生物传感电极的制作方法

本实用新型属于生物传感技术领域，涉及一种用于鉴别鱼卵、鱼苗、成鱼、鱼肉及其制品的所属物种的检测装置，特别涉及一种生物传感电极。

背景技术：

根据FISHBASE统计，全球现生鱼类物种多达28，872种，约占已命名脊椎动物物种数目的一半。由于鱼类种类繁多，且多个门类中存在不少形态相似的物种，并能够通过种间杂交，产生新的杂交物种，使得鱼类物种的形态学鉴定难度较大，即使是有经验的分类学者，也时有误判。

DNA是生物体的遗传分子，具有高度的物种特异性，基于DNA序列开展物种鉴定，准确程度高，不受个体年龄、发育时期和形态的影响，还能够用于鱼肉、鱼子酱及其他加工产品的物种来源检测，因而在科学研究、环境保护、水产品质量安全检测中都具有广泛的应用前景。

目前常见的鱼类物种DNA鉴定技术均以聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)为基础。DNA条形码技术需要对PCR扩增产物进行测序，成本高且耗时较长；扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP)、限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)等检测则需要进行电泳，所用试剂对人体健康具有一定的危害性，并可能造成潜在的环境污染，例如琼脂糖凝胶电泳使用的DNA指示剂溴化乙锭(ethidium bromide，EB)具有致癌性。

综上所述，有必要开发新的检测装置，实现鱼类物种鉴定中对PCR扩增产物的清洁、快速检测。

技术实现要素：

本实用新型的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

本实用新型还有一个目的是提供一种生物传感电极。

本实用新型提供的技术方案为：

一种生物传感电极，包括：

基底层，其上印刷有工作电极、对电极和参比电极；

第一样品池，其设置于所述基底层的上方，并与所述基底层之间形成有容纳液体的第一容置空间，且所述工作电极、对电极和参比电极的工作端位于所述第一容置空间内；

第二样品池，其也设置于所述基底层的上方，并可拆卸地固定于所述第一样品池内，当所述第二样品池固定入所述第一样品池内时，所述第二样品池与所述基底层之间形成容纳液体的第二容置空间，且所述工作电极的工作端位于所述第二容置空间内。

优选的是，所述的生物传感电极中，所述基底层上，所述工作电极的印刷浆料为金，且表面修饰有带负电荷的纳米金颗粒和生物素结合分子。

优选的是，所述的生物传感电极中，所述基底层上，所述对电极的印刷浆料为铂。

优选的是，所述的生物传感电极中，所述基底层上，所述参比电极的印刷浆料为银或氯化银。

优选的是，所述的生物传感电极中，所述基底层上，还印刷有与所述工作电极、对电极和参比电极分别连接的导线，所述导线的印刷浆料为银或铜。

优选的是，所述的生物传感电极，还包括：

绝缘盖，其盖合在所述基底层的上方，第一样品池形成于所述绝缘盖上，所述绝缘盖由绝缘材料制成。

优选的是，所述的生物传感电极中，所述绝缘盖的厚度为2-5mm，在竖直方向上，所述第二样品池的高度高于所述绝缘盖。

优选的是，所述的生物传感电极中，所述绝缘盖和所述第二样品池均由聚氯乙烯材料制成。

优选的是，所述的生物传感电极中，所述基底层由绝缘材料制成，所述绝缘材料为聚对苯二甲酸二乙酯。

优选的是，所述的生物传感电极中，所述生物素结合分子为亲和素。

本实用新型至少包括以下有益效果：

本实用新型提供了一种生物传感电极，能够捕获同时带有电化学活性分子标记和生物素标记的DNA分子，与电压输出及信号采集装置相连接，如电化学工作站，构成电化学生物传感器，用于物种特异性PCR扩增产物的检测，目标分子的捕获和电化学信号检测可在60min内完成，与测序法相比操作简单、反应快速。

本实用新型所述生物传感电极检测操作中，包括样品前处理操作，全程不涉及任何有毒有害试剂，不存在人身健康或环境污染隐患，与电泳法相比安全、清洁。

本实用新型的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本实用新型的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本实用新型中生物传感电极的俯视示意图；

图2为本实用新型中生物传感电极的侧视示意图；

图3A为本实用新型中基底层的结构示意图；

图3B为本实用新型中绝缘盖的结构示意图；

图3C为本实用新型中样品池转换扣的结构示意图；

图4为本实用新型中生物传感电极检测信号DNA的循环伏安曲线，图中细实线表示存在目标DNA时的样品曲线，粗虚线表示不存在目标DNA时的样品曲线。

具体实施方式

下面结合附图对本实用新型做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

如图1～4所示，本实用新型提供一种生物传感电极，包括：

基底层1，其上印刷有工作电极4、对电极5和参比电极6；

第一样品池7，其设置于所述基底层1的上方，与所述工作电极4、对电极5和参比电极6的工作端相通，并与所述基底层1之间形成有容纳液体的第一容置空间，三电极系统通过所述第一样品池7接收电解液和待检测样品；

第二样品池8，其也设置于所述基底层1的上方，并可拆卸地固定于所述第一样品池7内，当所述第二样品池8固定入所述第一样品池7内时，所述第二样品池8与所述基底层1之间形成容纳液体的第二容置空间，且所述工作电极4的工作端位于所述第二容置空间内，所述工作电极4通过所述第二样品池8接收对其进行修饰。

在本实用新型的其中一个实施例中，作为优选，该生物传感电极中，所述基底层1上，所述工作电极4的印刷浆料为金，且表面修饰有带负电荷的纳米金颗粒和生物素结合分子。

在本实用新型的其中一个实施例中，作为优选，该生物传感电极中，所述对电极5的印刷浆料为铂。

在本实用新型的其中一个实施例中，作为优选，该生物传感电极中，所述参比电极6的印刷浆料为银或氯化银。

在本实用新型的其中一个实施例中，作为优选，该生物传感电极中，所述基底层1上，还印刷有与所述工作电极4、对电极5和参比电极6分别连接的导线，所述导线的印刷浆料为银或铜。

在本实用新型的其中一个实施例中，作为优选，该生物传感电极，还包括：

绝缘盖2，其盖合在所述基底层1的上方，第一样品池7形成于所述绝缘盖2上，所述绝缘盖2由绝缘材料制成。

在本实用新型的其中一个实施例中，作为优选，该生物传感电极中，所述绝缘盖2的厚度为2-5mm，在竖直方向上，所述第二样品池8的高度高于所述绝缘盖2。

在本实用新型的其中一个实施例中，作为优选，该生物传感电极中，所述绝缘盖2和所述第二样品池8均由聚氯乙烯材料制成。

在本实用新型的其中一个实施例中，作为优选，该生物传感电极中，所述基底层1由绝缘材料制成，所述绝缘材料为聚对苯二甲酸二乙酯。

在本实用新型的其中一个实施例中，作为优选，该生物传感电极中，所述生物素结合分子为亲和素。

在本实用新型的其中一个实施例中，作为优选，第一样品池7为长方形，第二样品池8为圆形。

在本实用新型的其中一个实施例中，该生物传感电极俯视示意图如图1所示，侧视示意图如图2所示，该电极由基底层1、绝缘盖2、样品池转换扣3组装(包括第一样品池7和第二样品池8)而成。基底层1由绝缘材料表面印刷工作电极4、对电极5、参比电极6和导线构成。绝缘盖2通过绝缘胶与基底层1紧密粘合，绝缘盖2上留有长方形的第一样品池7，在长方形的第一样品池7中加入支持电解质时，支持电解质能够与工作电极4、对电极5和参比电极6充分接触。第二样品池8嵌入长方形样品池中，使圆形的第二样品池8与长方形的第一样品池7之间能够互相转换，在圆形的第二样品池8中加入用于鱼类物种鉴定的PCR扩增产物溶液时，产物溶液能够与工作电极4充分接触，并使溶液中同时带有电化学活性分子标记和生物素标记的扩增产物被工作电极4所捕获。电极各组件示意图如图3A、3B、3C所示。

本实用新型所述生物传感电极工作时，通过导线连接电化学输出和检测设备，构成三电极两回路：即工作电极4和参比电极6构成一个回路，用于测定工作电极4的电位；工作电极4和对电极5构成一个回路，用于测量外加电压下的电流大小。

本实用新型所述生物传感电极出厂前，工作电极4表面预先修饰有带负电荷的纳米金颗粒，以及生物素结合分子，其中优选的是，修饰方法如下：

(1)向圆形的第二样品池8中加入纳米金溶液(Sigma，柠檬酸钠还原氯金酸法制备，粒径30nm)，+1.55V电位下沉积15min，静置5min，吸出纳米金溶液，加入灭菌去离子水清洗。

(2)向圆形的第二样品池8中加入含10mMα-硫辛酸的乙醇溶液，活化电极20min，吸出α-硫辛酸溶液。

(3)向圆形的第二样品池8中加入浓度为100g/L的EDC/NHS混合液，活化羧基10min，吸出EDC/NHS混合液。

(4)向圆形的第二样品池8中加入浓度为0.2g/L的亲和素，偶联30min，吸出亲和素溶液，加入灭菌去离子水清洗，在超净台内风干。

本实用新型所述生物传感电极用于鱼类物种鉴定时，采用循环伏安法检测，优选的是，向工作电极4和对电极5间施加0到+600mV三角波电位，扫速50mV/s，记录3个循环中的第3个。

实施例1鉴定市售冰鲜三文鱼刺身是否来源于大西洋鲑(S.salar)

1.基因组DNA提取

取肌肉组织约100mg，使用海洋动物基因组DNA提取试剂盒(天根DP324-03)，按照说明书步骤提取基因组DNA，溶于100μL灭菌去离子水，紫外分光光度计测定浓度。

2.PCR扩增

定制合成大西洋鲑特异性引物(上海生工)，上游引物碱基序列为ACTCTCCCCTACTACCCACCT，5’端带有二茂铁修饰，下游引物碱基序列为TGTCCTATCCCTGTGACCTCT，5’端带有生物素修饰。

以基因组DNA为模板进行PCR扩增，反应体系如下：

PCR程序为

3.PCR扩增产物捕获

将PCR扩增产物溶液加入圆形的第二样品池，37℃温育30min，吸出PCR扩增产物溶液，加入pH 7.0Tris-EDTA缓冲液，洗脱3次，每次5min。

4.电化学信号检测

取出样品池转换扣，向方形样品池中加入pH7.0磷酸缓冲溶液作为支持电解质，测定生物传感电极的循环伏安曲线，结果如图4所示，细实线为大西洋鲑刺身样品检测曲线，呈现明显的氧化还原峰，表明电极表面捕获了二茂铁标记的PCR扩增产物，粗虚线为虹鳟(O.mykiss)冒充大西洋鲑的刺身样品检测曲线，二茂铁氧化还原峰不可见，表明电极表面不存在目标PCR扩增产物。

以上结果表明，本实用新型提供的生物传感电极能够应用于鱼类物种鉴定中的PCR扩增产物检测。

这里说明的模块数量和处理规模是用来简化本实用新型的说明的。对本实用新型的生物传感电极的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。

尽管本实用新型的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本实用新型的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本实用新型并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。