本发明涉及生物检测领域，尤其涉及一种消除乳糜干扰的甘胆酸的检测试剂盒。
背景技术：
甘胆酸(Cholyglycine,CG)是胆酸与甘氨酸结合而成的结合型胆酸之一。在肝细胞内，胆固醇经过及其复杂的酶促反应，转变成初级胆汁酸。其中有胆酸(CA)和鹅去氧胆酸(CD-CA)。胆酸的类固醇核上有三个羟基(C3、C7、C12)，侧链末端的羟基以肽键与甘氨酸结合。CG正常代谢途径为肠—肝循环，CG由肝细胞合成，经毛细胆管、胆管排入胆囊，随同胆汁进入十二指肠，帮助食物消化。95％胆酸在回肠末端重吸收，经门静脉再回肝脏，由肝细胞摄取再利用。在血清中主要以蛋白结合形式存在，溢入体循环的总量小于1％。在正常情况下,外周血中胆酸含量甚微,正常成人无论空腹或餐后,其血清CG浓度稳定在低水平。当肝细胞受损时，肝细胞摄取CG能力下降，致使血中CG含量增高；胆汁郁滞时，肝脏排泄胆酸发生障碍，而返流血液循环的CG含量增高，也使血CG含量增高。测定血清甘胆酸(CG)是评价肝细胞功能及其肝胆系物质循环功能的敏感指标之一。
另外孕妇在怀孕中后期，由于婴儿增大，会压迫肝脏，使肝脏排泄胆酸发生障碍而导致甘胆酸偏高，此外妊娠期胎盘合成和分泌大量雌激素和孕激素以及代谢负荷增大，会诱发肝胆系统的变化，使孕妇容易患妊娠肝内胆汁淤积症(ICP)，对胎儿产生极其严重的影响，随ICP患者血清CG增高使羊水污染率、早产率、胎儿宫内窘迫率及剖宫产率增高，严重者可导致婴儿的死亡，因此测定孕妇血清甘胆酸，对及时发现ICP和了解ICP的严重程度有着非常重要的意义，甘胆酸的测定可作为筛查和随访ICP的指标，从而降低病死率。
目前检测CG常用的实验室方法有放射免疫学分析法(RIA)、化学发光免疫分析法(CLIA)、酶联免疫吸附法(ELISA)。但是，放射免疫学分析法(RIA)检测耗时长(19～22h)，而且有放射性元素的污染，标记物稳定性差，废弃物难以处理而使其受到限制。化学发光免疫分析法(CLIA)尽管灵敏度较高、但是需要专用的检测设备，费用较高不利于推广。酶联免疫吸附法(ELISA)的操作较为繁琐，自动化程度不高，且受人为因素影响大，重复性差，耗时较长(至少40分钟)，不适宜临床使用。
现如今，市场上存在胶乳增强免疫比浊法检测试剂盒，但是由于其检测原理是测定反应形成的免疫复合物的浊度，因此，极易受到乳糜干扰的影响。目前应对这个问题的方法，主要是使用专门的乳糜消除剂对样本进行预处理。考虑到样本较少时该方法实用性还可以，但是当大规模人群普查、健康体检筛查和临床病人检验时，经常会遇到大量的乳糜、溶血等混浊样本，此时通过现有的常规检测试剂盒显然无法及时有效地解决此类问题，倘若通过购买样本处理剂对这些样本逐一进行单独处理，无疑极大地增加了操作人员的工作量，不仅提高了运营成本，也为临床检验的及时有效带来难题。
因此，研制一种自动化应用程度高的能够消除乳糜干扰的胶乳免疫比浊法的甘胆酸检测试剂盒显得十分必要。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术存在的不足，提供一种消除乳糜干扰的甘胆酸的检测试剂盒，该检测盒检测时间短、抗干扰能力强、稳定性好、重复性好、精确度高、检测灵敏度高。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种消除乳糜干扰的甘胆酸的检测试剂盒，所述试剂R1包含缓冲液a 30～300mmol/L、乳糜消除剂2～10g/L、稳定剂a 1-20g/L、表面活性剂a 5～70mmol/L、反应促进剂a 0.2～10g/L和防腐剂a 0.1～2g/L；pH6.5～8.5。所述试剂R2包含缓冲液b 50～100mmol/L、抗人甘胆酸单克隆抗体的胶乳颗粒、稳定剂b 1-20g/L、表面活性剂b 5～70mmol/L、防腐剂b 0.1～2g/L和反应促进剂b 0.2～10g/L；pH6.5～8.5。所述校准品包含缓冲液c 30～200mmol/L、甘胆酸标准品、稳定剂c 1～20g/L、表面活性剂c 5～70mmol/L、反应促进剂c 0.1～2g/L和防腐剂c 0.2～10g/L；pH6.5～8.5。
作为一种优选的方案，所述乳糜消除剂为辛基甲氧基肉桂酸酯、聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚和聚乙二醇-硫酸菊聚糖镁中的一种或多种。
作为一种优选的方案，所述缓冲液a、缓冲液b和缓冲液c为3-[N,N-二(羟乙基氨基]-2-羟基丙磺酸-氢氧化钠(DIPSO-NaOH)缓冲液、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪丙磺酸-氢氧化钠(HEPPS-NaOH)缓冲液、N-2＝羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸-氢氧化钠(HEPES-NaOH)缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-HCl(Tris-HCl)缓冲液、磷酸盐缓冲液、咪唑缓冲液、甘氨酸缓冲液、巴比妥缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液和GOOD’S缓冲液中的一种或多种。
作为一种优选的方案，所述稳定剂a、稳定剂b和稳定剂c为聚乙二醇、丙三醇、丙二醇、EDTA钠、甘露醇、蔗糖、海藻糖、山梨醇和牛乳血清蛋白(BSA)中的一种或多种。
作为一种优选的方案，所述表面活性剂a、表面活性剂b和表面活性剂c为TWEEN系列(TWEEN-20,TWEEN-40,TWEEN-60,TWEEN-80)，SPAN系列(SPAN-20,SPAN-40,SPAN-60,SPAN-80)，TRITON系列(TRITON-100,TRITON-114,TRITON-405)的一种或多种。
作为一种优选的方案，所述防腐剂a、防腐剂b和防腐剂c为山梨酸钾、苯甲酸钠、亚硝酸钠、2-甲基异噻唑酮盐酸、叠氮钠、硫柳汞、proclin系列(proclin150,proclin 200，proclin 300，proclin 5000)、尼泊金酯(如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸异丙酯、对羟基苯甲酸异丁酯)中的一种或多种。
作为一种优选的方案，所述反应促进剂a、反应促进剂b和反应促进剂c为PEG200～10000或葡聚糖4000～12000。
作为一种优选的方案，所述抗人甘胆酸单克隆抗体的胶乳颗粒为鼠抗人甘胆酸抗体的胶乳颗粒或羊抗人甘胆酸抗体的胶乳颗粒或兔抗人甘胆酸抗体的胶乳颗粒。
作为一种优选的方案，所述抗人甘胆酸单克隆抗体的胶乳颗粒是由抗人甘胆酸单克隆抗体与胶乳颗粒偶联而成，所用的胶乳颗粒为羧化的聚苯乙烯胶乳或氨基化的聚苯乙烯胶乳，孔径50～150nm；羧化的聚苯乙烯胶乳颗粒是一种核壳形式的胶乳，乳核是苯乙烯聚合物，乳壳是苯乙烯、丙烯酸正丁酯、甲基丙烯酸形成的共聚物；所述乳核的粒径在100～150nm，所述乳壳中苯乙烯和丙烯酸正丁酯的重量比为1:1，壳的重量为胶乳颗粒总重的10～30％，甲基丙烯酸的重量为胶乳颗粒总重的1～5％；
抗人甘胆酸单克隆抗体的胶乳颗粒的制备方法，包括以下步骤。
(1)将羧化的聚苯乙烯胶乳放入pH＝5.0～6.5的缓冲液中进行活化。
(2)将抗人甘胆酸的单克隆抗体放入pH＝3.0～4.0的缓冲液中酸化。
(3)将步骤(2)所得溶液用pH＝6.5～8.5的缓冲液反复冲洗至pH值稳定，然后向里加入步骤(1)所得溶液，于37℃反应孵育3～4小时。
(4)将步骤(3)所得溶液用pH＝6.5～8.5的封闭液在37℃封闭2～7小时。
(5)将步骤(4)所得溶液经过离心后，取沉淀用含有稳定剂和防腐剂的缓冲液洗涤分散后即得抗人甘胆酸单克隆抗体的胶乳颗粒。
所述步骤(1)，其特征在于所用缓冲液为PBS缓冲液、MES缓冲液、甘氨酸盐缓冲液中的任何一种，浓度为20～60mmol/L，pH在5.0～6.5之间；
所述步骤(2)，其特征在于所用缓冲液为PBS缓冲液、MES缓冲液、甘氨酸盐缓冲液中的任何一种，浓度为30～100mmol/L，pH在3.0～4.0之间；
所述步骤(3)，其特征在于所用缓冲液为3-[N,N-二(羟乙基氨基]-2-羟基丙磺酸-氢氧化钠(DIPSO-NaOH)缓冲液、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪丙磺酸-氢氧化钠(HEPPS-NaOH)缓冲液、N-2＝羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸-氢氧化钠(HEPES-NaOH)缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-HCl(Tris-HCl)缓冲液、磷酸盐缓冲液、咪唑缓冲液、甘氨酸缓冲液、巴比妥缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液和GOOD’S缓冲液中的任何一种；浓度为30～300mmol/L，pH在6.5～8.5之间。
所述步骤(4)中，所用封闭液为含有0.1～5％BSA的缓冲液，其中所用缓冲液为PBS缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-HCl(Tris-HCl)缓冲液、MES缓冲液中的一种，pH在6.5～8.5之间。
由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1)该发明涉及的检测试剂盒包括试剂R1、R2以及校准品，检测时间短、抗干扰能力强、稳定性好并重复性高。其中所述试剂R1加入了预置乳糜消除剂的缓冲液，可以消除样本中乳糜的干扰。与现有技术中每个样本中单独加入消除剂相比，可以达到快速检测和预防个别样品漏加消除剂的情况。尤其在处理大批次样品时有较高的优势。
2)该试剂盒的乳糜消除剂选择抗辛基甲氧基肉桂酸酯、聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚和聚乙二醇-硫酸菊聚糖镁的一种或多种，稳定性和灵敏性较高，具有较高的重复性。
3)该试剂盒校准品选用的抗人甘胆酸单克隆抗体的胶乳颗粒在制备过程中，加入封闭液，封闭液的加入可以封闭羧化的聚苯乙烯胶乳和抗人甘胆酸的单克隆抗体的未吸附结合的部位，从而减少两者的非特异性结合，提高两者的有效结合率，使得最终形成的抗人甘胆酸单克隆抗体的胶乳颗粒稳定性更好，从而提高试剂盒检测的稳定性和灵敏性。
具体实施方式
下面结合实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1：
一种除乳糜干扰的甘胆酸的检测试剂盒包括包括成分及浓度如下：
试剂R1：pH＝7
试剂R2：pH＝6.5
校准品：
按照需要的甘胆酸参考校准品浓度将相应的甘胆酸纯品分别加入上述缓冲液，得到浓度不同的甘胆酸校准品：0mg/L、2.5mg/L、5.0mg/L、10.0mg/L、20.0mg/L、40.0mg/L、80mg/L。
所述羊抗人甘胆酸单克隆抗体的胶乳颗粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)将羧化的聚苯乙烯胶乳放入pH＝5.0～6.5的PBS缓冲液中进行活化。
(2)将抗人甘胆酸的单克隆抗体放入pH＝3.0～4.0的PBS缓冲液中酸化。
(3)将步骤(2)所得溶液用pH＝6.5～8.5的三羟甲基氨基甲烷-HCl(Tris-HCl)缓冲液反复冲洗至pH值稳定，然后向里加入步骤(1)所得溶液，于37℃反应孵育3～4小时。
(4)将步骤(3)所得溶液用pH＝6.5～8.5的封闭液在37℃封闭2～7小时，所述封闭液为含有0.1～5％BSA的PBS缓冲液。
(5)将步骤(4)所得溶液经过离心后，取沉淀用含有稳定剂和防腐剂的缓冲液洗涤分散后即得羊抗人甘胆酸单克隆抗体的胶乳颗粒。
实施例2：
一种除乳糜干扰的甘胆酸的检测试剂盒包括包括成分及浓度如下：
试剂R1：pH＝8
试剂R2：pH6.5
校准品：
按照需要的甘胆酸参考校准品浓度将相应的甘胆酸纯品分别加入上述缓冲液，得到浓度不同的甘胆酸校准品：0mg/L、2.5mg/L、5.0mg/L、10.0mg/L、20.0mg/L、40.0mg/L、80mg/L。
所述兔抗人甘胆酸单克隆抗体的胶乳颗粒的制备方法，包括以下步骤。
(1)将羧化的聚苯乙烯胶乳放入pH＝5.0～6.5的MES缓冲液中进行活化。
(2)将抗人甘胆酸的单克隆抗体放入pH＝3.0～4.0的MES缓冲液中酸化。
(3)将步骤(2)所得溶液用pH＝6.5～8.5的咪唑缓冲液反复冲洗至pH值稳定，然后向里加入步骤(1)所得溶液，于37℃反应孵育3～4小时。
(4)将步骤(3)所得溶液用pH＝6.5～8.5的封闭液在37℃封闭2～7小时，所述封闭液为含有0.1～5％BSA的MES缓冲液。
(5)将步骤(4)所得溶液经过离心后，取沉淀用含有稳定剂和防腐剂的缓冲液洗涤分散后即得兔抗人甘胆酸单克隆抗体的胶乳颗粒。
实施例3
一、消除乳糜干扰的甘胆酸的检测试剂盒包括包括成分及浓度如下：
试剂R1：pH＝6.5
试剂R2：pH＝6.5
校准品：
按照需要的甘胆酸参考校准品浓度将相应的甘胆酸纯品分别加入上述缓冲液，得到浓度不同的甘胆酸校准品：0mg/L、2.5mg/L、5.0mg/L、10.0mg/L、20.0mg/L、40.0mg/L、80mg/L。
所述鼠抗人甘胆酸单克隆抗体的胶乳颗粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)将羧化的聚苯乙烯胶乳放入pH＝5.0～6.5的MES缓冲液中进行活化。
(2)将抗人甘胆酸的单克隆抗体放入pH＝3.0～4.0的MES缓冲液中酸化。
(3)将步骤(2)所得溶液用pH＝6.5～8.5的咪唑缓冲液反复冲洗至pH值稳定，然后向里加入步骤(1)所得溶液，于37℃反应孵育3～4小时。
(4)将步骤(3)所得溶液用pH＝6.5～8.5的封闭液在37℃封闭2～7小时，所述封闭液为含有0.1～5％BSA的MES缓冲液。
(5)将步骤(4)所得溶液经过离心后，取沉淀用含有稳定剂和防腐剂的缓冲液洗涤分散后即得鼠抗人甘胆酸单克隆抗体的胶乳颗粒。
二、消除乳糜干扰的甘胆酸的检测试剂盒的检测方法及实验参数
分析方法：两点终点法
反应方向：上升方向
校准方式：LOGIT-LOG(4P)或SPLINE
测定波长：450nm
测定温度：37℃
样本：试剂R1：试剂R2：校准品＝5:150:50(单位：ul)
操作方法：将150ul试剂R1加入5ul样本，37℃孵育5分钟后加入50ul试剂R2，1分钟后读取吸光度A1，3分钟后读取吸光度A2。
采用7点定标法，用奥林巴斯AU400全自动生化分析仪进行检测，校准品浓度分别为0mg/L、2.5mg/L、5.0mg/L、10.0mg/L、20.0mg/L、40.0mg/L、80mg/L。
按照上述操作步骤测得本发明甘胆酸校准品的标准曲线，然后取待测样本同样按照上述检测步骤检测样本的吸光度差值，带代入标准曲线，即可计算出待测样本中甘胆酸的含量。如果样本中甘胆酸的浓度超出校准曲线范围，为了保证检测的准确性，需要对样本进行适当稀释后再进行检测。
三、试剂盒检测添加不同浓度乳糜干扰物样本的结果
以上结果显示，随着乳糜浊度从0到8000的范围变化，本发明的试剂盒的检测值偏差的变化较小，检测值偏差均在±10％以内，判定为不存在干扰。
实施例4
一、消除乳糜干扰的甘胆酸的检测试剂盒包括包括成分及浓度如下：
试剂R1：pH＝6.5
试剂R2：pH＝6.5
校准品：
按照需要的甘胆酸参考校准品浓度将相应的甘胆酸纯品分别加入上述缓冲液，得到浓度不同的甘胆酸校准品：0mg/L、2.5mg/L、5.0mg/L、10.0mg/L、20.0mg/L、40.0mg/L、80.0mg/L。
所述鼠抗人甘胆酸单克隆抗体的胶乳颗粒的制备方法，如实施例4。
二、本实施例中采用的甘胆酸检测试剂盒检测样本的方法，同实施例1中“消除乳糜干扰的甘胆酸的检测试剂盒的检测方法及实验参数”。
三、试剂盒检测添加不同浓度乳糜干扰物样本的结果
上述结果显示，随着乳糜浊度从0到8000的范围变化，本发明的试剂盒检测值偏差变化较小，检测值的偏差均在±10％以内，判定为不存在干扰。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。