一种金花菌固态发酵青刺尖茶的制备及其降血脂的产品的制作方法

本发明属于一种“金花菌”固态发酵青刺尖茶的制备及其降血脂的产品。

背景技术：

高血脂症是因体内血脂代谢异常而引发的一种慢性疾病，高血脂是引起人类脂肪肝、动脉粥样硬化性疾病的最主要危险因素之一。临床治疗高血脂症的西药长期服用对人体有一定程度的毒副作用。

青刺尖茶是蔷薇科扁核木属植物青刺尖Prinsepia utilis Royle的嫩茎叶按照绿茶工艺制作的代用茶，青刺尖始载于《滇南本草》。我们的研究发现青刺尖茶提取物具有抑菌作用，也具有降低血脂，青刺尖种籽油有抗缺氧活性。金花菌(冠突散囊菌，Eurotium cristatum)是茯砖茶上的优势菌种，其与茯砖茶的降血脂功效有紧密的联系，有研究表明：“金花菌”能产生淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等酶，同时具有调节脂质代谢、维持血脂水平的生物活性物。但关于“金花菌”发酵青刺尖茶后，提取物的降血脂功效得到加强，该研究尚未见文献报道。

因此，将“金花菌”发酵青刺尖茶的提取物作为功能保健食品或药品的物料，不仅符合绿色健康的理念，也可满足当今社会人们对功能食品或药品多元化的要求，本实验研究将为青刺尖植物的开发利用提供新的依据。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种青刺尖发酵茶及其制备方法。

一种青刺尖发酵茶的制备方法，它包括如下步骤：

(1)取青刺尖茶，加25％—34％重量的水，灭菌，然后冷却到室温；

(2)按照5/300～10/300(v/w)的比例，在青刺尖茶中加入冠突散囊菌孢子混悬液；

(3)25℃-30℃条件下培养5d-12d，干燥，即可。

步骤(1)中，所述青刺尖茶是以青刺尖茎叶为原料，按照绿茶工艺制备而成。

所述青刺尖茶按照如下方法制备：

(1)取青刺尖新鲜嫩茎叶，摊晾4小时-12小时；

(2)100℃热蒸汽杀青20-30秒，风冷却10分钟；

(3)在通入80-95℃热风的条件下，粗揉10-30分钟；摊凉5-10分钟，再揉捻10-20分钟；

(4)60-80℃烘到含水量达5-7％；摊凉冷却，得青刺尖茶；

或者按照如下方法制备：

a、取青刺尖新鲜嫩茎叶，摊晾4小时-12小时；

b、200-300℃杀青5-8分钟；

c、投入杀青叶6kg-8kg，揉捻15-30分钟；

d、100℃-140℃炒干25分钟-30分钟，摊晾15-30分钟，得青刺尖茶。

步骤(1)中，所述灭菌是在121℃下灭菌20min。

步骤(2)中，所述冠突散囊菌孢子混悬液的浓度为1×10⁶～10⁷个/mL。

本发明还提供了前述方法制备得到的青刺尖发酵茶。

本发明还提供了种青刺尖发酵茶的提取物，其特征在于：它是由前述青刺尖发酵茶经乙醇提取得到。

其中，提取的方法为：取青刺尖发酵茶，以料液比1:20加入45％-65％(v/v)的乙醇6000mL，80℃--90℃回流提取25min--45min，过滤，浓缩，即可。

本发明还提供了前述提取物的方法其特征在于：步骤如下：取青刺尖发酵茶，以料液比1:20加入45％-65％(v/v)的乙醇6000mL，80℃--90℃回流提取25min--45min，过滤，浓缩，即可。

本发明还提供了前述青刺尖发酵茶、前述提取物在制备降血脂的功能性食品或药物中的用途。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施实例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1青刺尖茶的制备工艺。

图2各试验组小鼠肝脏组织的病理显微结构(HE染色，x200)。

具体实施方式

下面以实施实例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施实例。

本发明所用的实验材料与仪器如下：

冠突散囊菌(E.cristatum)，即“金花菌”：购自北纳创联生物技术研究院，BNCC146559，即中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏号为CGMCC3.448的冠突散囊菌菌种；

6cr-25型茶叶揉捻机，四川省井研县飞亚机械制造有限公司；35型揉捻机，四川省井研县飞亚机械制造有限公司；α-ASTREE电子舌，法国Alpha MOS公司；安捷伦1260高效液相色谱仪，美国安捷伦有限公司；S-433D氨基酸分析仪，德国Sykam公司；WSL-2比较测色仪，上海昕瑞仪器仪表有限公司；Sartorius BP211D型电子天平，北京塞多利斯仪器系统有限公司；DHG-9240A电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司。

实施例1本发明青刺尖茶的制备

一、制备未发酵的青刺尖茶

按绿茶的炒青或蒸青工艺，制备成青刺尖茶，具体按照如下方法(流程图如图1所示)如下：

(1)取青刺尖新鲜嫩茎叶，摊晾4小时-12小时；

(2)100℃热蒸汽杀青20-30秒，风冷却10分钟；

(3)在通入80-95℃热风的条件下，粗揉10-30分钟；摊凉5-10分钟，再揉捻10-20分钟；

(4)60-80℃烘到含水量达5-7％；摊凉冷却；

(5)得青刺尖蒸青茶。

二、冠突散囊菌种子液的制备

取4℃保存的冠突散囊菌菌种，接种于沙氏液体培养基上，28℃、150r/min摇床培养24h，挑取适量菌丝接种于沙氏斜面培养基中，培养7d后，向斜面试管中加入适量无菌水，反复吹洗斜面，制成孢子悬浮液并转移至100mL无菌三角瓶中，以血球计数板法调节其孢子浓度为10⁶～10⁷个/mL，即得种子液。

三、固态发酵法制备发酵青刺尖茶

青刺尖茶300克放入2500mL三角瓶，加蒸馏水75mL(按25％含水量计算)，在121℃下灭菌20min，然后冷却到室温；

取浓度1.0×10⁶个/mL的冠突散囊菌孢子混悬液10mL，接入上述三角瓶；

放入25℃恒温培养箱中，培养12d，将样品烘干，即可。

实施例2本发明青刺尖茶的制备

一、制备未发酵的青刺尖茶

按绿茶的炒青或蒸青工艺，制备成青刺尖茶，具体按照如下方法(流程图如图1所示)如下：

(1)取青刺尖新鲜嫩茎叶，摊晾4小时-12小时；

(2)滚筒式连续杀青机升温200-300℃，投叶杀青5-8分钟；

(3)投入杀青叶6kg-8kg，揉捻15-30分钟；

(4)滚筒炒干机100℃-140℃，投15kg-20kg揉捻叶，25分钟-30分钟，摊晾15-30分钟；

(5)得青刺尖炒青茶。

二、冠突散囊菌种子液的制备

取4℃保存的冠突散囊菌菌种，接种于沙氏液体培养基上，28℃、150r/min摇床培养24h，挑取适量菌丝接种于沙氏斜面培养基中，培养7d后，向斜面试管中加入适量无菌水，反复吹洗斜面，制成孢子悬浮液并转移至100mL无菌三角瓶中，以血球计数板法调节其孢子浓度为10⁶～10⁷个/mL，即得种子液。

三、固态发酵法制备发酵青刺尖茶

青刺尖茶300克放入2500mL三角瓶，加蒸馏水约100mL(按34％含水量计算)，在121℃下灭菌20min，然后冷却到室温；

取浓度1.0×10⁷个/mL的冠突散囊菌孢子混悬液5mL，接入上述三角瓶；

放入30℃恒温培养箱中，培养5d，将样品烘干，即可。

以下用试验例的方式，说明本发明的有益效果：

实验例1本发明青刺尖发酵茶的制备及其功能\功效

1实验材料

1.1实验动物

雄性昆明小鼠105只，体重18～22g，合格证号：SCXK(川)2013-24，成都达硕实验动物公司提供。

1.2动物饲料

普通饲料(成都达硕实验动物公司)、高脂饲料(配方：基础饲料75％、蛋黄粉15％、猪油10％)。

1.3仪器与设备

TC6010L全自动生化分析仪、TGL-20M台式高速冷冻离心机、Multlskan Mk3型酶标仪、转轮式切片机(徕卡-2016)、TSJ-Ⅱ型全自动封闭式组织脱水机、BMJ-Ⅲ型包埋机、PHY-Ⅲ型病理组织漂烘仪、数码三目摄像显微镜(BA400Digital)、图像分析软件Motic Images Advanced等。

1.4实验材料和主要试剂

青刺尖茶(产地四川盐源县左所乡，采摘的青刺尖茎叶按照绿茶工艺制作)、茯砖茶(中茶湖南安化茶厂有限公司)、血脂康粉(北京北大维信生物科技有限公司)、Mouse Apo-A1ELISA kit(货号：Rm1760XL)、Mouse Apo-B ELISA kit(货号：Rm0743XL)、Mouse LP-a ELISA kit(货号：Rm0742XL，规格：96孔/盒，Abcam公司生产，北京永辉生物科技有限公司进口分装)。

2实验方法

2.1“金花菌”固态发酵青刺尖茶及其提取物的制备方法

“金花菌”固态发酵青刺尖茶：按照实施例1的方法制备的青刺尖发酵茶。

“金花菌”固态发酵青刺尖茶的提取物：称取青刺尖发酵茶300g，以料液比1:20加入45％-65％(v/v)的乙醇6000mL，80℃--90℃回流提取25min--45min，过滤，滤液减压浓缩并定容至500mL，得浓度为60g/mL(以生药计)的提取物，按照灌胃剂量0.3mL/20g制备9.0、6.0、2.0g/kg·bw高、中、低剂量的青刺尖发酵茶提取物混悬液。

青刺尖茶(青刺尖非发酵茶)提取物：用上述提取方法，称取青刺尖茶，按照灌胃剂量0.3mL/20g制备出9.0g/kg·bw的青刺尖茶(青刺尖非发酵茶)的提取物悬液。

2.2小鼠高脂血症模型的建立

小鼠适应性喂养3天，105只小鼠称重后随机分成基础饲料组和高脂饲料组，两组小鼠间体重的差异没有显著性。高脂饲料组90只小鼠饲喂高脂饲料(配方：基础饲料75％、蛋黄粉15％、猪油10％)，其余15只小鼠饲喂普通饲料。28天后，禁食不禁水12h，断尾取血，37℃恒温水浴1h，3000r/min离心15min，分离血清，再测定血清中的胆固醇TC、TG、HDL-C、LDL-C。

2.3实验设计

确定造模成功后，将患高脂血症小鼠随机分成5组：青刺尖“金花菌”发酵茶的提取物高剂量组(9.0g/kg·bw)、中剂量组(6.0g/kg·bw)、低剂量组(2.0g/kg·bw)、青刺尖茶非发酵提取物组(茶青刺尖组，9.0g/kg·bw)、血脂康组(0.3g/kg·bw)与模型组。处理组连续给药28天，空白组和模型组给予等量的蒸馏水，每3天给小鼠称一次体重，调整剂量。末次给药后禁食不禁水12h，先称重，再用戊巴比妥钠麻醉，心脏取血，分离血清方法同2.2。

用SPSS20.0进行数据处理，组间比较用t检验，多重比较采用LSD法。

2.4测定方法

利用全自动生化分析仪测定胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)；通过试剂盒测定载脂蛋白-AI(Apo-AI)，载脂蛋白-B(Apo-B)，脂蛋白A(LP-a)的水平。取血后，剥离小鼠的肝脏后，用生理盐水洗去污血，再用滤纸吸干、称重(计算肝脏指数，肝脏指数＝脏器质量/小鼠质量(g/g))后，按病理检验的SOP程序进行脱水、修剪、包埋、切片、HE染色、封片等，最后镜检。

3结果与分析

3.1高血脂模型小鼠的建立

小鼠经过3天适应性饲养，再用不同饲料处理28天，普通饲料、高脂饲料对小鼠的影响，结果见表1。

表1高脂饲料对小鼠血脂水平、体重增长的影响

注：与普通饲料组比较，#p＜0.05差异显著；##p＜0.01；差异极显著。

从表1可看出：不同饲料处理28天后，与普通饲料组比较，高脂饲料组小鼠的体重增长差异性显著(p<0.05)，而且，TC、TG、HDL-C、LDL-C指标均极显著性升高(p<0.01)，表明小鼠高血脂症模型建立成功。

3.2青刺尖发酵茶提取物对高血脂小鼠血脂的影响

灌胃期间各组小鼠取食正常，毛洁白而具光泽，无排稀便现象。灌胃28天后，青刺尖发酵茶提取物对高血脂症小鼠血脂水平的影响，结果见表2。

表2青刺尖发酵茶提取物对高血脂症小鼠血脂水平的影响

注：与空白组比较，#p＜0.05，差异显著；##p＜0.01，差异极显著。

与模型组比较，*p＜0.05，差异显著；**p＜0.01，差异极显著。

与阳性组比较，△p＜0.05，差异显著；△△p＜0.01，差异极显著。

与青刺尖茶组比较，■p＜0.05，差异显著；■■p＜0.01，差异极显著。表3，表4同。

从表2可看出：与模型组(高血脂小鼠组)比较，青刺尖“金花菌”发酵茶提取物的低、中和高3个剂量组小鼠血清中TC、TG、HDL-C和LDL-C的含量均降低，其中，低剂量组的TC、TG含量均有显著的差异(p<0.05)，中剂量组的TC、TG含量有极显著的差异(p<0.01)；低、中和高剂量组的HDL-C含量均具有极显著差异(p<0.01)；低剂量组的LDL-C含量有显著的差异(p<0.05)，而中剂量组的LDL-C含量有极显著的差异(p<0.01)。现代医学认为：血清LDL-C含量的升高容易导致冠心病、动脉粥样硬化等的发生，而血清HDL-C含量的升高有助于降低TG，防止冠心病、动脉粥样硬化等的发生。

与青刺尖茶组比较，青刺尖发酵茶提取物的低、中和高剂量组小鼠血清中的TC、TG、LDL-C含量均有降低，其中，高剂量组的TC、TG达到显著差异(p＜0.05)，青刺尖发酵茶提取物的中、高剂量组小鼠血清中HDL-C的含量均比青刺尖茶组高。与阳性组比较，青刺尖发酵茶提取物的低、中和高3个剂量组小鼠的血清指标差异性都不显著。

上述试验结果说明：青刺尖发酵茶的提取物具有降低高血脂小鼠血清中TC、TG、HDL-C和LDL-C含量的功能，其与血脂康相当，而高剂量组降低TC、TG的功能比青刺尖茶的强，且有显著差异(p＜0.05)，说明本发明发酵工艺可以显著提高青刺尖茶的降脂功效。

3.3青刺尖发酵茶提取物对高血脂小鼠血清Apo-AI、Apo-B和LP-a的影响

青刺尖茶经过“金花菌”的发酵，其提取物对高血脂小鼠血清Apo-AI、Apo-B和LP-a的影响，结果见表3。

表3青刺尖发酵茶提取物对高血脂小鼠血清Apo-AI、Apo-B及LP-a的影响

由表3可知：与模型组比较，青刺尖发酵茶提取物的低、中和高剂量组的血清Apo-AI浓度均高于模型组，中剂量组达极显著(p<0.01)，高剂量组显著(p<0.05)；青刺尖发酵茶提取物的低、中和高剂量组的Apo-B浓度均低于模型组，中剂量组达极显著(p<0.01)，低、高剂量组的差异显著(p<0.05)；各剂量组Apo-B/Apo-AI的值均低于模型组，中剂量组的差异显著(p<0.05)；各剂量组LP-a浓度均低于模型组。

与青刺尖茶组比较，青刺尖发酵茶提取物的中、高剂量组小鼠血清中的Apo-AI浓度均高，其中，中剂量组达到显著(p<0.05)；青刺尖发酵茶提取物的中等剂量组Apo-B浓度显著(p<0.05)低于青刺尖茶提取物组；青刺尖发酵茶提取物低、中和高剂量组的Apo-B/Apo-AI值均低于青刺尖茶提取物组；青刺尖发酵茶提取物中、高剂量组的LP-a均低于青刺尖茶提取物组。

与阳性组比较，青刺尖发酵茶提取物各剂量组的血清Apo-AI、Apo-B和LP-a浓度差异均不显著。

现代医学研究认为：血清Apo-AI与HDL-C呈明显正相关，可代表HDL-C水平，而血清HDL-C含量的升高有助于降低TG，防止冠心病、动脉粥样硬化等的发生；血清Apo-B与血清LDL-C水平呈明显正相关，主要代表LDL-C的水平，血清LDL-C含量的升高容易导致冠心病、动脉粥样硬化等的发病；高Lp-a是冠心病的危险因素之一。

上述试验结果说明：青刺尖发酵茶的提取物降低高血脂小鼠血脂的功能，可能是通过升高血清Apo-AI(载脂蛋白AI)的浓度，从而增加了血清的HDL-C(高密度脂蛋白胆固醇)的含量，同时，也降低血清Apo-B(载脂蛋白B)的浓度，而降低了血清的LDL-C(低密度脂蛋白胆固醇)的含量，而且LP-a的浓度也降低。与青刺尖茶比较，青刺尖发酵后的提取物升高Apo-AI和降低Apo-B的能力都明显增强，还可能具有降低血清LP-a的能力，且有显著差异(p＜0.05)，说明本发明发酵工艺可以显著提高青刺尖茶的降脂功效。

3.4青刺尖发酵茶对小鼠体重及肝脏指数的影响

连续灌胃28天后，青刺尖发酵茶提取物对小鼠体重及肝脏指数的影响，结果见表4。

表4青刺尖发酵茶提取物对小鼠体重及肝脏指数的影响

由表4可知：与空白组比较，模型组体重有一定的增长，但差异不显著，模型组的肝脏指数的升高差异极显著(p<0.01)；青刺尖发酵茶提取物的低、中和高剂量组体重增长量均极显著(p<0.01)降低；青刺尖发酵茶低、中和高剂量组、青刺尖茶组和阳性组的肝脏指数，与空白组比较差异均不显著。

与模型组比较，青刺尖发酵茶提取物组的体重增长量、肝脏指数两项指标均降低，体重增长量降低的差异性达极显著(p<0.01)，低、中剂量组肝脏指数的差异性达极显著(p<0.01)，高剂量组的差异性显著(p<0.05)。

与青刺尖茶组比较，青刺尖发酵茶提取物低、中和高剂量组的肝脏指数差异均不显著，但是，低剂量组的体重增长量显著(p<0.05)的低于青刺尖茶组。

3.5青刺尖发酵茶对小鼠肝脏组织的影响

青刺尖发酵茶对小鼠肝脏组织的影响，肝脏组织病理显微结构，见图2。

由图2可知，空白组小鼠肝小叶结构完整，未见增生及假小叶形成，小叶中央静脉未见淤血，肝细胞未见变性及坏死，也未见肝细胞增生、纤维化，肝细胞内及细小胆管内无胆汁淤积；模型组小鼠肝小叶结构欠清，肝细胞可见中度弥漫性水肿变性，可见脂肪变性；青刺尖发酵茶提取物低、中剂量组小鼠肝小叶结构清晰，肝索呈放射状排列，可见散在脂肪小滴肝细胞及轻度水肿变性；青刺尖发酵茶提取物高剂量组、青刺尖茶组及阳性组的水肿程度都较低、中剂量组轻，可见极少散在脂肪小滴肝细胞。

从小鼠肝脏的病理切片可知：青刺尖茶经“金花菌”发酵后，其高剂量组的肝脏组织只有极少、散在的脂肪小滴，肝细胞病变程度较低，说明青刺尖发酵茶具有控制高血脂小鼠肝脏发生脂肪积累的功效。

4结论

实验研究结果表明，经过“金花菌”发酵的青刺尖茶提取物，处理高血脂小鼠28天后，其体重增长量明显低于空白组和模型组，呈一定的剂量效应。与高脂模型组比较，青刺尖发酵茶提取物组的体重增长量、肝脏指数两项指标均降低，体重增长量降低极显著，低、中剂量组肝脏指数的降低极显著，高剂量组的降低显著。与青刺尖茶组比较，青刺尖发酵茶提取物低剂量组的体重增长量降低显著；但是，低、中和高剂量组肝脏指数的差异均不显著。

青刺尖发酵茶的提取物具有降低高血脂小鼠血清中TC、TG、HDL-C和LDL-C含量的功能，其与血脂康相当，而高剂量组降低TC、TG的功能比青刺尖茶的强。

青刺尖发酵茶的提取物降低高血脂小鼠血脂的功能，可能是通过升高血清Apo-AI(载脂蛋白AI)的浓度，从而增加了血清的HDL-C(高密度脂蛋白胆固醇)的含量，同时，也降低血清Apo-B(载脂蛋白B)的浓度，而降低了血清的LDL-C(低密度脂蛋白胆固醇)的含量，而且LP-a的浓度也降低。与青刺尖茶比较，青刺尖发酵后的提取物升高Apo-AI和降低Apo-B的能力都明显增强，还可能具有降低血清LP-a的能力。与青刺尖茶相比，青刺尖发酵茶可有效降低TC、TG和LDL-C水平，同时控制HDL-C的过度增高。

从小鼠的肝脏病理切片看，青刺尖茶经“金花菌”发酵后，其高剂量组小鼠的肝脏组织只有极少、散在的脂肪小滴，肝细胞病变程度较低，且与阳性组无显著差异，说明青刺尖发酵茶具有控制高血脂小鼠肝脏发生脂肪积累性肝病变的功效。

综上所述，经过“金花菌”的发酵后，青刺尖发酵茶的提取物具有良好控制高血脂小鼠体重增长、降低血脂各项指标、控制肝脏脂肪积聚的功效，且效果显著优于未经发酵的青刺尖茶，说明本发明发酵工艺可以显著提高青刺尖茶的降脂功效。

本发明的青刺尖发酵茶，有效成分含量高，可以有效控制高血脂，青刺尖茶发酵后比不发酵的青刺尖茶有更好的效果，因此，青刺尖发酵茶具有更好的应用前景。