重量计的：麦芽糖10.0g、蛋白胨5.0g、牛肉膏1.0g、K2HPO4 1.0g、NaH2PO4 1.0g、MgSO4·7H2O 0.5g和蒸馏水1000mL混匀，调节酸碱度至pH7.2制成；
C、海藻糖合酶酶活力的定量检测，方法是：
制备试验样品，测出麦芽糖含量：取15mm×150mm试管3支，编号1、2、3，每管内加入2.0mL待测海藻糖合酶酶液，与质量浓度5%麦芽糖溶液2.0mL混合，在60℃水浴保温1h，沸水浴10min，使酶失活，以终止反应，12000r/min离心15min，收集上清液，稀释成OD值0.1-0.3的稀释液，然后再取15mm×150mm试管3支，编号1、2、3，每支试管加入稀释液2.5mL，再加入2.5mL的3,5-二硝基水杨酸显色液，沸水浴5分钟，冷却至室温后于540nm波长下比色，记录测定各管的OD值，取3支试管OD值的平均值，查标准曲线测出试验样品麦芽糖含量；
制备空白组样品，测出麦芽糖含量：取15mm×150mm试管3支，编号(1)、（2）、（3），每管内加入质量浓度5%麦芽糖溶液2.0mL,在60℃水浴保温1h后，再补加入2.0mL待测海藻糖合酶酶液混匀，立即沸水浴10min，使酶失活，以终止反应，12000r/min离心15min，收集上清液，稀释成OD值0.1-0.3的稀释液，然后再取15mm×150mm试管3支，编号1、2、3，每支试管加入稀释液2.5mL，再加入2.5mL 3,5-二硝基水杨酸显色液，沸水浴煮沸5分钟，冷却至室温后于540nm波长下比色，记录测定各管的OD值，取3支试管OD值的平均值，查标准曲线测出空白组样品麦芽糖含量；
所述的质量浓度5%麦芽糖溶液是由麦芽糖5.000g加入0.05mol/L（pH7.0）磷酸盐缓冲液定容至100mL制成；
D、活力测定：
海藻糖合酶酶活力定义：在60℃、pH7.0条件下，以质量浓度5%麦芽糖为底物，每克干菌体1h产生1mg海藻糖为1个酶活力单位（U）；
空白试验查标准曲线得到的麦芽糖含量减去样品试验查标准曲线得到麦芽糖含量，计算得出海藻糖合酶酶活力，实现快速定量检测海藻糖合酶酶活力。
本发明方法易操作，检测速度快，成本低，效果好，方法稳定可靠、准确，易于推广普及应用，经济和社会效益显著。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明在具体实施中，可由以下实施例给出。
实施例1
本发明在具体实施中，所述的制备待测海藻糖合酶酶液：无菌操作从产海藻糖合酶菌株H1试管斜面菌种挑取2-3环接种于60mL发酵产酶培养基中，每250mL三角瓶中装入60mL产酶培养基，37℃、160r/min摇床振荡培养48h，成发酵液，发酵液于4℃、6000r/min离心15min，弃上清液，获得的菌体用0.05mol/L（pH7.0）磷酸缓冲液振荡洗涤2-3次，收集湿菌体；称取1.000g湿菌体加入0.05mol/l（pH7.0）磷酸缓冲液定容至原发酵液体积，制成菌悬液，每克干菌体加入20000U活力单位的溶菌酶，37℃振荡破壁30min，将破壁后的菌悬液于4℃、12000r/min离心15min去沉淀，收集上清液即为海藻糖合酶酶液；
所述的海藻糖合酶酶活力的定量检测，方法是：
制备试验样品，测出麦芽糖含量：取15mm×150mm试管3支，编号1、2、3，每管内加入2.0mL待测海藻糖合酶酶液，与质量浓度5%麦芽糖溶液2.0mL混合，在60℃水浴保温1h，沸水浴10min，使酶失活，以终止反应，12000r/min离心15min，收集上清液，稀释成OD值0.1-0.3的稀释液，然后再取15mm×150mm试管3支，编号1、2、3，每支试管加入稀释液2.5mL，再加入2.5mL的3,5-二硝基水杨酸显色液，沸水浴5分钟，冷却至室温后于540nm波长下比色，记录测定各管的OD值，取3支试管OD值的平均值，查标准曲线测出试验样品麦芽糖含量；
制备空白组样品，测出麦芽糖含量：取15mm×150mm试管3支，编号(1)、（2）、（3），每管内加入质量浓度5%麦芽糖溶液2.0mL,在60℃水浴保温1h后，再补加入2.0mL待测海藻糖合酶酶液混匀，立即沸水浴10min，使酶失活，以终止反应，12000r/min离心15min，收集上清液，稀释成OD值0.1-0.3的稀释液，然后再取15mm×150mm试管3支，编号1、2、3，每支试管加入稀释液2.5mL，再加入3,5-二硝基水杨酸显色液2.5mL，沸水浴煮沸5分钟，冷却至室温后于540nm波长下比色，记录测定各管的OD值，取3支试管OD值的平均值，查标准曲线测出空白组样品麦芽糖含量；
所述的活力测定：
采用高效液相色谱（HPLC）法进行分析检测：采用安捷伦1200型高效液相色谱仪仪器，配以示差折光检测器，使用的分析柱为安捷伦糖分析柱ZORBAX NH2(4.6×250mm,5μm)，流速为1ml/min，流动相为体积比：乙腈︰去离子水=84︰16，标准品为1%麦芽糖、1%海藻糖、1%葡萄糖，混合标样为麦芽糖、海藻糖和葡萄糖混合在一起制成；
高效液相色谱（HPLC）检测结果显示菌株H1酶解反应离心上清液中没有葡萄糖生成，只含有麦芽糖和海藻糖，计算出海藻糖合酶酶活力110.7U，多次重复检测符合率在90.1%以上。
实施例2
本发明在具体实施中，所述的制备待测海藻糖合酶酶液：无菌操作从产海藻糖合酶菌株H12试管斜面菌种挑取2-3环接种于60mL发酵产酶培养基中，每250mL三角瓶中装入60mL产酶培养基，37℃、160r/min摇床振荡培养48h，成发酵液，发酵液于4℃、6000r/min离心15min，弃上清液，获得的菌体用0.05mol/L（pH7.0）磷酸缓冲液振荡洗涤2-3次，收集湿菌体；称取1.000g湿菌体加入0.05mol/l（pH7.0）磷酸缓冲液定容至原发酵液体积，制成菌悬液，每克干菌体加入20000U活力单位的溶菌酶，37℃振荡破壁30min，将破壁后的菌悬液于4℃、12000r/min离心15min去沉淀，收集上清液即为海藻糖合酶酶液；
所述的海藻糖合酶酶活力的定量检测，方法是：
制备试验样品，测出麦芽糖含量：取15mm×150mm试管3支，编号1、2、3，每管内加入2.0mL待测海藻糖合酶酶液，与质量浓度5%麦芽糖溶液2.0mL混合，在60℃水浴保温1h，沸水浴10min，使酶失活，以终止反应，12000r/min离心15min，收集上清液，稀释成OD值0.1-0.3的稀释液，然后再取15mm×150mm试管3支，编号1、2、3，每支试管加入稀释液2.5mL，再加入2.5mL的3,5-二硝基水杨酸显色液，沸水浴5分钟，冷却至室温后于540nm波长下比色，记录测定各管的OD值，取3支试管OD值的平均值，查标准曲线测出试验样品麦芽糖含量；
制备空白组样品，测出麦芽糖含量：取15mm×150mm试管3支，编号(1)、（2）、（3），每管内加入质量浓度5%麦芽糖溶液2.0mL,在60℃水浴保温1h后，再补加入2.0mL待测海藻糖合酶酶液混匀，立即沸水浴10min，使酶失活，以终止反应，12000r/min离心15min，收集上清液，稀释成OD值0.1-0.3的稀释液，然后再取15mm×150mm试管3支，编号1、2、3，每支试管加入稀释液2.5mL，再加入3,5-二硝基水杨酸显色液2.5mL，沸水浴煮沸5分钟，冷却至室温后于540nm波长下比色，记录测定各管的OD值，取3支试管OD值的平均值，查标准曲线测出空白组样品麦芽糖含量；
所述的活力测定：
采用高效液相色谱（HPLC）法进行分析检测：采用安捷伦1200型高效液相色谱仪仪器，配以示差折光检测器，使用的分析柱为安捷伦糖分析柱ZORBAX NH2(4.6×250mm,5μm)，流速为1ml/min，流动相为体积比：乙腈︰去离子水=84︰16，标准品为1%麦芽糖、1%海藻糖、1%葡萄糖，混合标样为麦芽糖、海藻糖和葡萄糖混合在一起制成；
高效液相色谱（HPLC）检测结果显示菌株H12酶解反应离心上清液中没有葡萄糖生成，只含有麦芽糖和海藻糖，计算出海藻糖合酶酶活力109.3U，多次重复检测符合率在90.1%以上。
本发明细菌产海藻糖合酶为胞内酶，通过溶菌酶破壁，使细胞内海藻糖合酶释放出来， TreS（Trehalose synthase，海藻糖合酶）途径，即以麦芽糖为底物，利用海藻糖合酶分子内转糖基化作用，底物专一性强，将麦芽糖α，α-1,4-糖苷键一步转化为α，α-1,1-糖苷键连接而成的海藻糖，麦芽糖具有还原性，海藻糖不具有还原性， 利用3,5-二硝基水杨酸法检测以麦芽糖为底物加入海藻糖合酶反应前后麦芽糖的含量，通过麦芽糖的减少量计算海藻糖的含量，从而计算海藻糖合酶活力的方法，达到快速定量检测海藻糖合酶酶活力多少，确定产海藻糖合酶菌株，达到快速筛选海藻糖产生菌的目的。3,5-二硝基水杨酸法（DNS法）是利用碱性条件下，3,5-二硝基水杨酸（DNS）与还原糖发生氧化还原反应，生成3-氨基-5-硝基水杨酸，该产物在煮沸条件下显棕红色，且在一定浓度范围内颜色深浅与还原糖含量成比例关系的原理，用比色法测定还原糖含量。
本发明利用海藻糖合酶专一性将麦芽糖转化成海藻糖，麦芽糖具有还原性，海藻糖不具有还原性，3,5-二硝基水杨酸法（DNS法）测定加入海藻糖合酶反应前后麦芽糖的减少量，计算海藻糖的量，从而计算出海藻糖合酶的酶活力。该方法所用试剂为价格低的常规试剂如3,5-二硝基水杨酸、麦芽糖、磷酸二氢钾、氢氧化钠、酒石酸钾钠等，而高效液相色谱（HPLC）法需要乙腈、海藻糖标品等昂贵试剂，本发明原料丰富廉价，成本可降低50%以上，所需主要分析仪器设备为分光光度计，设备简单，不需昂贵的仪器，减少投资2倍以上，且操作简单易行，检测速度快，仅为原方法的1/5时间，样品处理简单有效，易于推广普及等优点，为研究人员提供了方便快捷的海藻糖合酶酶活性检测手段，适于大批量样品的TreS途径海藻糖合酶产生菌筛选过程中分析检测工作，批内变异系数和批间变异系数分别为1.49%和2.76%，具有良好的重复性和稳定性，样品添加回收率均达95%以上，结果于高效液相色谱（HPLC）法检测验证，符合率在90.1%以上。同时也避免了如高效液相色谱（HPLC）分析中与有害物质甲醇、乙腈等的接触，确保安全。