化学修饰电极及其制备方法和电化学传感器及其应用与流程

本发明涉及化学修饰电极和电化学传感器技术领域。

背景技术：

电化学研究中，电极材料的性能决定着电化学反应的进行。电化学反应一般在电极表面附近进行，故电极表面性能如何是更重要的因素，通过采用共价键和、吸附、聚合等方法有目的地将具有功能性的物质引入电极表面，从而能够制备得到具有新的特定功能的化学修饰电极。

滴涂法是制备化学修饰电极的一种常用方法，是将溶解在适当溶剂中的聚合物或者纳米材料滴加或涂覆于电极表面，待溶剂蒸发干固后，生成涂膜结合在电极表面从而达到化学修饰的目的。

超支化聚合物是一类具有三维球状立体结构的高度无规多级支化聚合物，其独特的物理与化学结构使其具有低粘度、良好的溶解性和大量可修饰末端官能团等性质。与高度对称的树枝分子相比，超支化聚合物在合成过程中不需要经过多步反应和纯化，合成过程简单且生产成本相对低廉。含二茂铁功能基团的超支化聚合物，属于茂基金属超支化聚合物中的一种，不仅具有超支化聚合物的结构，并且具有二茂铁优异的氧化还原性质和电化学响应性，同时，还克服了二茂铁难以成膜的缺点，改善了成膜的稳定性，在聚合物传感器领域呈现良好的应用潜力（详见背景技术文件1：“超支化聚酯基二茂铁的合成及性能研究”，张颖，石家庄铁道学院，2010年，硕士学位论文）。

石墨烯是一种由 sp2–杂化碳原子通过共价键连接形成的平面六方晶格材料，其独特的电子结构特征和物理化学性质，使其在电化学检测和电分析等方面显示出独特的优势，可用于制备灵敏度高、选择性好、电流响应快、检测范围宽、检测限低的生物分析和环境检测的电化学传感器。石墨烯电导率高且结构中含有大量的边界点、结构缺陷和功能性基团，为检测物质在其上的吸附和电化学反应提供了丰富的场所，可以增加固定的分子数量，从而增强反应信号，由此加速了电子转移，实现了直接电化学和生物传感。

全氟磺酸树脂（Nafion）是全氟代磺化物，是含有电离集团的阳离子交换聚合物，用作电极修饰材料具有良好的离子交换特性，将Nafion涂于电极表面制成的修饰电极具有富集、电催化和选择性透过的特性，愈来愈广泛的应用于分析化学领域。

化学修饰电极的一种主要应用是作为电化学传感器。电化学传感器的基本原理是在固定或变化的电压下，具有电活性的分析物在电极表面发生氧化还原反应而产生电化学信号的过程。电化学传感器包含分子识别和信息转换两个部分，其原理是在电极表面固定生物活性材料或者化学复合材料，通过这些物质对分析物进行特异性识别，电极将这个识别信息传递到信息转换部分，形成可检测的输出信号，根据识别前后电信号的变化量，对待测物进行定性或定量分析。电化学转换器件具有较高的灵敏度，易微型化，能在浑浊的溶液中操作等许多优势，并且所需的仪器简单、便宜，因而被广泛应用于传感器的制备中。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种化学修饰电极及其制备方法，将茂基金属超支化聚合物和石墨烯作为电极表面修饰材料，将Nafion作为成膜剂，制得一种具有特定功能的化学修饰电极，具有茂基金属优异的氧化还原性质和电化学响应性。

本发明要解决的另一技术问题是提供一种包括上述化学修饰电极的电化学传感器及其应用，利用该具有特定功能的化学修饰电极，作为电化学传感器中的分子特异性识别元件，实现对特定分子的定量检测。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：化学修饰电极，包括基体电极和附着在该基体电极上的修饰层，所述基体电极为惰性固体电极，所述修饰层包括茂基金属超支化聚合物、石墨烯和全氟磺酸树脂构成的复合膜，所述茂基金属超支化聚合物是指端基包括茂金属基团的超支化聚合物。

具体地，所述复合膜自固体电极向外依次包括茂基金属超支化聚合物层、茂基金属超支化聚合物和石墨烯的混合物层、石墨烯层以及石墨烯和全氟磺酸树脂的混合物层。

如前所述的化学修饰电极的制备方法，所述修饰层采用滴涂法制成，依次将包括茂基金属超支化聚合物的溶液、石墨烯分散液和包括全氟磺酸树脂的溶液滴涂到所述基体电极表面，使之自组装成膜；每次滴涂后，烘干基体电极上的所滴涂液，再进行下一次滴涂。

进一步地，所述的化学修饰电极的制备方法，包括以下步骤：

1）首先将茂基金属超支化聚合物溶液滴涂在所述基体电极表面，烘干，重复本步中滴涂、烘干操作多次，形成茂基金属超支化聚合物涂层；

2）将茂基金属超支化聚合物和石墨烯的混合溶液滴涂到预先已经吸附了茂基金属超支化聚合物涂层的基体电极表面，烘干；

3）将石墨烯分散液滴涂到基体电极表面，烘干；

4）将石墨烯和全氟磺酸树脂的混合溶液滴涂到基体电极表面，使自然干燥。

作为优选，所述步骤1）中，茂基金属超支化聚合物在溶液的浓度控制在2.5×10^-5～1×10^-3mol·L^-1，所述茂基金属超支化聚合物由超支化聚酯、超支化聚氨酯或超支化聚胺酯与二茂铁甲酸或二茂铁二甲酸反应制得。

反应原理为超支化聚合物的端羟基与二茂铁甲酸或二茂铁二甲酸的羧基间发生酯化反应，合成茂基金属超支化聚合物，如超支化聚酯基二茂铁、超支化聚胺酯基二茂铁、超支化聚氨酯基二茂铁等。

所述步骤2）中，混合溶液中石墨烯与茂基金属超支化聚合物的质量比为5:18～72，茂基金属超支化聚合物的浓度控制范围为5×10^-5～2×10^-3mol·L^-1，混合溶液的溶剂为二氯甲烷；

所述步骤3）中，石墨烯分散液由如下方法配制：称取5～10mg石墨烯加入到10ml N,N-二甲基甲酰胺中，经超声震荡混匀；

所述步骤4）中，石墨烯和全氟磺酸树脂的混合溶液由如下方法配制：称取10mg石墨烯，溶解在10ml 浓度为0.1%~5%的全氟磺酸树脂溶液中，经超声震荡混匀。

作为优选，所述基体电极为玻碳电极，所述玻碳电极在滴涂前经过预处理，包括清洗、抛光和活化处理。

具体地，所述玻碳电极预处理方法为：使用无水乙醇、3～6mol·L^-1硝酸溶液和去离子水对玻碳电极进行超声清洗，再用氧化铝粉末溶液进行抛光处理，然后用体积比为1～3:1的H₂SO₄:H₂O₂的溶液对电极进行超声活化，之后用0.5～2mol·L^-1的浓硫酸进行电化学活化。

电化学传感器，包括如前所述的化学修饰电极。

该电化学传感器的应用，用于胆固醇、O,O-二甲基-O-（2,2-二氯乙烯基）磷酸酯（DDVP）的检测。

采用上述技术方案所产生的有益效果在于：本发明采用茂基金属超支化聚合物/石墨烯复合材料，作为化学修饰层制成具有特定功能的化学修饰电极，不仅具有良好而氧化还原性质和电化学响应性，还具有良好的电子转移能力。同时，由于将茂基金属接枝到超支化聚合物的末端，克服了单一的茂基金属，如二茂铁无法成膜的缺点。利用该化学修饰电极制备的传感器具有良好的稳定性、重现性和灵敏性，能够实现对胆固醇和DDVP的定量检测，操作简便、检测速度快。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1 为本发明实例1制作的化学修饰电极在PBS溶液中的CV曲线图；

图2为本发明实例1制作的化学修饰电极在不同扫描速率CV曲线图；

图3为本发明实例1制作的化学修饰电极在不同pH值下的DPV曲线图和峰电流与不同pH的关系图；

图4为本发明实例1制作的传感器对不同浓度胆固醇的DPV曲线和浓度与峰电流的关系图；

图5为本发明实例1制作的传感器对不同浓度敌敌畏的DPV曲线和浓度与峰电流的关系图；

图6为本发明实例1制作的化学修饰电极的SEM图；

图7为本发明实例1制作的传感器的裸GCE、HPAE-Fc/GCE、GR/GCE、HPAE-Fc/GR/GCE、HPAE-Fc/GR/DDVP/GCE交流阻抗图谱。

具体实施方式

本发明说明书中所用简称作如下说明：

超支化聚胺酯基二茂铁 HPAE-Fc

玻碳电极 GCE

石墨烯 GR

全氟磺酸树脂 Nafion

O，O-二甲基-O-（2，2-二氯乙烯基）磷酸酯 DDVP（敌敌畏，DDV）

差分脉冲伏安法 DPV。

茂基金属是过渡金属与环戊二烯相连所形成的有机金属配位化合物。二茂铁是一种典型的茂基金属，化学性质稳定，具有优异的氧化还原性质和电化学响应性，用作化学修饰电极的修饰材料将具有独特的功能，能够作为电化学传感器实现特定的用途。但是二茂铁难以成膜，且成膜的稳定性差，使得其在化学修饰电极和电化学传感器领域的应用受到限制。

化学修饰电极

本发明提供了一种化学修饰电极，利用茂基金属超支化聚合物和石墨烯作为化学修饰材料，先将茂基金属超支化聚合物修饰在基体电极上，再将石墨烯修饰在其表面，最后使用Nafion作为成膜剂固化成膜，制得的化学修饰电极具有特定的功能，不仅具有良好而氧化还原性质和电化学响应性，还具有良好的电子转移能力。同时，利用该化学修饰电极制备的传感器具有良好的稳定性、重现性和灵敏性，能够实现对胆固醇和DDVP的定量检测，操作简便、检测速度快。

该化学修饰电极包括基体电极和附着在该基体电极上的修饰层，基体电极为惰性固体电极，修饰层包括茂基金属超支化聚合物、石墨烯和全氟磺酸树脂构成的复合膜，茂基金属超支化聚合物是指端基包括茂金属基团的超支化聚合物。

常用的惰性固体电极如玻碳电极、铂电极、金电极、碳化硼等。在固体电极上制备修饰层之前，一般需要对固体电极进行清洁处理，以获得均一的电极表面状态，能够使电极在电化学行为上具有良好的重现性。

茂基金属超支化聚合物由超支化聚酯、超支化聚氨酯或超支化聚胺酯与二茂铁甲酸或二茂铁二甲酸反应制得。具体反应方法见前述的背景技术文件1。现以超支化聚酯和二茂铁甲酸为例，作简单说明：将熔融的超支化聚酯与二茂铁甲酸混合，并加入对甲苯磺酸作为催化剂，在氮气氛围保护下，反应体系抽真空150℃进行反应，制得超支化聚酯基二茂铁。由于二茂铁的空间位阻较大，所以对超支化聚酯的接枝程度达不到理论值的100%。

反应原理为超支化聚合物的端羟基与二茂铁甲酸或二茂铁二甲酸的羧基间发生酯化反应，合成茂基金属超支化聚合物，如超支化聚酯基二茂铁、超支化聚胺酯基二茂铁、超支化聚氨酯基二茂铁等。

具体地，复合膜自固体电极向外依次包括茂基金属超支化聚合物层、茂基金属超支化聚合物和石墨烯的混合物层、石墨烯层以及石墨烯和全氟磺酸树脂的混合物层。

复合膜将茂基金属超支化聚合物优异的氧化还原性、电化学响应性和石墨烯良好的导电性相结合，使用Nafion成膜剂改善其固化性质，增强了稳定性。

化学修饰电极的制备方法

如前所述的化学修饰电极的制备方法，修饰层采用滴涂法制成，依次将包括茂基金属超支化聚合物的溶液、石墨烯分散液和包括全氟磺酸树脂的溶液滴涂到基体电极表面，使之自组装成膜；每次滴涂后，烘干基体电极上的所滴涂液，再进行下一次滴涂。

自组装成膜的基本原理是通过固-液界面间的化学吸附(表面化学反应)进行的。

本发明提供一种化学修饰电极的具体制备方法，包括以下步骤：

（1）使用无水乙醇、3～6mol·L^-1硝酸溶液和去离子水对玻碳电极进行超声清洗，再用氧化铝粉末溶液进行抛光处理，然后用H₂SO₄:H₂O₂（1～3:1、体积比）的溶液对电极进行超声活化，之后用0.5～2mol·L^-1的浓硫酸进行电化学活化；

（2）配制茂基金属超支化聚合物溶液，溶剂采用二次蒸馏水或者是有机溶剂二氯甲烷均可，使用前将茂基金属超支化聚合物溶液在50～80℃下超声震荡充分溶解，在玻碳电极表面滴涂一定量的该溶液，然后进行烘干处理，烘干温度为30～90℃，时间为10～60min，重复本步中滴涂、烘干操作5～20次，以增大聚合物在电极表面的吸附量；

（3）配制茂基金属超支化聚合物/石墨烯混合溶液，使用前将茂基金属超支化聚合物/石墨烯混合溶液超声震荡充分分散，将一定量混合溶液滴涂到预先已经吸附了茂基金属超支化聚合物涂层的玻碳电极表面，然后进行烘干处理，烘干温度为30～90℃，时间为10～60min；

（4）配制石墨烯分散液，使用前将石墨烯分散液超声震荡充分分散，将一定量石墨烯分散液滴涂到玻碳电极表面，然后进行烘干处理，烘干温度为30～90℃，时间为10～60min；

（5）配制石墨烯/Nafion混合溶液，使用前将石墨烯/Nafion混合溶液超声震荡充分分散，将一定量石墨烯/Nafion混合溶液滴涂到玻碳电极表面，然后自然干燥8～12h。

其中步骤2）中，茂基金属超支化聚合物在溶液的浓度控制在2.5×10^-5～1×10^-3mol·L^-1，茂基金属超支化聚合物由超支化聚酯、超支化聚氨酯和超支化聚胺酯等含超支化结构和活泼基团的超支化聚合物，与二茂铁甲酸、二茂铁二甲酸以及含其他活泼基团的二茂铁结构物反应制得。

步骤3）中，混合溶液中石墨烯与茂基金属超支化聚合物的质量比为5:18～72，茂基金属超支化聚合物的浓度控制范围为5×10^-5～2×10^-3mol·L^-1，混合溶液的溶剂为二氯甲烷；

步骤4）中，石墨烯分散液由如下方法配制：称取5～10mg石墨烯加入到10ml N,N-二甲基甲酰胺中，经超声震荡混匀；

步骤5）中，石墨烯和全氟磺酸树脂的混合溶液由如下方法配制：称取10mg石墨烯，溶解在10ml 浓度为0.1%~5%的全氟磺酸树脂溶液中，经超声震荡混匀。

下面进一步举例说明该化学修饰电极及其制备方法

实施例1

（1）依次使用无水乙醇、6mol·L^-1硝酸溶液和去离子水对玻碳电极超声清洗，接着使用氧化铝粉末溶液进行抛光处理，然后在H₂SO₄:H₂O₂=3:1(V/V)的溶液中超声波洗涤活化电极，最后使用2mol·L^-1 的浓硫酸进行电化学活化；

（2）配制1×10^-3mol·L^-1的超支化聚胺酯基二茂铁（以下简称HPAE-Fc）溶液，使用前将1×10^-3mol·L^-1的HPAE-Fc溶液在50℃下超声30min充分溶解，在GCE表面滴涂30μL的HPAE-Fc溶液，然后进行烘干处理，烘干温度为60℃，时间20min，重复本步滴涂、烘干操作10次；

（3）配制GR/HPAE-Fc（GR:HPAE-Fc=5:36）混合溶液，使用前将GR/ HPAE-Fc混合溶液超声震荡充分溶解分散，滴涂30μL的混合溶液到HPAE-Fc/GCE表面，然后进行烘干处理，烘干温度为30℃，时间为1h；

（4）配制GR分散液，使用前将GR分散液超声充分分散，滴涂30μL GR分散液到HPAE-Fc/GR/GCE表面，然后进行烘干处理，烘干温度为30℃，烘干时间为1h；

（5）配制GR/Nafion(0.1%)混合溶液，使用前将GR/Nafion(0.1%)混合溶液超声30min充分分散，滴涂30μL GR/Nafion(0.1%)混合溶液到上述电极表面，然后自然干燥10h。

化学修饰电极的表征

将实施例1制得的化学修饰电极作为工作电极，组成三电极体系，在PBS溶液中进行电化学表征，其CV曲线图、DPV曲线图参见图1、图2和图3。

采用实施例1制备的化学修饰电极作为电化学传感器工作电极，使用电化学工作站以三电极体系分别对胆固醇和DDVP进行测试。

胆固醇的检测方法

（1） 使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂片电极为辅助电极，所制备的修饰电极为工作电极，在25mL的模拟体液（或二氯甲烷等合适溶剂）中进行测试；

（2）选择差分脉冲伏安法（DPV）对胆固醇进行检测，初始电位为0.3V，最终电位为1.0V；

（3）依次向电解池溶液中滴加一定量的0.25mol.L^-1的胆固醇溶液（溶剂为模拟体液或二氯甲烷等合适溶剂），分别进行DPV实验，绘制胆固醇浓度和DPV峰电流的关系图，见图4。

DDVP的检测方法

（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂片电极为辅助电极，所制备的修饰电极为工作电极，在25mL的磷酸盐缓冲液（PBS）溶液中进行测试；

（2）选择差分脉冲伏安法（DPV）对DDVP进行检测，初始电位为0.1V，最终电位为0.6V；

（3）依次向电解池溶液中加入一定量0.5g/kg的O，O-二甲基-O-（2，2-二氯乙烯基）磷酸酯溶液，分别进行DPV实验，绘制DDVP浓度和DPV峰电流的关系图，见图5。

实施例1制得的化学修饰电极其修饰层界面微观结构见图6。

采用电化学交流阻抗法对裸GCE、HPAE-Fc/GCE、GR/GCE、HPAE-Fc/GR/GCE、HPAE-Fc/GR/DDV/GCE分别进行测试，测定的交流阻抗图谱见图7。

由上述测试结果谱图可知，该电化学传感器具有灵敏度高、稳定性和重现性好、线性检测范围宽的优点，可用于血样中胆固醇浓度测定以及果蔬中残留杀虫剂DDVP的检测。

实施例2

（1）依次使用无水乙醇、5mol·L^-1硝酸溶液和去离子水对玻碳电极超声清洗，接着使用氧化铝粉末溶液对玻碳电极进行抛光处理，然后在H₂SO₄:H₂O₂=1:1(V/V)的溶液中超声波洗涤活化电极，最后使用2mol·L^-1 的浓硫酸进行电化学活化；

（2）配制5×10^-3mol·L^-1的HPAE-Fc溶液，使用前将1×10^-4mol·L^-1的HPAE-Fc溶液在50℃下超声30min充分溶解，在GCE表面滴涂30μL的HPAE-Fc溶液，然后进行烘干处理，烘干温度为60℃，时间20min，重复本步滴涂、烘干操作10次；

（3）配制GR/ HPAE-Fc（GR:HPAE-Fc=5:36）混合溶液，使用前将GR/ HPAE-Fc混合溶液超声震荡充分溶解分散，滴涂30μL的混合溶液到HPAE-Fc/GCE表面，然后进行烘干处理，烘干温度为30℃，时间为1h；

（4）配制GR分散液，使用前将GR分散液超声充分分散，滴涂30μL GR分散液到HPAE-Fc/GR/GCE表面，然后进行烘干处理，烘干温度为30℃，烘干时间为1h；

（5）配制GR/Nafion(0.1%)混合溶液，使用前将GR/Nafion(0.1%)混合溶液超声30min充分分散，滴涂30μL GR/Nafion(0.1%)混合溶液到上述电极表面，然后自然干燥10h。

实施例3

（1）依次使用无水乙醇、4mol·L^-1硝酸溶液和去离子水对玻碳电极超声清洗，接着使用氧化铝粉末溶液进行抛光处理，然后在H₂SO₄:H₂O₂=2:1(V/V)的溶液中超声波洗涤活化电极，最后使用1mol·L^-1 的浓硫酸进行电化学活化；

（2）配制1×10^-4mol·L^-1的HPAE-Fc溶液，使用前将1×10^-5mol·L^-1的HPAE-Fc溶液在50℃下超声30min充分溶解，在GCE表面滴涂30μL的HPAE-Fc溶液，然后进行烘干处理，烘干温度为60℃，时间20min，重复本步滴涂、烘干操作10次；

（3）配制GR/ HPAE-Fc（GR:HPAE-Fc=5:36）混合溶液，使用前将GR/ HPAE-Fc混合溶液超声震荡充分溶解分散，滴涂30μL的混合溶液到HPAE-Fc/GCE表面，然后进行烘干处理，烘干温度为30℃，时间为1h；

（4）配制GR分散液，使用前将GR分散液超声充分分散，滴涂30μL GR分散液到HPAE-Fc/GR/GCE表面，然后进行烘干处理，烘干温度为30℃，烘干时间为1h；

（5）配制GR/Nafion(0.1%)混合溶液，使用前将GR/Nafion(0.1%)混合溶液超声30min充分分散，滴涂30μL GR/Nafion(0.1%)混合溶液到上述电极表面，然后自然干燥10h。

实施例4

（1）依次使用无水乙醇、6mol·L^-1硝酸溶液和去离子水对玻碳电极超声清洗，接着使用氧化铝粉末溶液进行抛光处理，然后在H₂SO₄:H₂O₂=3:1(V/V)的溶液中超声波洗涤活化电极，最后使用0.5mol·L^-1 的浓硫酸进行电化学活化；

（2）配制5×10^-4mol·L^-1的HPAE-Fc溶液，使用前将1×10^-3mol·L^-1的HPAE-Fc溶液在50℃下超声30min充分溶解，在GCE表面滴涂20μL的HPAE-Fc溶液，然后进行烘干处理，烘干温度为60℃，时间20min，重复本步滴涂、烘干操作5次；

（3）配制GR/ HPAE-Fc（GR:HPAE-Fc=5:36）混合溶液，使用前将GR/ HPAE-Fc混合溶液超声震荡充分溶解分散，滴涂20μL的混合溶液到HPAE-Fc/GCE表面，然后进行烘干处理，烘干温度为30℃，时间为1h；

（4）配制GR分散液，使用前将GR分散液超声充分分散，滴涂20μL GR分散液到HPAE-Fc/GR/GCE表面，然后进行烘干处理，烘干温度为30℃，烘干时间为1h；

（5）配制GR/Nafion(0.1%)混合溶液，使用前将GR/Nafion(0.1%)混合溶液超声30min充分分散，滴涂20μL GR/Nafion(0.1%)混合溶液到上述电极表面，然后自然干燥10h。

实例5

（1）依次使用无水乙醇、6mol·L^-1硝酸溶液和去离子水对玻碳电极超声清洗，接着使用氧化铝粉末溶液进行抛光处理，然后在H₂SO₄:H₂O₂=3:1(V/V)的溶液中超声波洗涤活化电极，最后使用2mol·L^-1 的浓硫酸进行电化学活化；

（2）配制1×10^-5mol·L^-1的HPAE-Fc溶液，使用前将1×10^-4mol·L^-1的HPAE-Fc溶液在60℃下超声震荡充分溶解，在GCE表面滴涂10μL的HPAE-Fc溶液，然后进行烘干处理，烘干温度为60℃，时间20min，重复本步滴涂、烘干操作5次；

（3）配制GR/ HPAE-Fc（GR:HPAE-Fc=5:36）混合溶液，使用前将GR/ HPAE-Fc混合溶液超声震荡充分溶解分散，滴涂10μL的混合溶液到HPAE-Fc/GCE表面，然后进行烘干处理，烘干温度为30℃，时间为1h；

（4）配制GR分散液，使用前将GR分散液超声充分分散，滴涂10μL GR分散液到HPAE-Fc/GR/GCE表面，然后进行烘干处理，烘干温度为30℃，烘干时间为1h；

（5）配制GR/Nafion(0.1%)混合溶液，使用前将GR/Nafion(0.1%)混合溶液超声30min充分分散，滴涂10μL GR/Nafion(0.1%)混合溶液到上述电极表面，然后自然干燥10h。

实例6

（1）依次使用无水乙醇、5mol·L^-1硝酸溶液和去离子水对玻碳电极超声清洗，接着使用氧化铝粉末溶液进行抛光处理，然后在H₂SO₄:H₂O₂=2:1(V/V)的溶液中超声波洗涤活化电极，最后使用0.5mol·L^-1的浓硫酸进行电化学活化；

（2）配制1×10^-5mol·L^-1的HPAE-Fc溶液，使用前将1×10^-5mol·L^-1的HPAE-Fc溶液在50℃下超声30min充分溶解，在GCE表面滴涂30μL的HPAE-Fc溶液，然后进行烘干处理，烘干温度为60℃，时间20min，重复本步滴涂、烘干操作5次；

（3）配制GR/ HPAE-Fc（GR：HPAE-Fc=5:36）混合溶液，使用前将GR/ HPAE-Fc混合溶液超声震荡充分溶解分散，滴涂30μL的混合溶液到HPAE-Fc/GCE表面，然后进行烘干处理，烘干温度为30℃，时间为1h；

（4）配制GR分散液，使用前将GR分散液超声充分分散，滴涂30μL GR分散液到HPAE-Fc/GR/GCE表面，然后进行烘干处理，烘干温度为30℃，烘干时间为1h；

（5）配制GR/Nafion(0.5%)混合溶液，使用前将GR/Nafion(0.5%)混合溶液超声30min充分分散，滴涂30μL GR/Nafion(0.5%)混合溶液到上述电极表面，然后自然干燥10h。

实例7

（1）依次使用无水乙醇、6mol·L^-1硝酸溶液和去离子水对玻碳电极超声清洗，接着使用氧化铝粉末溶液进行抛光处理，然后在H₂SO₄:H₂O₂=3:1(V/V)的溶液中超声波洗涤活化电极，最后使用2mol·L^-1的浓硫酸进行电化学活化；

（2）配制1×10^-3mol·L^-1的HPAE-Fc溶液，使用前将1×10^-3mol·L^-1的HPAE-Fc溶液在50℃下超声30min充分溶解，在GCE表面滴涂30μL的HPAE-Fc溶液，然后进行烘干处理，烘干温度为90℃，时间20min，重复本步滴涂、烘干操作10次；

（3）配制GR/ HPAE-Fc（GR:HPAE-Fc=5:36）混合溶液，使用前将GR/ HPAE-Fc混合溶液超声震荡充分溶解分散，滴涂30μL的混合溶液到HPAE-Fc/GCE表面，然后进行烘干处理，烘干温度为30℃，时间为1h；

（4）配制GR分散液，使用前将GR分散液超声充分分散，滴涂30μL GR分散液到HPAE-Fc/GR/GCE表面，然后进行烘干处理，烘干温度为30℃，烘干时间为1h；

（5）配制GR/Nafion(1%)混合溶液，使用前将GR/Nafion(1%)混合溶液超声30min充分分散，滴涂30μL GR/Nafion(1%)混合溶液到上述电极表面，然后自然干燥10h。

实例8

（1）依次使用无水乙醇、6mol·L^-1硝酸溶液和去离子水对玻碳电极超声清洗，接着使用氧化铝粉末溶液进行抛光处理，然后在H₂SO₄:H₂O₂=3:1(V/V)的溶液中超声波洗涤活化电极，最后使用2mol·L^-1的浓硫酸进行电化学活化；

（2）配制1×10^-3mol·L^-1的HPAE-Fc溶液，使用前将1×10^-3mol·L^-1的HPAE-Fc溶液在50℃下超声30min充分溶解，在GCE表面滴涂30μL的HPAE-Fc溶液，然后进行烘干处理，烘干温度为30℃，时间1h，重复本步滴涂、烘干操作10次；

（3）配制GR/ HPAE-Fc（GR:HPAE-Fc=5:36）混合溶液，使用前将GR/ HPAE-Fc混合溶液超声震荡充分溶解分散，滴涂30μL的混合溶液到HPAE-Fc/GCE表面，然后进行烘干处理，烘干温度为30℃，时间为1h；

（4）配制GR分散液，使用前将GR分散液超声充分分散，滴涂30μL GR分散液到HPAE-Fc/GR/GCE表面，然后进行烘干处理，烘干温度为30℃，烘干时间为1h；

（5）配制GR/Nafion(2%)混合溶液，使用前将GR/Nafion(2%)混合溶液超声30min充分分散，滴涂30μL GR/Nafion(2%)混合溶液到上述电极表面，然后自然干燥10h。

实例9

（1）依次使用无水乙醇、6mol·L^-1硝酸溶液和去离子水对玻碳电极超声清洗，接着使用氧化铝粉末溶液进行抛光处理，然后在H₂SO₄:H₂O₂=3:1(V/V)的溶液中超声波洗涤活化电极，最后使用2mol·L^-1 的浓硫酸进行电化学电极活化；

（2）配制1×10^-3mol·L^-1的HPAE-Fc溶液，使用前将1×10^-3mol·L^-1的HPAE-Fc溶液在50℃下超声30min充分溶解，在GCE表面滴涂30μL的HPAE-Fc溶液，然后进行烘干处理，烘干温度为60℃，时间20min，重复本步滴涂、烘干操作10次；

（3）配制GR/ HPAE-Fc（GR:HPAE-Fc=5:36）混合溶液，使用前将GR/ HPAE-Fc混合溶液超声震荡充分溶解分散，滴涂30μL的混合溶液到HPAE-Fc/GCE表面，然后进行烘干处理，烘干温度为60℃，时间为30min；

（4）配制GR分散液，使用前将GR分散液超声充分分散，滴涂30μL GR分散液到HPAE-Fc/GR/GCE表面，然后进行烘干处理，烘干温度为60℃，烘干时间为30min；

（5）配制GR/Nafion(3%)混合溶液，使用前将GR/Nafion(3%)混合溶液超声30min充分分散，滴涂30μL GR/Nafion(3%)混合溶液到上述电极表面，然后进行烘干处理，烘干温度为60℃，时间为30min。

实例10

（1）依次使用无水乙醇、6mol·L^-1硝酸溶液和去离子水对玻碳电极超声清洗，接着使用氧化铝粉末溶液进行抛光处理，然后在H₂SO₄:H₂O₂=3:1(V/V)的溶液中超声波洗涤活化电极，最后使用2mol·L^-1的浓硫酸进行电化学活化；

（2）配制1×10^-3mol·L^-1的HPAE-Fc溶液，使用前将1×10^-3mol·L^-1的HPAE-Fc溶液在50℃下超声30min充分溶解，在GCE表面滴涂30μL的HPAE-Fc溶液，然后进行烘干处理，烘干温度为60℃，时间20min，重复本步滴涂、烘干操作10次；

（3）配制GR/ HPAE-Fc（GR:HPAE-Fc=5:36）混合溶液，使用前将GR/ HPAE-Fc混合溶液超声震荡充分溶解分散，滴涂30μL的混合溶液到HPAE-Fc/GCE表面，然后进行烘干处理，烘干温度为30℃，时间为1h；

（4）配制GR分散液，使用前将GR分散液超声充分分散，滴涂30μL GR分散液到HPAE-Fc/GR/GCE表面，然后进行烘干处理，烘干温度为90℃，烘干时间为20min；

（5）配制GR/Nafion(4%)混合溶液，使用前将GR/Nafion(4%)混合溶液超声30min充分分散，滴涂30μL GR/Nafion(4%)混合溶液到上述电极表面，然后进行烘干处理，烘干温度为90℃，时间为20min。

实例11

（1）依次使用无水乙醇、6mol·L^-1硝酸溶液和去离子水对玻碳电极超声清洗，接着使用氧化铝粉末溶液进行抛光处理，然后在H₂SO₄:H₂O₂=3:1(V/V)的溶液中超声波洗涤活化电极，最后使用2mol·L^-1的浓硫酸进行电化学活化；

（2）配制1×10^-3mol·L^-1的HPAE-Fc溶液，使用前将1×10^-3mol·L^-1的HPAE-Fc溶液在50℃下超声30min充分溶解，在GCE表面滴涂30μL的HPAE-Fc溶液，然后进行烘干处理，烘干温度为60℃，时间20min，重复本步滴涂、烘干操作10次；

（3）配制GR/ HPAE-Fc（GR：HPAE-Fc=5:36）混合溶液，使用前将GR/ HPAE-Fc混合溶液超声震荡充分溶解分散，滴涂30μL的混合溶液到HPAE-Fc/GCE表面，然后进行烘干处理，烘干温度为30℃，时间为1h；

（4）配制GR分散液，使用前将GR分散液超声充分分散，滴涂30μL GR分散液到HPAE-Fc/GR/GCE表面，然后进行烘干处理，烘干温度为30℃，烘干时间为1h；

（5）配制GR/Nafion(5%)混合溶液，使用前将GR/Nafion(5%)混合溶液超声30min充分分散，滴涂30μL GR/Nafion(5%)混合溶液到上述电极表面，然后进行烘干处理，烘干温度为30℃，时间为1h。

实例12

（1）依次使用无水乙醇、6mol·L^-1硝酸溶液和去离子水对玻碳电极超声清洗，接着使用氧化铝粉末溶液进行抛光处理，然后在H₂SO₄:H₂O₂=3:1(V/V)的溶液中超声波洗涤活化电极，最后使用2mol·L^-1的浓硫酸进行电化学活化；

（2）配制1×10^-3mol·L^-1的HPAE-Fc溶液，使用前将1×10^-3mol·L^-1的HPAE-Fc溶液在50℃下超声30min充分溶解，在GCE表面滴涂30μL的HPAE-Fc溶液，然后进行烘干处理，烘干温度为60℃，时间20min，重复本步滴涂、烘干操作10次；

（3）配制GR/ HPAE-Fc（GR：HPAE-Fc=5:72）混合溶液，使用前将GR/ HPAE-Fc混合溶液超声震荡充分溶解分散，滴涂30μL的混合溶液到HPAE-Fc/GCE表面，然后进行烘干处理，烘干温度为30℃，时间为1h；

（4）配制GR分散液，使用前将GR分散液超声充分分散，滴涂30μL GR分散液到HPAE-Fc/GR/GCE表面，然后进行烘干处理，烘干温度为30℃，烘干时间为1h；

（5）配制GR/Nafion(0.5%)混合溶液，使用前将GR/Nafion(0.5%)混合溶液超声30min充分分散，滴涂30μL GR/Nafion(0.5%)混合溶液到上述电极表面，然后自然干燥10h。

实例13

（1）依次使用无水乙醇、6mol·L^-1硝酸溶液和去离子水对玻碳电极超声清洗，接着使用氧化铝粉末溶液进行抛光处理，然后在H₂SO₄:H₂O₂=3:1(V/V)的溶液中超声波洗涤活化电极，最后使用2mol·L^-1的浓硫酸进行电化学活化；

（2）配制1×10^-3mol·L^-1的HPAE-Fc溶液，使用前将1×10^-3mol·L^-1的HPAE-Fc溶液在50℃下超声30min充分溶解，在GCE表面滴涂30μL的HPAE-Fc溶液，然后进行烘干处理，烘干温度为60℃，时间20min，重复本步滴涂、烘干操作10次；

（3）配制GR/ HPAE-Fc（GR：HPAE-Fc=5:18）混合溶液，使用前将GR/ HPAE-Fc混合溶液超声震荡充分溶解分散，滴涂30μL的混合溶液到HPAE-Fc/GCE表面，然后进行烘干处理，烘干温度为30℃，时间为1h；

（4）配制GR分散液，使用前将GR分散液超声充分分散，滴涂30μL GR分散液到HPAE-Fc/GR/GCE表面，然后进行烘干处理，烘干温度为30℃，烘干时间为1h；

（5）配制GR/Nafion(1%)混合溶液，使用前将GR/Nafion(1%)混合溶液超声30min充分分散，滴涂30μL GR/Nafion(1%)混合溶液到上述电极表面，然后自然干燥10h。

以上对本发明进行了详细介绍，本发明中应用具体个例对本发明的实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明，应当指出，对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可对本发明进行若干改进，这些改进也落入本发明权利要求的保护范围内。