一种基于固态纳米孔的HIV‑1蛋白酶检测方法与流程

本发明属于精准医疗研究领域，具体涉及一种基于固态纳米孔的HIV-1蛋白酶检测方法。

背景技术：

AIDS是一种跨种属传播的高死亡率疾病，自1981年首次被报道以来，患病人数逐年快速增长，已成为世界第四大死亡原因，严重威胁着人类的身心健康，受到全世界范围的广泛关注。目前，HIV病毒的检测主要有，间接检测，如人体为了对抗病毒而产生的抗体；直接检测，针对HIV及其组成部分，如特定的核酸序列或抗原，直接进行分子识别；或者是HIV-1蛋白酶活性的检测。这些检测方式通常工作量大且耗时，需要标记或者其他复杂设备。作为引起艾滋病的两种病毒之一的主要病毒，HIV-1蛋白酶的存在会大量破坏人体免疫系统中最重要的T淋巴细胞，为了有效地预防和更好地治疗AIDS，本文对HIV-1蛋白酶做了深入的研究。HIV-1蛋白酶是HIV-1病毒复制过程中的关键酶之一，它能裂解病毒颗粒的蛋白前体，使病毒成熟，变成具有感染性的病毒颗粒。

技术实现要素：

为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种基于固态纳米孔的HIV-1蛋白酶检测方法。

为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种固态纳米孔检测系统包括固态纳米孔传感器、盐溶液腔室和电流监测装置。固态纳米孔传感器包括：衬底和复合在所述衬底上的电绝缘薄膜，所述衬底设有背面窗口，电绝缘薄膜与背面窗口顶部相对处刻蚀有纳米孔，背面窗口和纳米孔位于盐溶液腔室内部且连通上部腔室和下部腔室；所述电流监测装置包括电连接的电源、电流计、电极I、电极II，所述电极I、电极II分别位于上部腔室和下部腔室内。

优选地，所述衬底选用硅衬底。

优选地，所述电绝缘薄膜选自氮化硅薄膜、二氧化硅薄膜、石墨烯薄膜或二硫化钼薄膜。

优选地，所述电绝缘薄膜的厚度范围为1nm～100nm。

优选地，所述固态纳米孔的直径大小在1到5纳米内。

优选地，所述固态纳米孔的厚度在5到30纳米内。

优选地，所述固态纳米孔检测系统还包括HIV-1蛋白酶的靶蛋白。

优选地，所述固态纳米孔检测系统还包括阳性对照HIV-1蛋白酶。

本发明的第二方面，提供了前述固态纳米孔检测系统用于检测HIV-1蛋白酶的用途。

本发明的第三方面，提供一种检测HIV-1蛋白酶的方法，为采用固态纳米孔检测系统进行检测，包括：将含有HIV-1蛋白酶的待测样品和HIV-1蛋白酶的靶蛋白加入到固态纳米孔传感器上，使其通过固体纳米孔，检测固体纳米孔的电流信号，进而检测HIV-1蛋白酶。

优选地，检测HIV-1蛋白酶的方法为定性检测或定量检测。

优选地，所述靶蛋白可以为各种艾滋病的病原前体蛋白片段。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

HIV-1蛋白酶是HIV-1病毒复制过程中的关键酶之一，能裂解病毒颗粒的蛋白前体，使病毒成熟，变成具有感染性的病毒颗粒。HIV-1蛋白酶的成功检测对于艾滋病的发现及治疗有着至关重要的作用。本发明采用无需标记与扩增的单分子检测技术，提供一种HIV-1蛋白酶的识别方法。通过检测HIV-1蛋白酶对其靶蛋白的酶切过程发生后，所形成的蛋白质产生的信号的不同，来判断HIV-1蛋白酶的活性及浓度。

附图说明

图1固态纳米孔传感器的结构及制备示意图。

图2采用本发明固态纳米孔检测系统检测HIV-1蛋白酶的示意图。

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

实施例1

一、提供固态纳米孔检测系统

本发明的固态纳米孔检测系统包括固态纳米孔传感器、盐溶液腔室和电流监测装置。固态纳米孔传感器包括：衬底102和复合在所述衬底102上的电绝缘薄膜101，所述衬底102设有背面窗口103，电绝缘薄膜101与背面窗口103顶部相对处刻蚀有纳米孔104，背面窗口103和纳米孔104位于盐溶液腔室内部且连通上部腔室和下部腔室；所述电流监测装置包括电连接的电源、电流计、电极I、电极II，所述电极I、电极II分别位于上部腔室和下部腔室内。

固态纳米孔传感器的结构示意图如图1(a)所示。衬底102可采用硅衬底。电绝缘薄膜101可采用氮化硅薄膜、二氧化硅薄膜、石墨烯薄膜或二硫化钼薄膜等。电绝缘薄膜101的厚度可以从几个纳米到几十个纳米，可通过LPCVD法生长。背面窗口103，通过光刻、刻蚀等标准的半导体工艺制作。固态纳米孔104的直径大小在1到5纳米内。固态纳米孔104的厚度在5到30纳米。固态纳米孔104通过基于电介质击穿的方法获得，电介质击穿的电源可以为电压脉冲或者电流脉冲，脉冲幅值递增、宽度可调。固态纳米孔104的制作过程发生在电解质溶液中，可以是氯化钾或者氯化钠溶液，打孔过程可以施加如图1(b)中所示的幅值递增电流脉冲。

二、采用本发明固态纳米孔检测系统检测HIV-1蛋白酶

采用本发明固态纳米孔检测系统检测HIV-1蛋白酶，如图2所示，采用通过检测HIV-1蛋白酶对其靶蛋白的剪切作用来间接检测HIV-1蛋白酶。如图2(a)和2(b)所示，201代表固态纳米孔传感器中的固态纳米孔104；202可以是任何一种可被HIV-1蛋白酶剪切开来的靶蛋白。205是HIV-1蛋白酶，用来剪切其靶蛋白202，进而产生小蛋白206和207。在没有任何蛋白质(例如，202、206、207)通过固态纳米孔201时，检测获得的电流信号如203所示。当待检样品中只有靶蛋白202通过固态纳米孔201时，检测获得的电流信号如204所示。当待检样品中同时含有HIV-1蛋白酶205和其靶蛋白202时，靶蛋白202会被HIV-1蛋白酶205剪切为两个小的蛋白206和207。因为蛋白长度发生变化，当两个小蛋白206和207通过固态纳米孔201时，会产生两个不同的的电流信号208和209。通过分析204、208、209电流信号的变化可以有效地识别不同蛋白，来实现HIV-1蛋白酶的定性检测。当固态纳米孔传感器中靶蛋白202的加入量固定不变时，其产生的电流信号204的频率也会固定不变；而随着HIV-1蛋白酶205的加入量的变化，其与靶蛋白202发生酶切反应所得到的小蛋白产物206和207的频率也会随之变化，且206和207的频率会随着HIV-1蛋白酶205的加入量的增加而增加，而204的频率会相应的减少。通过探究靶蛋白的电流信号204或小蛋白的电流信号208、209与HIV-1蛋白酶205的浓度的关系，可以根据加入待测样品后得到的电流信号204、208或209的频率来计算样品中HIV-1蛋白酶205的活性和浓度，亦即进行定量检测。

该方法，通过对外周血中HIV-1蛋白酶的含量进行10分钟的检测，可以实现HIV阳性或者阴性的判断。而通过检测HIV-1蛋白酶的活性及浓度，可以判断HIV的感染程度。该方法对HIV-1蛋白酶的检测限为1ng/mL±5％。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。