一株降解氯氰菊酯金花菌的筛选鉴定及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一株从茯砖茶中筛选出的对氯氰菊酯具有较高降解能力的菌株ET1，属于生物【技术领域】。该菌株ITS基因序列在GenBank数据库中的登录号为KF317836，经形态学及ITS序列分析被鉴定为冠突散囊菌（Eurotium?cristatum），为无毒有益菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2013年10月08日，保藏编号：CGMCC?No.8293。该菌株还对其它拟除虫菊酯类农药有一定降解作用，并能降解其有毒中间产物（3-苯氧基苯甲酸）。该菌株不仅可用于被拟除虫菊酯类农药所污染的茯砖茶及茶叶，也可用于土壤、污水的生物修复或生物净化，保护生态环境，进而保障农产品安全。
【专利说明】一株降解氯氰菊酯金花菌的筛选鉴定及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，具体涉及一株降解氯氰菊酯“金花菌”的筛选鉴定及其应用。
【背景技术】
[0002]氯氰菊酯(Cypermethrin, CY)是拟除虫菊酯类农药中最常用品种之一,其广泛应用于茶树、果蔬、人畜等虫害的防治。由于其具有疏水性强、对光热稳定等特性，因此自然降解速率慢，在环境中半衰期长达94.2 d-1103 d，易导致其在环境中残留蓄积，因此其在土壤、水体、农畜产品中常出现较高的检出率和超标率。氯氰菊酯对鱼类及其他水生动物有高毒性，其还能在动植物体内蓄积，对神经系统有急性毒性，并能损伤男性生殖系统发育，长期接触还可能引发多种慢性疾病，美国环境保护局已将其认定为一种致癌剂。
【发明内容】
[0003]拟除虫菊酯类农药作为目前最有发展前景的杀虫剂，在尚未找到新型替代化合物之前，未来几十年内仍将被广泛使用，因而迫切需要研究残留农药的降解。微生物降解是各种农药降解方法中较为绿色和高效的一种。目前氯氰菊酯降解菌主要以细菌为主，报道的具有降解氯氰菊酯的真菌不多，而真菌又是一类潜在的农药降解菌，其氧化酶系对多种芳香族类化合物、杀虫剂、染料等异生化合物具有较强的降解能力，有研究还指出真菌对某些顽固异生化合物的降解效果优于细菌。现阶段氯氰菊酯降解真菌的分离均来源于农药厂污泥，而源于发酵食品或发酵醅能降解氯氰菊酯的有益真菌少见报道。
[0004]茯砖茶上长有大量金黄色颗粒，俗称“金花”，即“金花菌”(goiden flowerfungus)，在分类上属于冠突散囊菌，它是茯砖茶中的优势有益菌，也是茯砖茶独特风味的主要影响因素。长年饮用茯砖茶有调理肠胃、促进消化、降血糖、降血脂、增强人体体质及延缓衰老等功效，而这些功效 与“金花菌”的作用是密不可分的。现阶段国内外对茯砖茶中“金花菌”的研究主要集中在“金花菌”的分类鉴定及其发酵特性等方面，而对于其能否降解农药的研究尚未见报道。近年来拟除虫菊酯类农药在茶树栽培中的大量施用，导致茶叶中拟除虫菊酯类农药的残留问题较为严重，所以，“金花菌”对于农药降解方面的研究与应用具有重要意义。
[0005]本专利是从湖南省生产的十余种不同品牌的茯砖茶中分离、筛选出的一株可较高效降解氯氰菊酯的菌株，经ITS测序鉴定，采用Blast进行基因同源性比对分析表明，菌株ETl的ITS序列与登录号JX869560等冠突散囊菌有99%的相似性，也有相似的系统发育关系。根据菌株ETl的形态学特征和ITS序列比对，将该菌株鉴定为冠突散囊菌{EurotiumCristatumYirW0经过试验可知该菌株在F1D培养基中7d内对50 mg/L氯氰菊酯的降解率为53.35%。动力学研究表明，该菌株在测试的底物(氯氰菊酯)质量浓度、温度、pH范围内，氯氰菊酯的半衰期为7.11~8.98d，远远低于其自然半衰期(94.2 d-1103 d)。此外，菌株ETl对50 mg/L溴氰菊酯、氰戊菊酯、氟氯氰菊酯和氯菊酯7d降解率分别为27.53%,38.00%、33.23%和25.34%。充分说明该菌株作为有益菌株不仅在茯砖茶生产上具有应用价值，并且在处理含拟除虫菊酯类农药污染的茶叶生产及土壤和水体生物修复方面具有很好的应用潜力。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一株可降解氯氰菊酯的菌株一冠突散囊菌{Eurotiumcristatum, “金花菌”)及其应用。
[0007]本发明所提供的降解菌株经鉴定为冠突散囊菌(Jkirotium cristatum),俗称“金花菌”，编号为ETl，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2013年10月08日，保藏编号=CGMCC N0.8293。
[0008]本发明所提供的降解菌株cristatum ETl的形态学特性:菌株ETl在PDA平板上菌落呈不规则的圆形，随着培养时间的延长，菌落直径逐渐长大，培养5d后菌落直径达45.0mm，菌落表面粗糙，菌落边缘呈乳白色，向外延伸呈放射状，由外到内颜色逐渐加深，中间呈黑褐色，可见菌株ETl产黑褐色色素，并且色素能渗透到培养基中。
[0009]本发明所提供的降解菌株的分离、筛选、鉴定。
[0010]取不同茯砖茶样品，用茶刀将茶砖从中间切开，采用直接分离法用接种针挑取茶样表面的金黄色颗粒点接到PDA平板上，30°C倒置培养，待长出“金花菌”菌落后从中挑取进行平板划线培养。重复划线培养3-4次至纯化，4°C斜面保存备用。
[0011]在无菌条件下将分离纯化的“金花菌”分别从试管斜面上用无菌孢子稀释液(配方:吐温80 0.2%，琼脂0.1%，蒸馏水IOOmL)洗下，转移至盛有IOOmL无菌孢子稀释液的250mL锥形瓶中，充分振荡混匀，并调节孢子浓度约为6.0X IO8个/mL，于4°C保存备用。分别将孢子悬液按5% (v/v)接种量接种于装有30mL H)培养基(含氯氰菊酯50mg/L)的250mL三角瓶中，另设接种相同量的孢子稀释液为空白对照，30°C，180r/min振荡培养7d,测定各培养液中氯氰菊酯的残留质量浓度，确定各菌株对氯氰菊酯的降解能力，从中筛选出较高效的氯氰菊酯降解菌。
[0012]菌株形态鉴定:菌落近圆形，菌落表面粗糙，菌落边缘呈乳白色，向外延伸呈放射状，由外到内颜色逐渐加深，中间呈黑褐色，产色素；个体形态鉴定:菌株ETl的孢子类型由有性型和无性型组成；菌株ETl的有性结构为子囊果，即黄色闭囊壳，子囊果呈球形或近球形，子囊果容易破裂释放出子囊，子囊内一般含有8个子囊孢子，子囊破裂释放出子囊孢子；菌株ETl的无性结构为菌丝和顶囊，菌丝为有隔菌丝，顶囊呈球形或烧瓶型，产分生孢子。
[0013]菌株ETl分子遗传学鉴定。
[0014]菌株ETl经ITS序列测定，获得如下序列: GGACCTCTGGGTCAACCTCCCATCCGTGTCTATCTGTACCCTGTTGCTTCGGCGTGGCCACGGCCCGCCGGA
GACTAACATTTGAACGCTGTCTGAAGTTTGCAGTCTGAGTTTTTAGTTAAACAATCGTTAAAACTTTCAACAACGGA
TCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAA·GAACGCAGCGAAATGCGATAATTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATC
GAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCA
CGGCTTGTGTGTTGGGCTTCCGTCCCTGGCAACGGGGACGGGCCCAAAAGGCAGTGGCGGCACCATGTCTGGTCCTC
GAGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCCCGTAGGTCCAGCTGGCAGCTAGCCTCGCAACCAATCTTTTTAACCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAA
该菌株的ITS基因测序结果与GenBank数据库中序列进行Blast同源性比对，该菌株序1^与Eurotium crisiaiw?菌株基因序列高度同源,得到登录号为KF317836。
[0015]本发明所提供的降解氯氰菊酯的菌株ETl是从不同茯砖茶中分离、筛选得到的，根据形态学特征和ITS基因序列分析被鉴定为冠突散囊菌{Eurotium cristatum)。该菌株在一定温度和PH范围内均对氯氰菊酯有降解能力，保藏于于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2013年10月08日，保藏编号:CGMCC N0.8293。
[0016]本发明所用培养基为:马铃薯蔗糖培养基(PD):新鲜马铃薯去皮切块300g，蔗糖20g，蒸馏水1000mL,调节pH至6.0 ;固体培养基在液体培养基中再加20g/L琼脂，121 °C，灭菌 20min。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1为降解菌株ETl培养5d的菌落培养特征。
[0018]图2为降解菌株ETl的细胞形态图一子囊果。
[0019]图3为降解菌株ETl的细胞形态图一子囊和子囊孢子。
[0020]图4为降解菌株ETl的细胞形态图一菌丝和顶囊。
[0021]图5为温度对降解菌株ETl降解氯氰菊酯速率的影响。
[0022]图6为pH值对降解菌株ETl降解氯氰菊酯速率的影响。
[0023]图7为底物质量浓度对降解菌株ETl降解氯氰菊酯速率的影响。
【具体实施方式】
[0024]实例1:确定氯氰菊酯降解菌株ETl的生长情况与氯氰菊酯降解的关系。
[0025]I)菌种活化:挑取降解氯氰菊酯的菌株ETl至H)液体培养基中，30°C，180r/min摇床振荡培养4d;然后连续划线于PDA平板、挑取单菌落培养两次(30 V )4d，挑取单菌落至PDA斜面30 V培养4d备用；2)用无菌生理盐水洗下斜面上菌体并调整孢子浓度为6.0 X IO8个/mL，制成种子液。
[0026]生长曲线的测定:将降解菌株ETl的种子液按5%接种量接种于含有50mg/L氯氰菊酯的H)液体培养基中，分装30 mL/250mL锥形瓶，30°C、180r/min振荡培养8d，取样时间为每24h取样I瓶，将样品过滤，得菌丝球，于80°C干燥至恒重，以菌体干重、代表其生物量。
[0027]降解曲线的测定:将降解菌株ETl的种子液按5%接种量接种于含有50mg/L氯氰菊酯的H)液体培养基中，分装30 mL/250mL锥形瓶，设接种5%无菌水为空白对照，30°C、180r/min振荡培养8d,取样时间为每24h取样I瓶,米用全量取样的方式，即取整瓶培养液作为分析样品，测定其对氯氰菊酯的降解率。
[0028]将整瓶培养液，加入30mL乙腈，超声(40kHz，300W)辅助提取30min，移取2.0mL提取液用乙腈定容至IOmL,混匀，12000r/min离心IOmin,上清液用有机相滤膜(0.45 μ m)过滤，弃去初滤液，取续滤液用于HPLC检测。色谱条件:色谱柱为Gemini IOOA (:18柱(5.0μ m, 150 mm X4.60 mm (1.d.));流动相为乙腈和超纯水(76: 24 (v/v));检测波长210nm ;柱温 25°C ;流速 1.0 mL/min ;进样量 10 μ L。[0029]由结果可知降解菌株ETl经过8d培养，除去对照组氯氰菊酯的损失部分，实验组中53.35%氯氰菊酯被菌株ETl降解，培养7d内，氯氰菊酯与降解菌株生长呈正相关，菌株对氯氰菊酯降解速率较快，培养7d菌体生物量达到最大，此后菌体生长趋于稳定，降解速率也随之减缓。
[0030]实例2:降解菌株ETl对氯氰菊酯的降解特性。
[0031]I)培养温度对菌株ETl降解氯氰菊酯速率的影响按5.0% (v/v)的接种量，将菌株种子液(6.0X IO8个/mL)接种于氯氰菊酯浓度为50 mg/L的H)液体培养基(pH6.0)中，分装30 mL/250 mL锥形瓶，于不同温度下(25 °C, 30 °C, 35 °C ) 180 r/min振荡培养，间隔24h取样。用[0023]所述方法测定氯氰菊酯降解率。
[0032]2) pH对菌株ETl降解氯氰菊酯速率的影响按5.0% (v/v)的接种量，将菌株种子液(6.0X108个/mL)接种于不同pH (5.0，6.0，7.0)的氯氰菊酯浓度为50 mg/L的PD液体培养基中，分装30 mL/250 mL锥形瓶，30°C，180 r/min振荡培养，间隔24h取样。用
[0023]所述方法测定氯氰菊酯降解率。
[0033]3)底物浓度对菌株ETl降解氯氰菊酯速率的影响按5.0% (v/v)的接种量，将菌株种子液(6.0XlO8个/mL)接种于氯氰菊酯质量浓度不同的H)液体培养基(pH6.0 ; 20mg/L，50 mg/L, 100 mg/L)中，分装 30 mL/250 mL 锥形瓶，30°C、180 r/min 振荡培养，间隔24h取样。用[0023]所述方法测定氯氰菊酯降解率。
[0034]菌株ETl对氯氰菊酯的降解特性结果:在测试的培养温度、PH值、底物(氯氰菊酯)质量浓度范围内，氯氰菊酯半衰期为7.11~8.98d，远远低于其自然降解半衰期(94.2 d-1103d)，随着底物质量浓度的降低，氯氰菊酯的降解速率加快，降解率增高，7d内对20mg/L氯氰菊酯降解率可达63.5% ;温度在25°C~35°C范围内，菌株ETl对氯氰菊酯降解率的变化相对不大；在PH5 -7范围内，pH对底物降解率的影响相对较小，在pH6时，菌株对氯氰菊酯的降解速率相对较高。这一研究结果可为菌株ETl应用于茯砖茶的生产以及污水处理和土壤修复提供一定的数据参考。
[0035]实例3:氯氰菊酯降解菌株ETl对其降解中间产物3-苯氧基苯甲酸的降解效果。
[0036]将降解菌株的种子液按5%接种量接种于50mg/L3_苯氧基苯甲酸的H)液体培养基中，分装30 mL/250mL锥形瓶，设接种5%无菌水为空白对照，30°C、180r/min振荡培养7d，采用全量取样的方式，即取整瓶培养液作为分析样品，测定其对3-苯氧基苯甲酸的降解率。
[0037]将整瓶培养液，加入30mL乙腈，超声(40kHz，300W)辅助提取30min，移取2.0mL提取液用乙腈定容至IOmL,混匀，12000r/min离心IOmin,上清液用有机相滤膜(0.45 μ m)过滤，弃去初滤液，取续滤液用于HPLC检测。色谱条件:色谱柱为Gemini IOOA C18柱(5.0ym,150mm X4.60mm);流动相为乙腈和pH 2.5的磷酸去离子水溶液，体积比为55:45，流速
0.7mL/min,检测波长210nm，柱温25°C，进样量10 μ L。
[0038]测定结果表明，去除对照组3-苯氧基苯甲酸的损失部分，实验组中3-苯氧基苯甲酸可被菌株ETl完全降解。
[0039]实例4:氯氰菊酯降解菌株ETl对其它拟除虫菊酯类农药的降解效果。
[0040]将降解菌株ETl的种子液按5%接种量接种于50mg/溴氰菊酯、氰戊菊酯、氟氯氰菊酯和氯菊酯的H)液体培养基中，分装30 mL/250mL锥形瓶，设接种5%无菌水为空白对照，30°C、180r/min振荡培养。
[0041]培养7d后取样，用[0023]所述方法测定其降解情况，去除对照组的损失部分，实验组中溴氰菊酯、氰戊菊酯、氟氯氰菊酯和氯菊酯的降解率分别为:27.53%、38.00 %、33.23% 和 25.34%ο
[0042]实例5:氯氰菊酯降解菌株ETl对被污染的土壤中氯氰菊酯的降解效果。
[0043]从四川省雅安市名山区某茶园土壤中取一定量的土壤样品，添加氯氰菊酯使其浓度约为20mg/kg，将降解菌株ETl的种子液按5%接种量接种(实验组)，设接种5%无菌水为空白对照，30°C培养，每24h取样，用[0023]所述方法采用HPLC检测。
[0044]通过HPLC检测样品中氯氰菊酯的残留量，空白样品内氯氰菊酯含量变化较小，实验组的样品在7d时氯氰菊酯的降解率可达41.83%。
[0045]实例6:氯氰菊酯降解菌株ETl对茶叶样品中氯氰菊酯的降解效果。
[0046]从四川省雅安市某茶店购买一定量的黑毛茶，添加氯氰菊酯使其浓度约为20mg/kg,将降解菌株ETl的种子液按5%接种量接种(实验组)，设接种5%无菌水为空白对照，30°C培养，每24h取样，用[0023]所述方法检测。
[0047]通过HPLC检测样品中氯氰菊酯的残留量，空白样品内氯氰菊酯含量变化较小，实验组的样品在7d时氯氰菊酯的降解率可达60.5%，若再延长发酵时间，将会进一步提高降解率。据报道，茶叶中农药的实际污染量较高时也仅有几个mg/kg，茯砖茶的发酵周期一般在15天左右，因此，可以推测用菌株ETl制作茯砖茶时，可将残留农药完全降解。
[0048]以上的实例仅仅是对本发明的实施方式进行描述，而并非对本发明的范围进行限定，对于本领域的技术人员来说，可以对上述说明进行改进或变形，但所有的这些改进或变形均应落入本发明的权利要求确定的保护范围。
【权利要求】
1.一株冠突散囊菌crisiaiw?),俗称“金花菌”,其特征在于保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.8293，保藏日期2013年10月08日。
2.权利要求1所述冠突散囊菌ETl{Eurotium cristatum),其特征在于:(I)个体形态特征:真菌，由有性结构和无性结构组成，有性结构为子囊果，呈球形或近球形，子囊果容易破裂释放子囊及子囊孢子，无性结构为菌丝和顶囊，菌丝为有隔菌丝，顶囊呈球形或烧瓶型，产分生孢子；(2)菌落特征:在PDA平板上菌落呈不规则的圆形，随着培养时间的延长，菌落直径逐渐长大，培养5d后菌落直径达45.0mm,菌落表面粗糙，菌落边缘呈乳白色，向外延伸呈放射状，由外到内颜色逐渐加深，中间呈黑褐色，可见菌株ETl产黑褐色色素，并且色素能渗透到培养基中；(3) ITS序列特征:该菌株的ITS基因测序结果与GenBank数据库中序列进行Blast同源性比对,该菌株序列菌株基因序列高度同源，得到登录号为KF317836。
3.权利要求1-2所述冠突散囊菌ETl在降解氯氰菊酯中的应用。
4.根据权利要求3所述的冠突散囊菌ETl的应用，其特征在于，降解组合条件为:温度25-35°C, pH=5.0-7.0。
5.根据权利要求3所述的冠突散囊菌ETl的应用，其特征在于，降解组合条件为:温度300C，pH=6.0,接种量5%，装液量30mL，摇床转速180r/min。
6.根据权利要求3所述的冠突散囊菌ETl的应用，该菌株可用于多种拟除虫菊酯类农药的生物降解，同时可降解氯氰菊酯的降解中间产物3-苯氧基苯甲酸，以及这些物质污染的茯砖茶及茶叶的生物降解和土壤、水体的生物修复或生物净化，保护生态环境，进而保障农产品安全。`
【文档编号】B09C1/10GK103627641SQ201310541152
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年11月5日 优先权日:2013年11月5日
【发明者】不公告发明人 申请人:四川农业大学