专利名称：葡糖胺二糖类、其制备方法和用途、以及含有这些二糖的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及特定的葡糖胺二糖类，特别是涉及2-N-和/或2’-N-酰化葡糖胺二糖类(其中至少一个酰基是支链的)和包含这些二糖的化合物。本发明还涉及从包含脂多糖脂质A部分的起始物质出发对其进行特定的碱处理来制备这些二糖的方法。本发明也涉及以这些二糖为活性成分的药物组合物。此外本发明还涉及这些二糖在治疗和预防方面的用途。
脂多糖构成微生物(例如革兰氏阴性菌)的内毒素，并包括一种多糖组分和一种脂质组分。这一脂质组分(也称为脂质A)决定脂多糖的内毒性特性(Rietschel E.Th.et al.，Immuno-biology，Volume 186，Pages 169-190〔1993〕)。
US-A-4,912,094中公开了一些修饰脂多糖，所述脂多糖在保持其抗原性质和免疫刺激性质的同时表现出降低的内毒性。这些修饰脂多糖是3-O-脱酰化的，并经酸水解可以转化成3-O-脱酰化二糖。在这些化合物中，一磷酰基3-O-脱酰化二糖比二磷酰基3-O-脱酰化二糖毒性要低。
本发明涉及二糖类，这些二糖是3-O-脱酰化的和3’-O-脱酰化的或者在3-O-位和/或3’-O-位具有一个短的O-连烷基或酰基，并且在2位、2’位、或2位和2’位两者上至少具有一个N-连支链酰基。这些化合物在保持生物学活性(例如免疫调节作用)的同时表现出更低的内毒性，并且具有抗癌活性。
令人惊奇地是，这些特定的葡糖胺二糖集较低的内毒性和保持的生物学活性于一体，因为尽管在2和2’位具有N-连酰基的合成3-O-和3’-O-脱酰化葡糖胺二糖类(化合物307，Takada，H.et al.，CRC Critical Reviews in Microbiology，Volume16，Pages 477-523〔1989〕；和化合物LA-19-PP，Rietschelet al.，〔1993〕)在体外试验中表现出某些免疫生物学活性，但这些活性比参照的细菌脂质A样品的活性弱得多。它们也缺乏典型的内毒活性。
因此，本发明涉及具有以下通式的β(1→6)葡糖胺＝糖和其盐， 其中R1是羟基、二羟膦酰氧基或其荷电形式、(C1-C5)酰氧基、(C1-C5)烷氧基、或者基团X；R2和R2’各自为酰基或基团Y，其条件是至少R2或R2’是基团Y；R3和R3’各自为氢原子，(C1-C3)烷基或(C1-C3)酰基；R4是氢原子、(C1-C3)烷基或(C1-C3)酰基；R4’是氢原子、(C1-C5)酰基、(C1-C5)烷基、二甲氧膦酰基、或者膦酰基或其荷电形式；且R6’是氢原子、羟基、二羟膦酰氧基、羟磺酰氧基、它们的荷电形式、或者基团Z；其中所述的基团X选自由以下基团组成的组羧基(C1-C5)烷氧基、-O-CH-〔(CH2)mCOOH〕〔(CH2)nCOOH〕基(其中m＝0-5，n＝0-5)、膦酰(C1-C5)烷基、二甲氧膦酰氧基、羟磺酰氧基、羟磺酰(C1-C5)烷基、和基团X的荷电形式；其中所述的基团Y选自由下列基团组成的组酰氧酰基、酰氨酰基、酰硫酰基、(C1-C24)烷氧酰基、(C1-C24)烷氨酰基、(C1-C24)烷硫酰基；且其中所述的基团Z选自由下列基团组成的组(C1-C24)烷氧基、(C1-C24)酰氧基、3-脱氧-D-甘露-2-辛酮糖酸(KDO)、(KDO)n(其中n＝1-10)、多糖侧链(例如来源于天然脂多糖的侧链)、核心组分(例如来源于天然脂多糖的组分)、和氨基-(C1-C8)烷基-羧基。
在鲎阿米巴样细胞溶胞产物(LAL)试验中测定时，这些葡糖胺二糖表现出比得自例如大肠杆菌的脂多糖(LPS)、按照US-A-4,912,094的脂质A和修饰脂质A低得多的内毒性。此外，这些按照本发明的葡糖胺二糖诱导一氧化氮反应性中间体和细胞因子(例如白细胞介素1-α(IL1-α)、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)和前列腺素(PGE))的产生。
此外，这些二糖表现出抗肿瘤(例如腹膜癌)活性。
最后，这些二糖的急性毒性非常低。在以每公斤体重100mg二糖静脉内给药后，没有观测到Swiss小鼠死亡。
本发明也涉及制备这些葡糖胺二糖的方法，该方法使用得自生物源的起始物质，即，任何包含得自微生物(例如革兰氏阴性菌)的脂多糖的脂质A部分的起始物质。按照本发明，对这一起始物质进行至少一次碱处理，以除去糖O-连酰基和/或O-连氧酰基。如果适当，可以对碱处理过的起始物质进行进一步的处理，以除去多糖和核心组分(经酸处理)、改变或交换1位、2位、3位、4位、2’位、3’位、4’位和6’位上的取代基。
然而，按照本发明的葡糖胺二糖也可以从相应的葡糖胺二糖出发经合成在2和/或2’位引于目的取代基来获得。
由于结合了极低的内毒性以及以上所述的生物学活性，这些按照本发明的二糖构成了药物组合物的出色的活性成分。这种药物组合物和二糖本身可以用作免疫调节剂、抗肿瘤剂和疫苗组分。
按照本发明的葡糖胺二糖(一种β(1→6)D-葡糖胺二聚体)的特征是每一个葡糖胺有3和3’位上都含有羟基或基本上不改变内毒性和/或生物学活性的短的O-连烷基或酰基，并且在2或2’位或者2和2’位两者上具有至少一个N-连支链酰基。剩下的2’或2位是N-酰化的。可能在2位和2’位上的两个疏水链(其中至少一个以支链酰基形式)的存在使所述二糖集极低的内毒性和保持生物学活性于一体。
支链酰基(本文总称为基团Y)选自由酰氧酰基、酰氨酰基、酰硫酰基、(C1-C24)烷氧酰基、(C1-C24)烷氨基和(C1-C24)烷硫酰基组成的组。
在酰氧酰基的情况下，两个酰基经氧原子连接，在酰氨酰基的情况F经NH基连接，在酰硫酰基的情况下经硫原子连接。基团Y的其它成员(C1-C24)烷氧酰基。(C1-C24)烷氨酰基和(C1-C24)烷硫酰基可以从相应的羟基脂肪酸获得。
优选地，基团Y代表一种在其3位有支链的N-连酰基，例如3-酰氧酰基、3-酰氨酰基和3-酰硫酰基。以上提及的(C1-C24)烷基等同物与之相同。
基团Y的优选成员包含一个或两个酰基部分，优选地选自脂肪酸残基、羟基脂肪酸残基和氧代脂肪酸残基。当酰氧酰基是3-酰氧酰基时，这些酰基部分包括3-羟基脂肪酸残基或由酯键连接的基团3-氧代脂肪酸残基。酰氧酰基的典型的例子是在3-羟基位与(C1-C24)羧酸经酯键连接的3-羟基(C1-C24)脂肪酸酰基。优选的酰氧酰基是在3-羟基位与(C10-C18)脂肪酸经酯链连接的3-羟基(C8-C18)脂肪酸酰基。这些酰氧酰基存在于革兰氏阴性菌的脂质A中，所述的革兰氏阴性菌例如为大肠杆菌、流感嗜血杆菌、Campylobacter jejuni.Rhodocyclusgelatinosus、紫色杆菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、明尼苏达沙门氏菌。
在按照本发明的第一组优选的葡糖胺二糖中，酰氧酰基是在3羟基位经酯键与C12脂肪酸连接的N-连3-羟基C14脂肪酸酰基，这一酰氧酰基在2’位上。在按照本发明的另一优选的葡糖胺二糖中，酰氧酰基是在3-羟基位经酯键与C14脂肪酸连接的N-连3羟基C14脂肪酸酰基，该酰氧酰基优选地在2’位上。
在按照本发明的另一优选的葡糖胺二糖中，酰氧酰基是在3-羟基位经酯键与C12脂肪酸连接的N-连3-羟基C14脂肪酸酰基，这一酰氧酰基在2位上。在按照本发明的另一优选的葡糖胺二糖中，酰氧酰基是在3-羟基位经酯键与C12脂肪酸连接的N-连3-羟基C14脂肪酸酰基，该酰氧酰基在2位和2’位两者上。
当基团Y含有手性中心时，本发明包括所有的R和S对映体以及任何外消旋混合物。
其它N-连取代基可以是酰基或者也可以是酰氧酰基。按第二组本发明的二糖，酰基是3-羟基(C4-C24)脂肪酸，优选地是3-羟基(C10-C18)脂肪酸。在本发明的优选的二糖中，酰基是3-羟基C14脂肪酸，该酰基在2位或2’位上。
然而，N连取代基也可以是以上定义的酰氧酰基，且包括在3-羟基位经酯键与(C1-C20)羧酸连接的N连3-羟基(C4-C24)脂肪酸酰基，优选在3-羟基位经酯键与(C10-C18)脂肪酸连接的N-连3-羟基(C8-C18)脂肪酸酰基。更优选的二糖是其中R2是在3-羟基位经酯键与C12脂肪酸或C16脂肪酸连接的N连3-羟基C14脂肪酸酰基，且其中R2’是在3-羟基位经酯键与C12脂肪酸或C14脂肪酸连接的N连3-羟基C14脂肪酸酰基。
注意在基团Y中，酰基和/或酰基和烷基可以互连。
在本说明书中，“脂肪酸残基”意指C2-C30个原子的基本上疏水的链，该链可以是直链的、支链的、饱和的、单或多不饱和的，具有插入其中的一个或多个朵原子(例如氮、氧、硫)，倘若对生物学活性基本上无不利的影响，该链可以是由一个或多个取代基(例如羟基、氧代、酰氧基、烷氧基、氨基、硝基、氰基、卤素、巯基)取代的。Onozuka，K.等在Int.J.ImmunopHarmac，Vol15，Pages 657-664〔1993〕中公开了取代的脂肪酸的一个例子(包含酰胺键连接的取代基)。
倘若葡糖胺二糖的性质不受不利影响，取代基R1可以是(C1-C5)酰氧基或(C1-C5)烷氧基，而R4’可以是(C1-C5)酰基或(C1-C5)烷基。此外，R1可以是羟基，且R4’可以是氢原子。优选地，R1和R4’各自可以是含磷的基团。特别是在1位和4’位的这种基团可以影响生物学活性，例如对细胞因子的不同的刺激作用(参见Takada，H.，and Kotani，S.，Bacterial EndotoxicLipopoly-saccharides，Morrison，D.C.and Ryan，J.，CRC Press，Volumel，pages 107-134〔1992〕，具体地说在123页上)。按照本发明的优选的二糖含有在1位上的二羟基膦酰氧基和在4’位的膦酰基，1位上的该基团优选地是α-构型。
取代基R1也可以由基团X代表。基团X在生理PH下一般带负电荷。基团X可以是羧(C1-C5)烷氧基。基团X也可以是具有通式-O-CH-〔(CH2)mCOOH〕〔(CH2)nCOOH〕(其中m＝0-10，且n＝0-10，例如m和n＝0；m和n＝1；m＝1，n＝3)的二羧酸。Onozuka等(1993)公开了其中m和n＝1的在1位的二羧酸取代基。基团X可以不是二羧酸而是膦酰(C1-C5)烷基，例如膦酰甲基或膦酰乙基。
取代基X也可以具有硫酸酯基团或羟基磺酰(C1-C5)烷基(例如羟基磺酰甲基)形式。
取代基R3和R3’可以是短的烷基或酰基，该基团对按照本发明的葡糖糖胺二糖的内毒性和/或生物学活性无不利影响。它们的例子是(C1-C3)烷基和(C1-C3)酰基。优选地，取代基R3和R3’两者都是氢原子，这意味着3位和3’位是非酰化的。
在4位上的取代基R4可以是(C1-C3)烷基或(C1-C3)酰基(其含义以上已说明过)。可以使用Kusumoto S.等在ACSSymposium Series 231卷237-254页(1983)上公开的方法合成4-O-酰化二糖。然而，4位上羟基(R4＝OH)是优选的。
取代基R6’可以是氢原子、羟基、二羟基膦酰氧基、二羟基磺酰氧基和它们的荷电形式。
为了改善按照本发明的葡糖胺二糖的水溶性，6’位上的取代基可以具有明显的亲水特性(该特性由基团Z赋予)。基团Z可以是3-脱氧-D-甘露-2-辛酮糖酸(KDO)或几个KDO分子，例如存在于紧靠脂质A组分的天然多糖的内核中的所述分子。
基团Z也可以是完整的或部分的多糖链，例如来源于天然脂多糖的侧链，或者来源于天然脂多糖的核心组分。
基团Z也可以是氨基-(C1-C8)烷基-羧基。
按照本发明的二糖的水溶性另一方面由荷电基团的存在和6’位上取代基的亲水性决定。另一方面，当葡糖胺二糖以盐的形式存在时，其水溶性也可以得到改善，所述盐例如，含有一种或多种碱金属阳离子和/或铵离子(与存在的例如二羟基膦酰氧基、羧酸膦酰基、羟基磺酰氧基和羟基磺酰烷基形成离子对)的盐。
应注意，任何烷基和酰基链或部分可以是直链的、支链的、饱和的、单或多不饱和的，具有插入其中的一个或多个杂原子(例如氮、氧、硫)，并且倘若对生物学活性基本上无不利影响，所述链可以被一种或多种取代基(例如羟基、氧代、酰氧基、烷氧基、氨基、硝基、氰基、卤素、巯基)取代。
按照本发明的葡糖胺二糖可以从含有存在于微生物(例如革兰氏阴性菌)中的脂多糖的脂质A部分的起始物质获得。这些脂多糖存在于例如这些微生物的包含表面结构的部分中和来源于此的脂多糖中。用作起始物质源的优选的革兰氏阴性菌是大肠杆菌和流感嗜血杆菌。然而，市售的LPS或脂质A也可以用作起始物质。
用碱处理进行3位和3’位的选择性脱酰化。选择碱处理条件使两个葡糖胺都3-羟基脱酰化。可以用氢氧化物、碳酸盐和磷酸盐(例如氢氧化钠或碳酸钾)进行碱处理。作为例子的有机碱性试剂是烷基胺，如二乙胺和三乙胺。碱处理通常在水或有机介质中进行。PH值通常在10-14(例如11-13)范围内，在实际条件下，PH是例如12.2。碱处理通常在室温和70℃之间(例如37℃)的温度下进行。时间长短取决于起始物质的类型。从微生物开始，时间期限在1小时和10天之间变化，例如8小时和5天，但通常在8-40小时范围内。从脂多糖或脂质A开始，时间期限可以是0.2-10小时，例如1-5小时。在实际中时间期限是约1.5到3小时。
当起始物质在6’位具有待除去的核心组分时，需对起始物质进行酸处理以除去所述核心组分。这一酸处理可以在以上所述碱处理之前或之后进行。该酸处理在PH1-5(优选地在PH2.5-4.5)范围内进行，通常在PH高于3和低于4.5(例如3.5)下进行。在PH1或PH1以下时，葡糖胺二糖脱磷酸化，形成单磷酸化形式。可以使用的酸是无机和有机酸，例如盐酸和冰乙酸。酸处理的时间长短为约30分钟到5小时，例如1-2小时。在酸处理期间，温度升高到约70-100℃，例如80℃-100℃，实际中为95℃。接着温度降低至室温。
按照本发明的葡糖胺二糖也可以从相应的脱一、单一、或二-磷酸化葡糖胺二聚体出发通过在2位和2’位两者上连接酰氧酰基、酰氨酰基和/或酰硫酰基而获得。
在按照本发明的这些葡糖胺二糖部分脱酰化和产物分离后，获得2位或2’位上具有支链酰基的葡糖胺二糖。
按照本发明的葡糖胺二糖可以用于药物组合物或药物中，并可用作抑制、刺激或诱导-氧化氮反应性中间体和细胞因子产生之耐受性(tolerisation)(取决于施用频率和采用的剂量)的免疫调节剂，用作抗肿瘤剂、用于例如T-细胞复活、用作疫苗组分、用作内毒素结合位点的竞争者和用作白细胞介素的调节物。由于极低的内毒性，这些二糖几乎或基本上无副作用。
按照本发明的二糖可经静脉注射、皮下注射、腹膜内注射、肌肉注射等途径全身性或局部性使用。剂量随动物或病人年龄、体重、待治疗的症状或疾病、所需的治疗效果、给药路线、治疗期等变化。按每公斤体重0.001到500mg剂量以一次或多次日剂量或持续释放形式给药，会获得满意的效果。
所述药物组合物可以包含药学上可接受的、例如含水或非水溶液、悬浮和乳液适于非口服给药的载体或稀释剂。含水溶液或悬浮可以包括蒸馏水或生理盐水。非水溶液可以包括丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)、醇类。该组合物可以含有其它添加剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂、分散剂等。
为了更加完整地理解本发明，提供供参考的下列实施例，这里提供这些实施例仅为了说明目的，无意用其限制本发明的范围。
实施例1在培养基(表1列出了其组成)中培养大肠杆菌I-1147(1991年10月3日以保藏号I-1147保藏在CNCM)。
表1大肠杆菌I-1147培养基(溶解在水中)的组成物质 量/L肌苷 0.200g柠檬酸单水合物 0.300g谷氨酸 1.300gNH4Cl 1.050gMgSO4·7H2O 1.110gKH2PO41.360g精氨酸 0.300g尿嘧啶 0.100gCaCl20.017gNaCl 2.000gOligometals(原液，1000×浓度)1mlL-亮氨酸 10.0gL-赖氨酸·HCl10.0gL-丝氨酸 10.0gL-蛋氨酸 10.0gL-缬氨酸 10.0gL-丙氨酸 10.0gL-天冬酰胺 10.0g葡萄糖(贮液500g/l) 5mlOligometals原液2.5g FeCl2·4H2O、0.25gCoCl2·6H2O、0.25g NaMoO4·7H2O、0.25gMnSO4·4H2O、0.25g ZnSO4·7H2O、0.25g NiSO4·7H2O、0.05g H3BO4、0.05g CuSO4，然后加入1.0L H2O，混合并加入1.1ml H2SO4(85％)。
用5N NaOH、5％氨或25％ HCl调节培养基的PH值。在通气和搅拌(500rpm)下于37℃和PH6.9下培养大肠杆菌。
接着用热处理(105℃ 2分钟)灭活发酵罐中的物质。
对发酵罐中的灭活的物质进行超滤(阈值为1000kD)，用0.6％NaCl水溶液洗涤滞留的细菌。用超滤浓缩洗涤的细菌悬液。得生物量264g干重。
将该生物量稀释成7.0g/l，并经加入345ml10.77N NaOH进行碱处理，然后在37℃下温育40小时(PH12.2)。
将碱抽提物进行第一次超滤(阈值1000kD)，对渗出液进行第二次超滤(10kD)。将第二次超滤的滞留物进行酸处理。
用7.0l水稀释滞留物，并用370ml冰乙酸酸化(最终PH3.52)。在搅拌下将混合物在120分钟内加热到95℃。接着将酸悬液冷却到25℃。经离心(4000×g，50分钟)分离沉淀。将离心沉淀再悬浮到水(3.7l)中，用异丙醇(4.3l)进行抽提，在25℃ F60分钟后加入252ml三乙胺(PH9.0)，继续搅拌24小时。
经离心(4000×g，25℃50分钟)回收上清液，用异丙醇(90％)再抽提离心沉淀两次。合并上清液并进行反相层析(Waters No.10001，制备型C18，125A)。
也可以将酸处理抽提物进行超滤，将滞留物(＞1000KD)浓缩并对5倍体积水透析。用9倍体积异丙醇稀释透析滞留物，并用三乙胺(TEA)将PH调至9。在搅拌下进行抽提2小时。
按以上描述除去上清液，用异丙醇再抽提沉淀。合并上清液并进行真空浓缩(40℃ 12托)，最后进行C18Prep Sep Pak(Waters No.10001)反相层析。
用两倍体积水稀释两种上清液的每一种，并与5mM磷酸四丁胺(TBAP)混合，上样到包含50g反相Prep Sep Pak(WatersNo.10001，制备型C18，125A)并用250ml CH3CN∶H2O 1∶1V/V)+5mM TBAP平衡过的柱上。用60％ CH3CN∶H2O 1∶1(V/V)+5mM TBAP和40％异丙醇∶H2O 9∶1(V/V)+5mMTBAP洗涤该柱。按照本发明的二糖洗脱到在30％ CH3CN∶H2O1∶1(V/V)+5mM TBAP和70％异丙醇∶H2O 9∶1(V/V)+5mM TBAP时的流份中。
用CH3CN∶H2O 1∶1(V/V)+25mM TBAP稀释在反相层析中获得的二糖，并上样到制备型HPLC柱(Millipore-WatersBondapak C18300A 15M，300mm×47mmφ)上。按照本发明的二糖流份在异丙醇∶H2O 9∶1(V/V)+25mM TBAP和33％CH3CN∶H2O 1∶1(V/V)+25mM TBAP时洗脱。这一流伤含有55mg按照本发明的二糖A。
二糖的脱盐按以下方法从一份二糖A流份除盐。通过连续加入5ml CHCl3-CH3OH2∶1(V/V)、5ml CH3CN和5ml CH3CN∶H2O 1∶1(V/V)平衡Sep Pak Vac C18Plus柱(二氧化硅C18，0.6ml，Waters No.20515)。在用3倍体积水稀释HPLC流份，总共得到6ml稀释样品后，将样品加到此柱上。然后用10ml CH3CN∶H2O(V/V)+10ml mM HCl，接着用10ml CH3CN除去TBAP。然后用5ml CHCl3-CH3OH以2∶1(V/V)洗出纯的二糖。
在35℃下真空(12托)蒸发干燥所得流份。将脱过盐的二糖A重新溶解到H2O∶TEA 1000∶1(V/V)中用于生物学和生物化学试验，或者溶解到氯仿∶甲醇2∶1(V/V)中用于FAB-MS分析。
钠盐形式的制备连续用50ml CH3CN和50ml CH3CN∶H2O 1∶1(V/V)平衡包含10g反相C18Prep Sep Pak的柱(Waters No.10001，制备型C18，125A)。
在用1倍体积水稀释后，将样品(HPLC流份)上到该柱上。吸附后，用100ml CH3CH∶H2O 1∶1(V/V)+5mM TBAP洗涤该柱。然后用50ml异丙醇∶H2O 9∶1(V/V)+5mM TBAP洗出二糖。
按以下方法纯化所形成的流份。用30ml 1M NaOH洗涤，然后水洗至中性，接着用30ml 1M HCl洗涤，再水洗至中性来连续处理含20mlQ-SepHarose fast flow(PHarmacia 17-0510-01)的柱。
将样品直接上到柱上。吸附后，用200ml H2O和100ml异丙醇∶H2O 9∶1(V/V)除去未吸附的物质，用100ml 0.9％ NaCl∶异丙醇1∶1(V/V)洗脱二糖。
按以下方法进行最后的纯化。连续用50ml CH3CN、50mlCHCl3-CH3OH 2∶1(V/V)、50ml CH3CN和50ml 50％CH3CN∶H2O 1∶1(V/V)平衡包含10g反相C18Prep Sep Pak的柱。用1倍体积水稀释后，将样品加到柱上。吸附后，连续用200ml H2O、200ml异丙醇∶水9∶1(V/V)和50ml CH3CN洗涤该柱。用50ml CHCl3-CH3OH 2∶1(V/V)洗脱二糖。在35℃下真空(12托)蒸发干燥该流份。
该钠盐在水中任意溶解(直到100mg/ml)。
实施例2在培养基(其组成在表2中列出)中培养流感嗜血杆菌(从National Collection of type Cultures)购得(ATCC 9795))。
表2流感嗜血杆菌主培养基的组成物质 量/lNaCl 2gNa2HPO42gCH3COONa 0.5g维生素B10.003g烟酸 0.003g70％乳酸钠溶液2ml60％乳酸铵溶液2ml肉羹 7.5g蛋白胨15g大豆蛋白胨1g胰化蛋白胨3g酵母膏7.5g葡萄糖 3g将氯高铁血红素(10mg/l)和NADH(4mg/l)补加进培养基。用5N NaOH或25％ HCl将PH调至7.0±0.3。在开始形成静止生长期后停止培养，经热处理(100℃ 100秒钟)使发酵罐中的物质失活。将失活的培养物离心，用0.6％ NaCl水溶液(约60g/l)稀释分离出来的生物量。加入10N NaOH(使NaOH终浓度达0.2N)进行碱处理。在连续搅拌下于37℃进行该处理5天。
在用冰乙酸酸化至PH3.5后直接将碱处理过的胞溶物进行酸处理。将混合物加热到95℃保持120分钟，接着冷却至室温。
将沉淀离心(10,000×g、30分钟4℃)，弃去上清液。
将沉淀重新悬浮在CH3CN∶H2O 1∶1(V/V)中，用TEA将PH调至9。离心(15,000×g，10分钟)后，将上清液调至5mM TBAP。将上清液上样到用50ml CH3CN∶H2O 1∶1(V/V)平衡过的Sep Pak Vak C18柱(10g二氧化硅C18、35ml、WatersNo.43345)上。用50ml异丙醇∶H2O 9∶1(V/V)+5mM TBAP洗脱含有本发明二糖B的部分。
将该部分蒸发(35℃，12托)浓缩至约2ml。离心(15,000×g，5分钟)该部分，将上清液上样到半制备型HPLC C18柱(Macherey-Nagel No.715806，250mm×10mmφ，Nucleosil300-7C18)上。含有本发明的二糖B的部分洗脱到包含28％CH3CN∶H2O 1∶1(V/V)+25mM TBAP和72％异丙醇∶H2O 9∶1(V/V)+25mM TBAP的流份中。
用类似实施例1的方法使二糖B脱盐。
实施例3在37℃下将大肠杆菌O111B4(Sigma，ProductNo.L3024)的脂多糖在0.2M NaOH中进行碱处理1.5小时，用1M磷酸中和该溶液。
经超滤(Millipore Ultrafree-MC，UFC3 LGC00，阈值10kD)浓缩400μl碱处理过的LPS溶液。
用400μl H2O稀释滞留物(＞10kD)，并用冰乙酸(调至0.2M冰乙酸)进行酸处理。将酸化的溶液加热到95℃保持120分钟。在冷却至25℃后，经离心(15,000×g，10分钟)沉降沉淀，弃去上清液。将沉淀溶解到20μl H2O∶TEA 1000∶1(V/V)中，把该溶液上样到分析型HPLC C18柱(Supelco No.58985，Supelcosil LC-18，3μm，150mm×4.6mmφ)上。本发明的二糖洗脱到包含42％ CH3CN∶H2O 1∶1(V/V)+5mM TBAP和58％异丙醇∶H2O 9∶1(V/V)+5mM TBAP的流份中。
实施例4在H2O∶TEA 1000∶1中制备大肠杆菌F-583(Sigma，Product No.L5399)和2mg/ml脂质A溶液。在37℃下将该溶液用0.2M NaOH进行碱处理2.5小时。用1M磷酸中和该溶液。
将中和过的溶液上样到分析型HPLC柱(Supelco No.58958，Supelcosil LC-18，3μm，150mm×4.6mmφ)上。本发明的二糖在流动相为42％ CH3CN∶H2O 1∶1(V/V)+5mM TBAP和58％异丙醇∶H2O 9∶1(V/V)+5mM TBAP时洗脱。
实施例5将2-氨基-2-脱氧-6-O-(2-氨基-2-脱氧-4-O-膦酰-β-D-吡喃葡萄糖基)-α-D-吡喃葡萄糖基磷酸二氢酯〔Holst et al.，Eur.J.Biochem.214(1993)695-701〕在甲醇中用甲醇钠(正好4.0mol当量)处理，然后用(R)-3-十二酰氧十四酸酐(2.2mol当量)〔由(R)-3-十二酰氧十四酸在无水二氯甲烷中与DCC(0.5mol当量)反应制备，参见Charon et al.，J.Chem.Soc.Perkin Trans.I.(1984)2291-2295〕处理。室温下12小时后，加入水(甲醇体积的2倍)，混合物用乙醚抽提(除支3-十二酰氧十四酸)。将水相浓缩，本发明的二糖C粗品进行反相HPLC。将产物溶解在H2O∶TEA1000∶1(V/V)中，加入磷酸四丁胺〔TBAP〕(达到浓度为5mM)。然后将这一溶液上样到制备型HPLC柱(Millipore-WatersBondapak C18300A 15M，300mm×47mmφ)上。用CH3CN∶H2O 1∶1(V/V)+25mM TBAP(溶剂A)和异丙醇∶H2O 9∶1(V/V)+25mM TBAP(溶剂B)梯度(50％A/50％B到0％A/100％B，1％/分钟)洗脱(流速80ml/分钟)二糖C。按以下方法脱盐。用水稀释含有二糖C的HPLC流份，然后上样到C18-Sep Pak Vac Plus柱(Waters)〔连续用CHCl3∶CH3OH2∶1(V/V)、CH3CN、CH3CN∶H2O 1∶1(V/V)平衡过的C18反相硅胶柱〕上。经连续用CH3CN∶H2O 1∶1(V/V)、10mMHCl和CH3CN洗涤除去TBAP。纯的二糖用CHCl3∶CH3OH 2∶1(V/V)洗脱。
实施例6用氢氧化钠水溶液(恰好1.0ml当量，该浓度使起始PH为12.5)处理实施例5中获得的含有二糖C的水相(纯化前)。室温下4小时后，将混合物调至PH6.5到7，并上样到制备型HPLC柱(Millipore-Waters Bondapak C18 300 15M，300mm×47mmφ)上。用CH3CN∶H2O 1∶1(V/V)+25mM TBAP(溶剂A)和异丙醇∶水9∶1(V/V)+25mM TBAP(溶剂B)梯度(75％A25％B到0％A100％B，1％/分钟)洗脱(流速80ml/分钟)二糖A和D。按实施例5中描述的使二糖C脱盐的方法使含有二糖A和D的HPLC流法份脱盐。
比较实施例(非本发明)在H2O∶三乙胺1000∶1(V/V)中制备大肠杆菌F-583(Sigma Product No.L5399)的10mg/ml脂质A溶液，接着在37℃下用0.2M NaOH进行碱处理20分钟。这一时间长度仅对3-O脱酰化脂质A足够(Myers et al.，Cellular and MolecularAspects of Endotoxin Reactions，Pages 145-156〔1990〕、ElsevierScience Publishers)。
用正磷酸中和该溶液。为进行生物学试验，将其稀释成0.1％TEA/0.9％NaCl的溶液，不进行进一步的纯化。
为进行FAB-MS分析，用反相HPLC(Supelco No.58985，Supelcosil LC18，3μm，15mm×4.6mmφ)纯化这一碱处理过的脂质A的样品。在实施例1描述的条件下使在18％ CH3CN∶H2O1∶1(V/V)+5mM TBAP和82％异丙醇∶H2O 9∶1(V/V)+5mM TBAP下洗脱的主要峰脱盐。FAB-MS分析给出1570.1质量单位的分子离子峰(计算值为1569.1质量单位)。
本发明二糖的理化特征将实施例1和2获得的二糖A和B进行理化性质分析。
在酸水解(4M HCl，16小时，100℃，氩氛围)和异硫氰酸苯酯衍生后，接着用HPLC定量分析(参见Anumula，K.R.et al.，Analytical.Biochemistry，Volume 179，Pages 113-122〔1992〕)，由此来测定葡糖胺。
在酸水解(4M HCl，4小时，100℃)和甲醇存在下用BF3甲基化后，用气相色谱(OV-1柱，Hewlett Packard)(参见Miller，L.，Gas-Liquid ChromatograpHy of Cellular Fatty Acidsas a Bacterial Identification Acid，Gas ChromatograpHyApplication Note，Pages 228-237〔1984〕)定量测定，由此来测定总脂肪酸。
在用NaOCH3处理后经气相色谱来测定酯键连接的脂肪酸(参见Rietschel E.T.et al.，European Journal of Biochemistry，Volume 28，Page 166-173〔1972〕)。
按Ames的方法(参见Ames，B.N.，Methods in Enzymology，Volume 8，Page 115-118〔1966〕)测定磷酸(pHospHate)。
使用Karkhanis，Y.D.等的方法(Analytical Biochemistry，Volume 8，pages 595-601〔1978〕)测定3-脱氧-D-甘露-辛酮糖酸(KDO)。
二糖A溶液含有2.1μmol/ml磷酸、1.9μmol/ml葡糖胺、1.0μmol/ml C120脂肪酸和2.2μmol/ml 3OH-C140脂肪酸。在释放酯键连接的脂肪酸残基后仅测得C120脂肪酸，表明3OH-C140脂肪酸残基靠酰胺键连接。未测得KDO(＜1mol/10mol二糖A)。
因此，该二糖每摩尔含有2mol磷酸、2mol葡糖胺、2mol3OH-C140脂肪酸和1mol C120脂肪酸。
快原子轰击质谱(FAB-MS)是在CHCl3∶CH3OH 1∶1(V/V)中样品的负离子质谱(negative mode)(浓度1mg/ml)。设定在Vacc 8KV的VG ZAB-2SE质谱仪用来产生30KV的能谱和1μA的发射电流。该质谱仪用碘化铯校准。
图1中给出了FAB-MS谱图。二糖A显示出在1133.55质量单位的分子峰(计算的质量为1133.3)。其它峰说明在分析期间产物裂解，1053.5峰表示断裂掉磷酸酯基团，951.3峰表示断裂掉C12脂肪酸。
图2中给出了二糖B的FAB-MS谱图，它显示出在1161.8质量单位的分子峰(计算值为1161.3)。在1183.8质量单位的峰表示添加了钠，在951.6质量单位的峰表示断裂掉C14脂肪酸，在973.6质量单位的峰代表951.6峰与钠离子的片段。
图3中给出了二糖A(在D2O中的钠盐)的1H-NMR谱图(Bruker 360MHz)，图4和5(放大)中给出了其13C-NMR谱图。
下列β-D-葡糖胺-(1→6)-α-D-葡糖胺二糖的结构式在下面列出*二糖A(2-脱氧-6-O-〔2-脱氧-2-〔(R)-3-十二酰氧十四酰氨基〕-4-O-膦酰-β-D-吡喃葡萄糖基〕-2-〔(R)-3-羟十四酰氨基〕-α-D-吡喃葡萄糖基磷酸二氢酯)；*二糖B(2-脱氧-6-O-〔2-脱氧-2-〔(R)-3-十四酰氧十四酰氨基〕-4-O-膦酰-β-D-吡喃葡萄糖基〕-2-〔(R)-3-羟十四酰氨基〕-α-D-吡喃葡萄糖基磷酸二氢酯)；*二糖C(2-脱氧-6-O-〔2-脱氧-2-〔(R)-3-十二酰氧十四酰氨基〕-4-O-膦酰-β-D-吡喃葡萄糖基〕-2-〔(R)-3-十二酰氧十四酰氨基〕-α-D-吡喃葡萄糖基磷酸二氢酯)；*二糖D(2-脱氧-6-O-〔2-脱氧-2-〔(R)-3-羟十四酰氨基〕-4-O-膦酰-β-D-吡喃葡萄糖基〕-2-〔(R)-3-十二酰氧十四酰氨基〕-α-D-吡喃葡萄糖基磷酸二氢酯)。
本发明二糖的内毒性和生物学活性测定二糖A(实施例1)和二糖B(实施例2)的内毒性和生物学活性，并与来源于大肠杆菌O111B4的脂多糖(Sigma，Product No.L 3024)、脂质A(Sigma，Product No.L5399，在实施例4中用作起始物质)和来源于大肠杆菌F583的脂质A的3-O-脱酰化脂质A(如比较实施例中制备的，但没有经HPLC纯化)的内毒性和生物学活性比较。
1.内毒性在鲎阿米巴样细胞溶胞产物(LAL)试验中测定内毒性。这一试验基于观察内毒素诱导大眼水蚤鲎(Limulus polypHemus)的血淋巴凝结。
在胶凝化试验中，将待试化合物的系列稀释样品与LAL 1∶1(V/V)(Haemachem Inc.，敏感性LAL 0.06内毒素单位/ml)混合。在37℃下将该混合物温育1小时。经测定在405nm的光密度来监测凝胶形成。通过转换反应微板测定形成凝胶的最后稀释样品。经与脂多糖基准物的稀释样品比较测定样品中的内毒素活性(1内毒素单位＝0.1ng LPS)。
也在生色试验中测定内毒性，在这一试验中，用生色剂(Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA；Bio Whittaker Kit No.50-650U)测定LAL中蛋白酶被LPS的激活作用。在405nm测定颜色形成(pNA(对硝基苯胺)的释放)。
事先将样品在37℃温育10分钟，接着加入含生色剂的LAL。测定在405nm光密度达到0.2所需时间。与从LPS基准物获得的标准曲线比较计算出内毒素活性。在表3中结果表示为ng LPS/ng产物。表3LAL中的内毒活性(ng/ng)试验类型 大肠杆菌 脂质A 3-O-脱酰化 二糖A 二糖B 单磷酰LPS*)脂质A 二糖A胶凝 0.9±0.4 0.6±0.31.0±0.10.003±0.0020.004±0.0020.0031±0.0013(n＝6) (n＝3) (n＝2) (n＝12) (n＝7) (n＝10)生色剂0.70 0.7±0.31.70±0.95 0.0014±0.0013 0.0008±0.0006 0.0016±0.0009(n＝1) (n＝3) (n＝3) (n＝9) (n＝7) (n＝10)LAL中LPS内毒活性＝1ng/ng，实验数据在0.3-3ng/ng范围内。
表3说明，按照本发明的二糖A和B显示出最低的内毒性，特别是相对于US-A-4,912,094的3-O-脱酰化脂质A来说。
2.在C57BL/6小鼠巨噬细胞中诱导的体外生物学活性从6周龄雄性C57 BL/6小鼠的髋部、股骨和胫骨收集骨髓。在Dulbecco改进培养基中的骨髓悬液匀化和离心后，将离心沉淀重新悬浮到Dulbecco改进培养基中，以4×105细胞/ml浓度在补加了30％L-929成纤维细胞上清液(集落刺激因子1〔CSF-1〕的通用来源)和20％马血清的相同培养基中培养所述细胞。
7天后，收集成熟的巨噬细胞，并以7×106细胞/ml浓度再悬浮到含有5％胎牛血清的Dulbecco改进培养基中。将这一细胞悬液与用相同培养基稀释的样品以1∶1混合，用于以70000细胞/孔在微板上进行的生物学试验(在37℃下培养22小时，100％湿度和8％ CO2)。
一氧化氮(NO)的产生作为对细菌感染，特别是对LPS的反应，巨噬细胞产生一氧化氮(NO)。NO似乎具有细胞静止和细胞毒性质。NO非常活泼，迅速经氧化转化成亚硝酸盐和硝酸盐。
用Griess试验(加入1∶1(V/V)N-(1-萘基)乙二胺氢氯化物〔水中1g/l〕和对氨基苯磺酰胺〔5％ H3BO4中10g/l〕)测定亚硝酸盐的形成。用与NaNO2基准物比较计算活化的巨噬细胞上清液中的亚硝酸盐浓度。
结果在表4中给出。
表4由LPS和衍生产物刺激的巨噬细胞上清液中NO的产生量产物最大活性 最小活性 活性 NO活性50％ 50％ 分析次数*)*)*)以NO2-/表示**LPS大肠杆菌 1000.00040.01 7 n＝6脂质A 50 0.005 0.07 5 n＝73-O-脱酰化脂质A 50 0.005 0.16 5 n＝3二糖A 50 0.016 0.16 5 n＝6二糖B 16 0.00050.05 5 n＝1单磷酰基二糖A 50 5 8 4 n＝1*以μg/ml表示的产物浓度，相应于诱导的NO活性，**从系列稀释曲线外推的以NO2-/ml表示的浓度。
LPS诱导最大量的NO产生，脂质A、3-O-脱酰化脂质A、二糖A和二糖B诱导相同数量级的NO产生。
因此，二糖A和B在巨噬细胞中诱导NO产生的能力与脂质A和3-O-脱酰化脂质A一样强。
白细胞介素-1α(IL-1α)的产生当用LPS刺激时，包括巨噬细胞在内的许多细胞产生IL-1α。报道的一些IL-1α活性包括激活T细胞、诱导T细胞中IL-2受体表达和细胞因子基因表达、辅助刺激B细胞增殖和Ig分泌、增强NK-介导的细胞毒性的Il-2和IFN诱导激活、诱导急相蛋白合成和发热诱导。
用ELISA试验(Kit GENZYME，Intertest-1α)测定巨噬细胞上清液中IL-1α的浓度。
结果概括在表5中。
表5由LPS和衍生产物刺激的巨噬细胞上清液中IL-1α的产生量产物 浓度 检测的最小活性试验的最高浓度 500μg/ml浓度 IL-1αIL-1α浓度IL-1α[μg/ml] [pg/ml] [pg/ml] [μg/ml][pg/ml]空白＝TEA 0.1％ 500 ＜15*)＜15*)＜15*)LPS大肠杆菌 1600 295±129 170**)1.56 18±4脂质A 500 53±3553±35 50 17±83-O-脱酰化脂质A 500 56±1956±19 16021±6二糖A 500 75±4575±45 16 19±11*)试验检测极限为约15pg/ml。
**)从系列稀释曲线外推的IL-1α浓度。
测定IL-1α的最大产生量是不可能的，因为在使用最高浓度时，其产生量仍在增加。
在浓度为500μg/ml时，脂质A、3-O-脱酰化脂质A和二糖A对IL-1α产生的诱导无明显不同。LPS诱导IL-1α产生能力更强。
二糖A诱导IL-1α产生的能力至少与脂质A和3-O-脱酰化脂质A相当。
白细胞介素-6(IL-6)的产生激活的单核细胞或巨噬细胞、T和B淋巴细胞产生IL-6。除别的性质外，IL-6还诱导某些类型细胞的增殖、某些黑素瘤细胞系的生长抑制、B-淋巴细胞的分化和IgG分泌的刺激、细胞毒T细胞的分化和弱的抗病毒活性。
用ELISA试验(Kit ENDOGEN，EM-IL-6)测定巨噬细胞上清液中的IL-6浓度。
结果概括在表6中。
表6由LPS和衍生产物否刺激的巨噬细胞上清液中IL-6的产生量产物 最大活性最小活性 50％活性浓度IL-6浓度 IL-6 浓度 IL-6[μg/ml][pg/ml] [μg/ml] [pg/ml] [μg/ml] [pg/ml]空白＝TEA 0.1％500 1150±80 0 710±240 ------LPS大肠杆菌 25 13860±2750 0.006 2400±960 0.36950脂质A160 to 0.016*)3000 to 2200*)0.016 2460±50 ND**)ND**)3-O脱酰化脂质A160 to 0.016*)2850 to 2200*)0.016 2410±160 ND**)ND**)二糖A50 5700±2650 0.016 850±350 1 2850*)在试验范围内诱导活性相对恒定，且不给出最大值。
**)未测得由试验产物最低浓度(0.016)诱导的活性仍然高于50％活性。
二糖A对IL-6分泌的刺激作用明显低于LPS。然后，二糖A在巨噬细胞中诱导IL-6产生能力较脂质A和3-O-脱酰化脂质A更强。
肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的产生TNF-α主要由巨噬细胞和单核细胞经LPS刺激产生。由TNF-α诱导的活性特别是抗病毒活性、某些细胞类型的细胞裂解和细胞静止(cytostasis)、某些细胞系的生长、抗原表达(例如主要组织相容性复合物I和II类)、甲基胆蒽诱导的肉瘤的坏死、多形核白细胞(PMN)的激活、破骨细胞激活和骨吸收。TNF-α也是毒性休克和脓毒病的主要介导物。
用ELISA试验(Kit GENZYME Factor-test m TNF-α)测定巨噬细胞上清液中TNF-α的浓度。
结果列于表7中。
表7由LPS和衍生产物刺激的巨噬细胞上清液中TNF-α的产生量产物浓度检测的最小活性试验的最高浓度 500μg/ml浓度 TNF-αTNF-α 浓度TNF α[μg/ml] [pg/ml] [pg/ml][μg/ml][pg/ml]空白＝TEA 0.1％ 500138±9138±9 0 ＜100*)LPS大肠杆菌100 to 6.25257 to 284130***)0.006 175±55脂质A 500223±64 223±64 0.016 118±93-O-脱酰化脂质A 500311±72 311±72 0.016 155±6二糖A 500530±139 530±1390.16 159±43
*)试验检测极限在100pg/ml左右。
**)LPS浓度在100和6.25μg/ml之间时，TNF-α的浓度相对恒定。
***)从系列稀释曲线外推的TNF-α浓度。
测定TNF-α的最大产生量是不可能的，因为在最高的试验浓度时产生量仍在增加。
与其它试验相反，LPS诱导的TNF-α产生量比二糖A的要低。二糖A诱导的TNF-α的量等于或高于脂质A或3-O-脱酰化类酯A诱导的量。
前列腺素E2(PGE2)的产生PGE1和PGE2是花生四烯酸的主要代谢产物，所述花生四稀酸是由LPS、TNF-α或IL-1刺激经巨噬细胞合成的。PGE类表现出对T和B淋巴细胞的免疫调节活性。它似乎诱导Th2的刺激、Th1T淋巴细胞亚群的抑制和免疫球蛋白同种型的转化。
用RIA试验(Kit PAESEL+LOREI，36-104-6001Prostaglandin E2 3H-RIA Kit)测定巨噬细胞上清液中PGE2浓度。
结果概括在表8中。
表8由LPS和衍生产物刺激的巨噬细胞上清液中PGE2的产生量产物 最高浓度诱导活性最低浓度诱导活性浓度PGE2浓度PGE2[μg/ml][pg/ml] [μg/ml][pg/ml]空白＝TEA 0.1％ 500 ＜80*)---＜80*)LPS大肠杆菌16001120±1356.25 153±29脂质A 500＜80*)---＜80*)3-O-脱酰化脂质A 500240±25 500240±25二糖A 500540±65 16 80±41*试验检测极限在80pg/ml左右。
测定PGE2的最大产生量是不可能的，因为在最高使用浓度时，产量量仍在增加。由二糖A引起的对PGE2产生的刺激作用明显低于LPS。然而二糖A比脂质A和3-O-脱酰化类酯A活性要高。脂质A不诱导PGE2产生，3-O-脱酰化脂质A仅在最高使用浓度时诱导PGE2产生。
结论本发明的二糖是体外活性的，且诱导NO、IL-1α、IL-6、TNF-α和PGE2产生。本发明的二糖与脂质A和3-O-脱酰化脂质A活性一样，甚至比后两者活性更强，但用LAL试验测定时表现出实质性降低的内毒性。脂质A和3-O-脱酰化脂质A的较低的活性可能归因于纯度不同。二糖A和B由HPLC纯化、脂质A是市售的生物制剂(Sigma L-5399)、3-O-脱酰化脂质A是按照US-A-4,912,054的方法从市售脂质A制剂出发制法备的。具有较高活性的唯一产物是LPS，它一般诱导较高的应答，且诱导显著信号仅需要较低的浓度。
3.体内生物学活性以对BDIX大鼠体内诱生的腹膜癌的抗肿瘤活性来研究二糖A的体内生物学活性。将按Martin的方法(Martin，F.et al.，International Journal of Cancer，Volume 32，Pages 623-627〔1983〕)获得的Pro b细胞腹膜内注射到大鼠中(每只大鼠106细胞)。10天后，在肠系膜中出现许多乳色斑状固体结，并逐渐侵入腹膜腔(参见Lagadec，P.et al.，Invasion and Metastasis，Volume 7，pages 83-95〔1987〕)。4-5周后出现血性腹水，并且所有的大鼠在8-12周内死亡。
注射肿瘤Pro b细胞后14天开始免疫治疗，该治疗由腹膜内注射二糖A构成，按每公斤体重0.1、0.3和0.8mg给药。二糖A溶解在0.9％ NaCl和0.1％三乙胺水溶液中。大鼠接受5次注射，每3.5天一次。用水溶液注射对照组。两组均包括10只大鼠。
注射肿瘤细胞6周后进行尸检。粗略估计腹膜癌发病程度，并按癌病发生程度增加的顺序将大鼠分类。
按结大小分类的类别如下0类无可见肿瘤结；1类少数几个小于0.2cm大小的结；2类大小达0.5cm的数不清的结，3类大小达1cm的肿瘤；4类大小达几cm的肿瘤完全侵入肿瘤腔。
结果列于表9中。
表9二糖A对腹膜癌的体内抗肿瘤活性二糖A 患有以下类癌 产物的腹水体积 产物的(剂量) 病的大鼠的数目 作用 〔ml/大鼠〕作用0 1 2 3 4(1) 范围 平均(2)0mg/kg 0 1 1 2 6 0-64 40±240.1mg/kg0 2 0 4 4NS0-18 7±7p＜0.0010.3mg/kg2 3 2 2 1p＜0.01 0-20 2±6p＜0.0010.8mg/kg1 6 1 1 1p＜0.01 0-2 0±1p＜0.001经Kruskal-Wallis试验(1)或(2)用方差分析计算抗肿瘤活性的统计显著性。
二糖A明显具有剂量依赖性抗肿瘤作用。
4.急性毒性将二糖A注射到雄性和雌性NMRI小鼠(6-7周龄)的尾静脉中，剂量高达100mg/kg体重时未导致任何死亡。
实施例7起始物质是得自铜绿色假单胞菌的脂多糖(Sigma，ProductNo.L7018)。脂质A的结构是已经已知的(参见Kulshin et al.，Eur.J.Biochem.198(1991)697-704)。与得自大肠杆菌的脂质A不同，占优势的种类在二葡糖胺二磷酸酯骨架的两个氨基上都具有酰氧酰基残基。此外在3’位上有一个3-羟基癸酸，但在一小部分中仅在3位上存在相同的脂肪酰基残基。
除去3’位上的酯肪酰基残基会导致产生二糖C的类似物。进一步水解将导致丧失2位或2’位酰氧酰基上的酯化的脂肪酰基残基。这些结果与二糖C和D类似。
将得自铜绿色假单胞菌的脂多糖(Sigma L7018)以5mg/ml溶解在0.1M乙酸钠(PH4.0)中，加热120分钟(100℃下)。冷却后，加入0.5体积异丙醇，接着加入磷酸四丁胺(TBAP)(至2mM终浓度)。加入三乙胺至PH9.0(大约值，pH试纸测定)。将该混合物上样到带循环(10支管)的C18Sep-Pak(Waters)柱上。用10ml乙腈∶H2O 1∶1(V/V)中5mM TBAP溶液洗涤该Sep-Pak柱，接着用10ml乙腈洗涤。用4ml CHCl3∶CH3OH2∶1(V/V)洗脱吸附的物质。
用HPLC纯化两个主要的峰PsA1和PsA2(图6)，并分析脂肪酸。脂肪酸的组成相应于Kulshin等描述的分子(下表)。PsA1比PsA2的疏水性差，因其从柱上洗脱的保留时间(Rt)较短。这相应于具有2个2OH-C120酸残基的分子。PsA2具有2OH-C120和C120两者。峰鉴定的脂肪酸PsA1 3OH-C1002OH-C1203OH-C120PsA2 3OH-C100C1202OH-C1203OH-C120经旋转蒸发除去溶剂，将残渣重新溶解到0.2％TEA水溶液中。
向铜绿色假单胞菌脂质A溶液中加入NaOH(达到0.2M浓度)，在室温下温育该溶液60分钟。然后用正磷酸(8.5％)中和该溶液。然后将其上样到反相HPLC系统(具有Supelco LC18的HP1050、3μm反相柱，带前置柱)上，该HPLC系统用75％溶剂A(5mM TBAP/乙腈∶水1∶1(V/V))和25％溶剂B(5mMTBAP/异丙醇∶水9∶1(V/V))平衡过，以每分钟增加2％溶剂B最后达100％ B的方式进行梯度洗脱收集主要峰(参见图7)。用2倍体积的水稀释它们，上样到用溶剂A平衡过的C18 Sep-Pak柱上。用10ml 0.45％ NaCl/异丙醇∶H2O 1∶3(V/V)、10ml水和10ml乙腈洗涤Sep-Pak柱。用4ml CHC3∶CH3OH 2∶1(V/V)洗脱吸附的物质，在氮气下除去溶剂。将该组分再溶解到100μl水中。
在用4M HCl 100℃下水解4小时后，经气相色谱分析该组分的脂肪酰基含量。按Miller的方法(Miller，L.GasChromatograpHy application note 228-37〔Hew lett Packard〕)将释放的脂肪酸转化成甲酯。以标准脂肪酸甲酯(Supelco)为内标物，在具有熔凝硅胶柱的Hewlett-Packard 5890。气相色谱仪(Supelco 2-4026)上分析。
脂质A抽提物水解后，在反相HPLC上观察到许多峰，从HPLC收集主要峰(PsAOH 1、2、4和6)。每一流份中鉴定的脂肪酸示于下表峰 鉴定的脂肪酸PsAOH1 3OH-C1202OH-C120PsAOH2 3OH-C1202OH-C120PsAOH4 3OH-C120C120PsAOH6 3OH-C1202OH-C120C120
下列这些二糖的结构式在下面给出*PsAOH12-脱氧-6-O-〔2-脱氧-2-〔(R)-3-〔(S)-2-羟基十二酰氧〕-十二酰氨基〕-4-O-膦酰-β-D-吡喃葡萄糖基〕-2-〔(R)-3-羟基十二酰氨基〕-α-D-吡喃葡萄糖基磷酸二氢酯；*PsAOH22-脱氧-6-O-〔2-脱氧-2-〔(R)-3-羟基-十二酰氨基〕-4-O-膦酰-β-D-吡喃葡萄糖基〕-2-〔(R)-3-〔(S)-2-羟基十二酰氧〕-十二酰氨基〕-α-D-吡喃葡萄糖基磷酸二氢酯；*PsAOH42-脱氧-6-O-〔2-脱氧-2-〔(R)-3-十二酰氧十二酰氨基〕-4-O-膦酰-β-D-吡喃葡萄糖基〕-2-〔(R)-3-羟基十二酰氨基〕-α-D-吡喃葡萄糖基磷酸二氢酯；*PsAOH62-脱氧-6-O-〔2-脱氧-2-〔(R)3-十二酰氨基〕-4-O-膦酰-β-D-吡喃葡萄糖基〕-2-〔(R)-3-〔(S)-2-羟基十二酰氧〕-十二酰氨基〕-α-D-吡喃葡萄糖基磷酸二氢酯；二糖 E(PsAOH1) 二糖 F(PsAOH2) 二糖G(PsAHO4) 二糖H(PsAOH6)
也以负离子质谱用电子喷射质谱(ES-MS)分析各组分。VG Biotech BIO-Q仪器与三联(triple)四极分析仪一起使用。2到4μl各样品稀释到10μl乙腈∶水∶25％氨溶液50∶50∶1(V/V)中。然后直接将10μl注射到质谱仪样品池中。乙腈∶水∶25％氨溶液50∶50∶1(V/V)用作洗脱剂(7μl/min)。为了分析主要离子片段，在第二四极中使用氩作为碰撞气体进行来自第一四级的母离子的碰撞活化分解。在第三四极中检测子离子。
计算的每一个峰的质量和由ES-MS实测的质量给出如下峰 计算的质量实测的质量PsAOH11093.5 1093.4PsAOH21093.5 1093.1PsAOH41077.5 1077.0PsAOH61275.8 1275.7在每一种情况下都有非常好的对应关系。
在PsAOH1和PsAOH2的情况下，其质量是相同的。这表明它们代表分子的两种异构体，在某种质谱分析条件下脂质A的片段是已知的(Kulshin，1991；和Cotter et al.，Biomed.Encl.MassSpectrom.14(1987)，591-598)。产生了代表多102质量单位的分子非还原部分的离子。这样，用两个MS串联，主要离子可以在第一MS中裂解，子离子可以在第二MS中检测。这消除了观察到的第二离子是污染物的可能性。它们必定是来源于原离子的裂解。每一组分的预期的子离子的质量和ES-MS上实测到的质量在以下给出。
计算的片段 实测的片峰质量段质量PsAOH1558.5或756.8756.1PsAOH2558.5或756.8557.7PsAOH4558.5或740.8739.9PsAOH6558.5或740.8740.1这些实测值明显鉴别了二糖E、F、G和H的结构。
为了内部比较，也用ES-MS分析了二糖A。计算的质量是768.9，片段的实测质量是768。
按前文描述的方法经在鼠腹膜巨噬细胞中刺激亚硝酸盐的产生来试验各组分的生物学活性。
参照二糖A的量，从在HPLC上的吸附来测定原料溶液中各类似物的量。各组分表现出与二糖A相同数量级的活性(图8)。有两上脱氧酰基且无其它脂肪酰基残基的二糖H活性最高。酰氧酰基的位置(2位还是2’位)对活性仅有小的影响。
为了消除活性是由其它物质(例如LPS)污染样品产生的可能性，在反相HPLC上再次纯化二糖E、F、G和H，并用与含有物质峰的流份相同的方法收集和处理紧靠峰的峰前和峰后HPLC基线区。试验峰流份和基线流份的活性。含有二糖E、F、G和H的峰表现出与第一次试验中观察到的类似的活性。代表紧靠脂质A类似物峰的峰前和峰后HPLC基线区的空白样品没有活性。因此，对亚硝酸盐产生的刺激作用与脂质A类似物特异性相关。
采用生色剂LAL试验(参见上文)测定二糖E、F和G的内毒性。但使用0.1mg/ml而不使用1mg/ml牛血清白蛋白。在两个系列的试验中获得结果，该结果示于下面。样品 LAL中的内毒性(mg/mg)大肠杆菌LPS 0.58±0.14大肠杆菌脂质A 0.32±0.06二糖E 0.000005±0.000002二糖F 0.000025±0.000026二糖G 0.00006 ±0.00003二糖A 0.000003±0.00000权利要求
1.具有以下通式的β(1→6)葡糖胺二糖， 共中R1是羟基、二羟膦酰氧基或其荷电形式、(C1-C5)酰氧基、(C1-C5)烷氧基、或者基团X；R2和R2’各自为酰基或基团Y，其条件是至少R2或R2’是基团Y；R3和R3’各自为氢原子、(C1-C3)烷基或(C1-C3)酰基；R4是氢原子、(C1-C3)烷基或(C1-C3)酰基；R4’是氢原子、(C1-C3)酰基、(C1-C5)烷基、二甲氧膦酰基、或者膦酰基或其荷电形式；且R6’是氢原子、羟基、二羟膦酰氧基、羟磺酰氧基、它们的荷电形式、或者基团Z；其中所述的基团X选自由以下基团组成的组羧基(C1-C5)烷氧基、-O-CH-〔(CH2)mCOOH〕〔(CH2)nCOOH〕基(其中m＝0-5，n＝0-5)、膦酰(C1-C5)烷基、二甲氧膦酰氧基、羟磺酰氧基、羟磺酰(C1-C5)烷基和基团X的荷电形式；其中所述的基团Y选自由下列基团组成的组酰氧酰基、酰氨酰基、酰硫酰基，(C1-C24)烷氧酰基、(C1-C24)烷氨酰基、(C1-C24)烷硫酰基；且其中所述的基团Z选自由下列基团组成的组(C1-C24)烷氧基、(C1-C24)酰氧基、3-脱氧-D-甘露-2-辛酮糖酸(KDO)、(KDO)n(其中n＝1-10)、多糖侧链(例如来源于天然脂多糖的侧链)、核心组分(例如来源于天然脂多糖的组分)、和氨基-(C1-C8)烷基-羧基。
2.按照权利要求1的二糖，其中所述的基团Y包括3-酰氧酰基、3-酰氨酰基和3-酰硫酰基。
3.按照权利要求1或2的二糖，其中所述的基团Y是酰氧酰基。
4.按照权利要求1-3之一的二糖，其中的酰基是脂肪酸残基、3-羟基脂肪酸残基、3-氧代脂肪酸残基。
5.按照权利要求1-4之一的二糖，其中作为基团Y的酰氧酰基、酰氨酰基和酰硫酰基包含选自脂肪酸残基、3-羟基脂肪酸残基、3-氧代-脂肪酸残基的酰基部分。
6.按照权利要求3-5之一的二糖，其中的基团Y是一种酰氧酰基，该酰氧酰基是在3-羟基位经酯键与(C1-C20)酰基(优选地是(C10-C18)脂肪酸酰基)连接的N-连3-羟基(C4-C24)酰基(优选地是(C8-C18)脂肪酸酰基)。
7.按照权利要求6的二糖，其中的酰氧酰基是在3-羟基位经酯键与C12脂肪酸连接的N-连3-羟基C14脂肪酸酰基。
8.按照权利要求6的二糖，其中的酰氧酰基是在3-羟基位经酯键与C14脂肪酸连接的N-连3-羟基C14脂肪酸酰基。
9.按照权利要求1-8之一的二糖，其中的R2’是基团Y。
10.按照权利要求1-8之一的二糖，其中的R2是其团Y。
11.按照权利要求1-10之一的二糖，其中的3-羟基脂肪酸残基是3-羟基(C4-C24)脂肪酸，优选地是(C10-C18)脂肪酸。
12.按照权利要求11的二糖，其中的3-羟基脂肪酸残基是3-羟基C14脂肪酸。
13.按照权利要求11或12的二糖，其中的R2是3-羟基脂肪酸残基。
14.按照权利要求11或12的二糖，其中的R2’是3-羟基脂肪酸残基。
15.按照权利要求1-10之一的二糖，其中R2和R2’两者都是基团Y。
16.按照权利要求15的二糖，其中的R2和R2’两者都是一种酰氧酰基，该酰氧酰基包含在3-羟基位经酯键与(C1-C20)酰基(优选地是(C10-C18)脂肪酸酰基)连接的N-连3-羟基(C4-C24)酰基(优选地是(C8-C18)脂肪酸酰基)。
17.按照权利要求16的二糖，其中的R2是在3-羟基位经酯键与C16脂肪酸连接的N-连3-羟基C14脂肪酸酰基，且其中的R2’是在3-羟基位经酯键与C12脂肪酸连接的N-连3-羟基C14脂肪酸酰基。
18.按照权利要求1-17之一的二糖，其中的R1是二羟膦酰氧基。
19.按照权利要求1-18之一的二糖，其中的R4是氢原子。
20.按照权利要求1-19之一的二糖，其中的R1是α构型。
21.按照权利要求1-20之一的二糖，其中的R3是氢原子。
22.按照权利要求1-21之一的二糖，其中的R3’是氢原子。
23.按照权利要求1-22之一的二糖，其中的R6’是羟基。
24.按照权利要求1-23之一的二糖，其中的R4’是膦酰基。
25.按照权利要求1-24之一的二糖，其中的二糖是包含一种或多种阳离子的以盐的形式存在的二糖。
26.按照权利要求25的二糖，其中的阳离子是碱金属离子。
27.制备按照权利要求1-26之一的二糖的方法，该方法包括以下步骤i)提供一种含有包含脂多糖的微生物的类脂A部分的起始物质；和ii)对起始物质进行碱处理，以使类脂A部分在3位和3’位脱酰化。
28.按照权利要求27的方法，其中的起始物质选自包含脂多糖的微生物、革兰氏阴性细菌、这些微生物和革兰氏阴性细菌的包含表面结构的组分、或这些微生物和革兰氏阴性细菌的脂多糖。
29.按照权利要求27或28的方法，其中的起始物质是革兰氏阴性细菌的类脂A。
30.按照权利要求27-29的方法，其中的碱处理在酸处理除去核心部分和多糖侧链之前或之后进行。
31.含有活性成份和药学上可接受的载体或稀释剂的药物组合物，所说的活性成分是按照权利要求1-26之一的二糖，和/或权利要求27-30之一中获得的二糖。
32.按照权利要求1-26之一的和/或权利要求27-30之一中获得的二糖用作免疫调节剂和/或抗肿瘤剂。
33.按照权利要求1-26之一的和/或权利要求27-30之一中获得的二糖用作疫苗组分。
全文摘要
本发明涉及具有通式(I)的β(1→6)葡糖胺二糖类、制备这些二糖的方法，以这些二糖为活性成分的药物组合物、以及这些二糖在用作免疫调节剂、抗肿瘤剂和疫苗组分上的用途，所述方法包括以下步骤i)提供一种含有含脂多糖微生物的类脂A部分的起始物质；ii)对起始物质进行碱处理，以使类脂A部分在3位和3′位O-脱酰化。
文档编号A61P37/04GK1137799SQ94194201
公开日1996年12月11日 申请日期1994年11月17日 优先权日1993年11月17日
发明者J·G·戴维斯, J·鲍尔, P·赫特, A·斯库瑟斯 申请人:实验室奥姆公司, 德国奥姆药物有限公司