本发明属于药物纯度测定的
技术领域：
，具体涉及一种用高效液相色谱测定钆弗塞胺纯度的分析方法，也涉及测定钆弗塞胺中2-甲氧基乙胺的方法。
背景技术：
：作为重要的造影剂，钆弗塞胺主要用于磁共振成像和磁共振血管造影术，可提高成像效果。2-甲氧基乙胺为合成钆弗塞胺的原料，但其具有一定的毒性，因此需要在成品中进行严格控制，检测其在成品的残余量成为提高钆弗塞胺纯度的关键环节。目前，由于2-甲氧基乙胺原料杂质的分子结构简单、分子量小，且本身无紫外吸收，难以用高效液相色谱法直接测定。现有技术对2-甲氧基乙胺的测定方法误差大、重复性差、步骤繁琐。对于需严格控制2-甲氧基乙胺含量的钆弗塞胺而言，实现对其2-甲氧基乙胺的含量进行准确和便捷的测定显得尤为重要。技术实现要素：针对现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种用高效液相色谱测定钆弗塞胺纯度分析方法，检测其中2-甲氧基乙胺含量的方法，该方法包括如下步骤：（1）分别制备待测样品和邻苯二甲醛溶液；（2）设置进样程序为：所述的邻苯二甲醛溶液的体积为待测样品体积的3～8倍；待邻苯二甲醛溶液和待测样品充分混合后，进样；（3）记录色谱图，按外标法以峰面积计算2-甲氧基乙胺的含量。所述的待测样品为2-甲氧基乙胺对照品溶液或钆弗塞胺供试品溶液。其中用于含量测定的计算公式为：式I式I中：A样为供试品峰面积；C对为对照品溶液浓度，（mg/ml）；A对为对照品峰面积；C样为供试品溶液浓度，（mg/ml）。发明人通过大量实验摸索发现，通过控制邻苯二甲醛溶液和供试品溶液/对照品溶液的体积比，以及调节色谱条件，可以得到重复性好、灵敏度高、确定性好以及方便快捷的测定钆弗塞胺中2-甲氧基乙胺含量的方法。如本发明的一个实施例和一个对比实施例所示，同样采取高效液相色谱仪但不采用本发明方法时，测量的误差率很大，而本发明能显著降低测量的误差。其中，进样程序是误差率的重要影响因素，本发明所采取的进样程序克服了现有技术具有较大误差的缺陷。优选的，所述的2-甲氧基乙胺对照品溶液的浓度为0.001～0.26mg/ml，优选0.05～0.15mg/ml。优选的，所述的钆弗塞胺供试品溶液的浓度为2.5～50mg/ml，优选20～25mg/ml。优选的，所述的邻苯二甲醛溶液的制备过程为：用3ml甲醇溶解0.1g邻苯二甲醛，之后与100ml浓度为0.4mol/L、pH为10.0的硼酸盐缓冲液以及0.1ml2-巯基乙醇混合均匀并避光保存。优选的，所述的步骤（2）设置进样程序为：所述的邻苯二甲醛溶液的体积为待测样品体积的4～6倍。优选的，所述的步骤（2）设置进样程序为：先抽取一部分邻苯二甲醛溶液，记为溶液Ⅰ，再抽取待测样品，最后抽取另一部分邻苯二甲醛溶液，记为溶液Ⅱ，所述溶液Ⅰ与溶液Ⅱ的体积之和为待测样品的3～8倍，优选为4～6倍。所述优选取样顺序可使得检测的稳定性和便捷性得以提高。优选的，所述邻苯二甲醛溶液的体积为供试品溶液的5倍。所述的邻苯二甲醛溶液的体积为对照品溶液的5倍。优选的，所述溶液Ⅰ与溶液Ⅱ的体积之和为供试品溶液的5倍。所述溶液Ⅰ与溶液Ⅱ的体积之和为对照品溶液的5倍。在邻苯二甲醛浓度一定的情况下，邻苯二甲醛试液体积过大会使空白中杂峰增大，干扰测定，且在进行检测时，混合溶液总体积过大可能会导致混合不均匀，而体积过小则可能使得反应不完全。色谱条件为：色谱柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，规格为250×4.6mm、200×4.6mm、150×4.6mm中的一种；流动相为浓度为0.005～0.1mol/L、pH为3.0～6.5的磷酸盐缓冲液与乙腈的混合溶液，乙腈与磷酸盐的体积比为35:65～60:40；柱温为20～40℃；流动相流速为0.5～1.2ml/min；检测波长为320～350nm、220～240nm。优选的，待邻苯二甲醛溶液和待测样品混合2-20次后，等待小于8min进样。混合过程需要一定的时间，而邻苯二甲醛衍生化反应趋势为先迅速反应并达到最大值，而后衍生化物逐渐分解。若混合次数太多，则反应时间过长，可能使衍生化物分解而造成响应值减弱，并可能出现其他杂峰。而若混合次数过少，则可能会导致混合不均匀，衍生化反应不充分。本发明通过大量实验摸索发现，当混合次数为2-20次时，特别是混合次数为10～15次时，等待1～5min进样，对于钆弗塞胺中的2-甲氧基乙胺的检测误差非常小，为钆弗塞胺的质量控制提供了坚实的保障。同时，需指出的是，本发明尤其适合于钆弗塞胺中2-甲氧基乙胺的测定，但本发明同样适用于其它含有2-甲氧基乙胺类物质的分析检测。利用本发明方法或在本发明基础上进行常规改进，用于其它物质中2-甲氧基乙胺的测定，均不背离本发明实质精神，均属于本发明的保护范围。优选的，所述的柱温为25～30℃，流动性流速为0.8～1.0ml/min，检测波长为325～335nm。柱温过高会导致填料流失而导致柱效下降，且柱温升高会导致保留时间变短可能会影响到主峰与杂峰间分离度；而若柱温比室温低的太多，可能会使柱温箱难以准确控温(即设定温度与柱温箱内实际温度存在差异)，本发明针对钆弗塞胺和2-甲氧基乙胺的性质，将柱温选择为20℃～40℃之间,当柱温为25～30℃时，检测效果最好。本发明将流动相流速优选设定为0.8～1.0ml/min，流速过大可能会使色谱柱压力过高，流速过低可能会使出峰时间变长而不利于快速检测。衍生化物在230nm和335nm处有最大吸收，通常在开发液相方法时，都会进行紫外扫描或用带DAD检测器的液相进行光谱扫描以确定最适波长，该波长下其他物质应对待测物质应无干扰。选择325～335nm原因即为该波长为衍生化物最大吸收波长且反应液中其他物质对衍生化物测定无干扰。所述的磷酸盐缓冲液为磷酸二氢钾溶液、磷酸二氢钠溶液、磷酸二氢铵溶液、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二铵中的至少一种，优选为磷酸二氢铵溶液。本发明的分析方法可用于伯胺类物质的分析检测。本发明的有益效果：1、本发明的测定绝对误差低，最低可达到0.0002%，精度为常规方法的至少10倍以上；RSD仅为1.24%，显著的优于常规方法；2、本发明重复性好、操作便捷。附图说明图1为实施例1对照液1图谱，其中保留时间10.573min为2-甲氧基乙胺峰；图2为实施例1对照液II图谱，其中保留时间10.572min为2-甲氧基乙胺峰；图3为实施例1对照液Ⅲ图谱，其中保留时间10.574min为2-甲氧基乙胺峰；图4为实施例1供试液1图谱，其中保留时间10.580min为2-甲氧基乙胺峰；图5为实施例1供试液2图谱，其中保留时间10.576min为2-甲氧基乙胺峰；图6为实施例1供试液3图谱，其中保留时间10.575min为2-甲氧基乙胺峰；图7为实施例1供试液4图谱，其中保留时间10.579min为2-甲氧基乙胺峰；图8为实施例1供试液5图谱，其中保留时间10.581min为2-甲氧基乙胺峰；图9为实施例1供试液6图谱，其中保留时间10.581min为2-甲氧基乙胺峰；图10为实施例2对照液图谱，实施例2中将进样程序中将混合后等待时间设置为0min，其中保留时间11.205min为2-甲氧基乙胺峰；图11为实施例3对照液图谱，实施例3中将进样程序中将混合后等待时间设置为1min，其中保留时间11.460min为2-甲氧基乙胺峰；图12为实施例4对照液图谱，实施例4中将进样程序中将混合后等待时间设置为3min，其中保留时间11.413min为2-甲氧基乙胺峰；图13为实施例7对照液图谱，实施例7中将进样程序中将混合次数设置为5次，其中保留时间11.232min为2-甲氧基乙胺峰；图14为实施例10对照液图谱，实施例10中将进样程序中将混合次数设置为10次，其中保留时间11.233min为2-甲氧基乙胺峰；图15为实施例11对照液图谱，实施例11中将进样程序中将混合次数设置为15次，其中保留时间11.235min为2-甲氧基乙胺峰。图16为实施例12对照液图谱，实施例12中将进样程序中将等待时间设置为10min，其中保留时间11.509min为2-甲氧基乙胺峰；图17为实施例12对照液图谱，实施例12中将进样程序中将等待时间设置为15min，其中保留时间11.488min为2-甲氧基乙胺峰；图18为实施例12对照液图谱，实施例12中将进样程序中将等待时间设置为20min，其中保留时间11.752min为2-甲氧基乙胺峰。具体实施方式下面给出实施例以对本发明作进一步说明。有必要在此指出的是以下实施例不能理解为对本发明保护范围的限制，如果该领域的技术熟练人员根据上述本
发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整，仍属于本发明保护范围。实施例1色谱柱：资生堂CAPCELLPAKC18MGⅡ,5μ，250×4.6mm。液相：Agilent1260，各部件(型号)分别为：泵(G1311C)，检测器(G1314F),柱温箱(G1316A)，自动进样器(G1329B)。柱温：30℃。流速：1.0ml/min。检测波长：335nm。进样量：5μl。对照品溶液的制备：精密量取2-甲氧基乙胺对照品1ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。精密量取对照品储备液3ml，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照液Ⅰ(0.259mg/ml)；精密量取对照品储备液1ml，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照液Ⅱ(0.0864mg/ml)；精密量取对照液Ⅱ3ml，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照液Ⅲ(0.00259mg/ml)。供试品溶液的制备：精密称取钆弗塞胺250mg(供试液1：251.4mg，供试液2：250.3mg，供试液3：251.7mg，供试液4：250.8mg，供试液5：251.0mg，供试液6：251.2mg)，置10ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，作为供试品溶液。邻苯二甲醛试剂的制备：称取邻苯二甲醛0.1032g，置200ml棕色瓶中，加甲醇3ml使溶解，加硼酸盐缓冲液（称取硼酸12.1025g，加水400ml溶解，用2mol/L氢氧化钾溶液调节PH值至10.00，加水稀释至500ml，摇匀）100ml，并加入2-巯基乙醇0.1ml，混合均匀。流动相：乙腈-磷酸盐缓冲液，浓度为0.005mol/L，pH为5.0，乙腈与磷酸盐的体积比为45:55，磷酸盐为磷酸二氢铵。设置进样程序如表1：表1程序参数抽取抽取邻苯二甲醛试剂15μl抽取抽取样品（对照品溶液或供试品溶液）5μl抽取抽取邻苯二甲醛试剂10μl混合将邻苯二甲醛试剂和样品混合15次静置等待5min进样进样精密量取对照品溶液和供试品溶液各5μl，按上述进样程序，分别与一定量的邻苯二甲醛溶液自动混合后进样，记录色谱图，按外标法以峰面积计算供试品中2-甲氧基乙胺的含量。将6份供试品测得结果计算RSD%，考察本法重复性。实施例2色谱柱：资生堂CAPCELLPAKC18MGⅡ,5μ，250×4.6mm。液相：Agilent1260，各部件(型号)分别为：泵(G1311C)，检测器(G1314F),柱温箱(G1316A)，自动进样器(G1329B)。柱温：30℃。流速：1.0ml/min。检测波长：335nm。进样量：5μl。对照品溶液的制备：精密量取2-甲氧基乙胺对照品1ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取其中1ml，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液(0.0864mg/ml)。供试品溶液的制备：用水溶解钆弗塞胺至浓度为50mg/ml。邻苯二甲醛试剂的制备：称取邻苯二甲醛0.1016g，置100ml棕色瓶中，加甲醇3ml使溶解，加硼酸盐缓冲液（称取硼酸12.1068g，加水400ml溶解，用2mol/L氢氧化钾溶液调节PH值至10.00，加水稀释至500ml，摇匀）100ml，并加入2-巯基乙醇0.1ml，混合均匀。流动相制备：乙腈-磷酸盐缓冲液，浓度为0.01mol/L，pH为5.0，乙腈与磷酸盐的体积比为45:55，磷酸盐为磷酸二氢铵。设置进样程序如表2：表2程序参数抽取抽取邻苯二甲醛试剂10μl抽取抽取样品（对照品溶液或供试品溶液）5μl抽取抽取邻苯二甲醛试剂5μl混合将邻苯二甲醛试剂和样品混合3次静置等待0min进样进样精密量取对照品溶液和供试品溶液各5μl，按上述进样程序，分别与一定量的邻苯二甲醛溶液自动混合后进样，记录色谱图，按外标法以峰面积计算供试品中2-甲氧基乙胺的含量。按本法制备3份对照品溶液Ⅱ连续测定，以峰面积计算RSD%，考察本法测量误差。实施例3精密量取对照品储备液3ml，置500ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照液Ⅰ(0.0518mg/ml)；精密量取对照品储备液1ml，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液(0.0864mg/ml)；精密量取对照液Ⅱ3.0ml，置250ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照液Ⅲ(0.00104mg/ml)。流动相为：乙腈-磷酸盐缓冲液，浓度为0.1mol/L，pH为3.0，乙腈与磷酸盐的体积比为45:55，磷酸盐为磷酸二氢钾；设置进样程序中等待时间为5min；其余同实施例2。实施例4流动相为：乙腈-磷酸盐缓冲液，浓度为0.05mol/L，pH为6.0，乙腈与磷酸盐的体积比为45:55，磷酸盐为磷酸二氢钠与磷酸氢二钾（1:1mol/mol）；设置进样程序中等待时间为8min；其余同实施例2。实施例5检测波长为320nm；设置进样程序中等待时间为5min，其余同实施例2。该波长下测定无杂峰干扰，制备3份对照品溶液II连续测定，峰面积RSD%为0.31%，测定误差小。实施例6检测波长为350nm；流动相为：乙腈-磷酸盐缓冲液，浓度为0.005mol/L，pH为5.0，乙腈与磷酸盐的体积比为60:40，其余同实施例2。该波长下测定无杂峰干扰，制备3份对照品溶液II连续测定，峰面积RSD%为0.43%，测定误差小。实施例7色谱柱：资生堂CAPCELLPAKC18MGⅡ,5μ，250×4.6mm。液相：Agilent1260，各部件(型号)分别为：泵(G1311C)，检测器(G1314F),柱温箱(G1316A)，自动进样器(G1329B)。柱温：30℃。流速：1.0ml/min。检测波长：335nm。进样量：5μl。对照品溶液的制备：精密量取2-甲氧基乙胺对照品1ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取其中3ml，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液(0.259mg/ml)。供试品溶液的制备：用水溶解钆弗塞胺至浓度为2.5mg/ml。邻苯二甲醛试剂的制备：称取邻苯二甲醛0.1058g，置200ml棕色瓶中，加甲醇3ml使溶解，加硼酸盐缓冲液（称取硼酸12.1019g，加水400ml溶解，用2mol/L氢氧化钾溶液调节PH值至10.00，加水稀释至500ml，摇匀）100ml，并加入2-巯基乙醇0.1ml，混合均匀。流动相制备：乙腈-磷酸盐缓冲液，浓度为0.01mol/L，pH为5.0，乙腈与磷酸盐的体积比为45:55，磷酸盐为磷酸二氢铵。设置进样程序如表3：表3程序参数抽取抽取邻苯二甲醛试剂25μl抽取抽取样品（对照品溶液或供试品溶液）5μl抽取抽取邻苯二甲醛试剂15μl混合将邻苯二甲醛试剂和样品混合3次静置等待5min进样进样精密量取对照品溶液和供试品溶液各5μl，按上述进样程序，分别与一定量的邻苯二甲醛溶液自动混合后进样，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，得到供试品中2-甲氧基乙胺的含量。按本法制备3份对照品溶液连续测定，以峰面积计算RSD%，考察本法测量误差。实施例8设置柱温为20℃，流动相流速为0.5ml/min，检测波长为220nm；磷酸盐为磷酸氢二铵；所加邻苯二甲醛、供试品溶液和对照品溶液的量与实施例7一致，只是在取样时，先取供试品溶液/对照品溶液5μl，再取邻苯二甲醛试剂40μl，然后混合3次。该色谱条件下测定无杂峰干扰，制备3份对照品溶液连续测定，峰面积RSD%为0.19%，测定误差小。实施例9设置柱温为40℃，流动相流速为1.2ml/min，检测波长为240nm；磷酸盐为磷酸氢二钠；所加邻苯二甲醛、供试品溶液和对照品溶液的量与实施例7一致，只是在取样时，先取邻苯二甲醛试剂40μl，再取供试品溶液/对照品溶液5μl，然后混合3次。该色谱条件下测定无杂峰干扰，制备3份对照品溶液连续测定，峰面积RSD%为0.26%，测定误差小。实施例10设置进样程序中混合次数为15次，其余同实施例7。实施例11设置进样程序中混合次数为20次，其余同实施例7。实施例12设置进样程序中等待时间分别为10min、15min、20min，其余同实施例2。由试验结果可知：等待时间超过8min后，随着等待时间的继续延长，衍生化物逐渐发生降解(降解产物峰见附图18的11.095min和12.182min杂峰)。对比实施例柱温：30℃。流速：1.0ml/min。检测波长：335nm。进样量：50μl。对照品溶液的制备：精密量取2-甲氧基乙胺对照品1ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。精密量取对照品储备液3ml，置500ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照液Ⅰ(0.0518mg/ml)；精密量取对照品储备液1ml，置500ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照液Ⅱ(0.0173mg/ml)；精密量取对照液Ⅱ3ml，置50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照液Ⅲ(0.00104mg/ml)。供试品溶液的制备：精密称取钆弗塞胺250mg(供试液1：250.7mg，供试液2：251.3mg，供试液3：251.6mg，供试液4：249.5mg，供试液5：250.1mg，供试液6：252.0mg)，置50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，作为供试品溶液。邻苯二甲醛试剂的制备：称取邻苯二甲醛0.1032g，置200ml棕色瓶中，加甲醇3ml使溶解，加硼酸盐缓冲液（称取硼酸12.1025g，加水400ml溶解，用2mol/L氢氧化钾溶液调节PH值至10.00，加水稀释至500ml，摇匀）100ml，并加入2-巯基乙醇0.1ml，混合均匀。流动相制备：取5mol/L磷酸2.0ml，加水550ml，用10%氨水溶液（v/v）调节pH值至5.00，加入乙腈450ml，混合均匀，抽滤。分别精密量取对照品溶液I、II、III和供试品溶液，精密加入等量的邻苯二甲醛试剂，充分振摇进行衍生，立即精密量取上述衍生后的对照品溶液I、II、III和供试品溶液各50μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，对照品溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中以2-甲氧基乙胺的峰面积与溶液浓度进行线性回归，根据标准曲线按峰面积计算供试品中2-甲氧基乙胺的含量。将6份供试品测定结果计算RSD%，考察本法重复性。按本法制备3份对照品溶液Ⅱ连续测定，按峰面积计算RSD%，考察本法测量误差。试验例1实施例1和对比实施例的测量误差进行比较，比较结果如表4。试验例2对实施例2、3、4、7、10、11和对比实施例的测量误差进行比较，比较结果如表5。上述结果表明，对比实施例制备6份供试品平行测定，RSD%为4.53%，误差较大、重复性差；而本发明的RSD%为1.24%，测定误差小、重复性更好。试验表明，本法进样程序中等待时间设定为0min～8min范围内、混合次数设定为2～20次范围内时，测定误差均大大小于对比实施例。当前第1页1 2 3