多肽药物中氨基酸消旋和非对映异构体杂质的检测方法与流程

本发明涉及多肽检测领域，具体涉及多肽药物合成中的氨基酸消旋以及非对映异构体杂质的检测方法。

背景技术：

由于氨基酸多为手性分子(甘氨酸除外)，在肽合成的过程中不可避免的存在消旋化的可能，这可能导致多肽分子部分甚至全部立体化学信息的丢失。由于肽类药物的生物活性与其立体构型密切相关，因此应对多肽合成中的氨基酸消旋化以及非对映异构体杂质进行研究和控制，通常采用反相色谱(RP-HPLC)系统对其进行检查。但已有文献报道：随着合成肽链的增长，少数氨基酸消旋产生的非对映异构体杂质采用反相色谱系统常无法有效检出，可根据产品性质尝试其他不同原理的色谱系统，如离子交换等。

醋酸艾塞那肽(Exenatide acetate，Exendin-4)是一种含有39个氨基酸的人胰高血糖素样多肽-1(Glucagon-like peptide-1，GLP-1)类似物，分子量约为4186道尔顿。Exendin-4具有促进胰岛素的分泌、增加胰岛素敏感性及改善胰岛细胞功能的作用，其结构与GLP-1有53％的同源性，且其N-端不被二肽基肽酶-IV(Dipeptidyl peptidase-IV，DPP-IV)分解，因此血浆半衰期(t1/2)更长，稳定性更高，药效作用更好，是极具有前景的治疗糖料病的药物(ArulmozhiaDK,Portha B.GLP-1based therapy for type 2diabetes.Eur J Pharm Sci,2006,28(1-2):96-108.Lovshin JA,Drucker DJ.Incretin-based therapies for type 2diabetes mellitus.Nat Rev Endocrinol,2009,5(5):262-269.)。

美国Eli Lilly公司和AmylinPharmaceuticals公司在体外大量合成Exendin-4，并将其命名为Exenatide(醋酸艾塞那肽)。2005年4月，美国食品药品管理局批准Exenatide(Byetta＠)在美国上市，用于使用二甲双胍、磺脲类药物不能理想控制血糖的Ⅱ型糖尿病患者的治疗(Kendall DM,Cuddihy RM,Bergenstal RM.Clinical application of incretin-based therapy:therapeutic potential,patient selection and clinical use.Am J Med,2009,122(6):S37-S50)。

合成醋酸艾塞那肽的氨基酸多为手性分子，合成过程中不可避免存在消旋化的可能。由于肽类药物的生物活性与其立体构型密切相关，因此有必要对多肽药物合成中的氨基酸消旋以及非对映异构体杂质进行研究控制，通常采用反相色谱(RP-HPLC)系统对其进行检查。齐崴采用C18柱、水(0.1％TFA)和乙腈(0.1％TFA)梯度洗脱的色谱系统对使用HBTU/Fmoc固相法合成的七肽H2N-PFNSLAI -COOH进行了研究，通过色谱条件的优化，可将4种非对映异构体良好分离(Wei Q,Chenxi J,Zhimin H,et al.Analysis of racemization products of synthetic heptapeptide by reversed phase high performance liquid chromatography/mass spectrometry[J].Chinese Journal of Analytical Chemistry,2006,34(9):1244.)。但有学者指出，随着合成肽链的增长，少数氨基酸消旋产生的非对映异构体杂质(特别是差向异构体杂质)的色谱行为与主成分非常接近，采用反相色谱系统常无法有效检出，可根据产品性质尝试其他不同原理的色谱系统，如离子交换等(康建磊,徐冰珠,李建宇.关于合成多肽药物中非对映异构体杂质的研究[J].中国现代应用药学,2010(5):387-389.)。

本发明基于氨基酸等电点差异，采用阳离子交换色谱法分析以醋酸艾塞那肽在合成中组氨酸非对映异构体杂质为例对多肽药物纯度的检测方法进行研究，根据本发明的分析方法，对组氨酸非对应异构体杂质得到了有效的控制，该分析方法是有效可行的。

技术实现要素：

本发明一个方面涉及一种多肽药物合成中的氨基酸消旋以及非对映异构体杂质的检测方法，其特征在于，以离子交换色谱法对氨基酸消旋以及非对映异构体杂质进行检测。

具体地，所述的离子交换色谱法为选自以阳离子交换色谱柱和/或阴离子交换色谱柱进行的高效液相色谱法。

具体地，所述阳离子交换色谱柱为磺酸基键合硅胶颗粒为填料的色谱柱。

具体地，所述多肽药物选自醋酸艾塞那肽、利拉鲁肽、阿米林、利司那肽、阿必鲁肽等。

具体地，所述多肽药物的非对映异构体杂质为醋酸艾塞那肽的组氨酸非对映异构体杂质。

具体地，所述多肽药物的非对映异构体杂质为醋酸艾塞那肽的组氨酸非对映异构体杂质，所述离子交换色谱法为阳离子交换色谱法，其高效液相色谱条件为：所用的色谱柱填料为磺酸基键合硅胶颗粒为填料的色谱柱，所述的色谱柱填料颗粒粒径为1.7-10μm，检测波长210-280nm，流速0.5-1.5mL/min，柱温25-50℃，进样量10-30μL，色谱分析时间为20-60min。

具体地，将含20-150mM的磷酸二氢钾溶液，用磷酸调节pH值至2.5-5.0；然后与乙腈以体积比1:1混合后作为流动相。

具体地，离子交换色谱法以等度模式洗脱。

具体地，所述阳离子交换色谱柱色谱柱选用PolyLC Poly SULFOETHYL A,100mm×4.6mm，3μm，优选地，为两根色谱柱串联。

具体地，采用紫外多波长检测器进行检测，检测波长为214nm。

本发明的检测方法操作简单、工艺简化、收率高、环境友好、经济效益高、可规模化生产。

本发明另一个方面涉及一种多肽的氨基酸异构体高效液相色谱分析方法，特征在于，通过高效液相色谱仪采用串联两根阳离子交换色谱对供试品进行洗脱，所述方法包括以下步骤：

(1)高效液相色谱条件为：所用的色谱柱填料为磺酸基键合硅胶颗粒，粒径1.7-10μm，检测波长210-280nm，流速0.5-1.5mL/min，柱温25-50℃，进样量10-30μL，色谱分析时间为20-60min；

(2)流动相条件为：流动相A为含20-150mM的磷酸二氢钾溶液，用磷酸调节pH值至2.5-5.0；与乙腈体积比1:1混合后作为流动相A；

(3)配制样品溶液，其中样品为经过分离纯化后所得多肽，用流动相配制样品成0.5-5mg/mL或与分离体系相匹配的分析样品溶液；

(4)测定峰面积，按面积归一法计算待测样品中杂质所占百分比。

进一步地，所述多肽为醋酸艾塞那肽，优选地，所述多肽的氨基酸异构体为的醋酸艾塞那肽组氨酸非对映异构体。

本发明再一个方面涉及前述方法在多肽质量控制中的应用。

本发明中的“醋酸艾塞那肽一个或多个氨基酸的非对映异构体”是指因醋酸艾塞那肽中的一个或多个氨基酸手型分子消旋而产生的非对应异构体。

本发明中的“醋酸艾塞那肽组氨酸非对映异构体”是指因醋酸艾塞那肽中的组氨酸手型分子消旋而产生的非对应异构体。

附图说明

图1为空白溶剂(流动相A)色谱分析图。

图2为本发明对杂质组氨酸异构体色谱分析图。

图3为实施例2对纯化后组醋酸艾塞那肽色谱分析图。

图4为实施例3对纯化后组醋酸艾塞那肽色谱分析图。

具体实施方式

本发明采用如下技术方案：醋酸艾塞那肽组氨酸非对映异构体的高效液相分析方法，通过高效液相色谱仪采用阳离子交换色谱法对其进行分析。其高效液相色谱条件为：所用的色谱柱填料为磺酸基键合硅胶颗粒为填料的色谱柱，所述的色谱柱填料颗粒粒径为1.7-10μm，检测波长210-280nm，流速0.5-1.5mL/min，柱温25-50℃，进样量10-30μL，色谱分析时间为20-60min。

上述的分析方法，所用流动相记为流动相A。A为含20-150mM的磷酸二氢钾溶液，用磷酸调节pH值至2.5-5.0；与乙腈体积比1:1混合后作为流动相A。

本发明采用等度模式洗脱。

实施案例1系统适用性

使用沃特世2695高效液相色谱仪2489紫外多波长检测器，波长设为214nm，色谱柱选用PolyLC Poly SULFOETHYL A,100mm×4.6mm，3μm，两根串联。流动相A：100mM的磷酸二氢钾溶液，用磷酸调pH至3.8；与乙腈体积比1:1混合后作为流动相A。流动相A等度洗脱时间设为40min。流速设为1mL/min，柱温采用40℃，进样体积20μL。

称取251.17mg的组氨酸非对映异构体杂质，置于50mL容量瓶中，用流动相A稀释至刻度，作为母液；取1mL母液置于100mL容量瓶中，用流动相A稀释至刻度，制成浓度为50.23μg/mL的组氨酸非对映异构体对照品溶液，连续进样5针，计算峰面积RSD，其结果为5.12％，可见其结果符合要求。空白溶剂图谱与某一样品色谱分析图见图1、图2。

实施例2纯化产物醋酸艾塞那肽组氨酸非对映异构体检测

使用沃特世2695高效液相色谱仪2489紫外多波长检测器，波长设为214nm，色谱柱选用PolyLC Poly SULFOETHYL A,100mm×4.6mm，3μm，两根串联。流动相A：100mM的磷酸二氢钾溶液，用磷酸调pH至3.8；与乙腈体积比1:1混合后作为流动相A。流动相A等度洗脱时间设为40min。流速设为1mL/min，柱温采用40℃，进样体积20μL。

取分离纯化后所得产物醋酸艾塞那肽，加流动相A溶解并制成每1mL含约0.5mg醋酸艾塞那肽的溶液，供测试。保留时间15.633min为组氨酸非对映异构体杂质，其色谱分析图见图3。本案例说明本发明用于醋酸艾塞那肽合成中组氨酸非对映异构体的控制与工艺优化是有效的、可行的。

实施例3纯化产物醋酸艾塞那肽组氨酸非对映异构体检测

使用沃特世2695高效液相色谱仪2489紫外多波长检测器，波长设为214nm，色谱柱选用PolyLC Poly SULFOETHYL A,100mm×4.6mm，3μm，两根串联。流动相A：150mM的磷酸二氢钾溶液，用磷酸调pH至4.8；与乙腈体积比1:1混合后作为流动相A。流动相A等度洗脱时间设为40min。流速设为0.75mL/min，柱温采用50℃，进样体积10μL。取分离纯化后所得产物醋酸艾塞那肽，加流动相A溶解并制成每1mL含约0.5mg醋酸艾塞那肽的溶液，供测试。应用该分离条件，醋酸艾塞那肽组氨酸非对映异构体的保留时间为21.267min，色谱分析图见图4。