一种连续检测细菌生长曲线的装置和方法与流程

本发明涉及微生物检测领域，具体涉及一种细菌浓度和生长状态的测量装置和方法。

背景技术：

当细菌在适宜的环境条件下培养时，以培养的时间为横座标以细菌数量变化为纵坐标，根据细菌数量变化与相应时间变化之间的关系作出一条反应细菌在培养期间菌数变化规律的曲线这种曲线称为生长曲线。它反映了单细胞微生物在一定环境条件下于液体培养时所表现出的群体生长规律。

使用分光光度计，用500～600nm光波，透过比色皿中的细菌菌液，测量该光束的透射光束光强。朗伯比尔定律(Beer-Lambert Law)认为光被透明介质吸收的比例与入射光的强度无关，在光程上每等厚层介质吸收相同比例值的光。通过朗伯比尔定律。可以计算细菌菌液的OD值，细菌菌液的浓度与细菌测量OD值在一定范围内呈正相关，例如在OD值为0.05～0.5的范围内。所以可以根据经验值换算细菌菌液的浓度。

传统的细菌生长状态测量方法是在锥形瓶培养细菌，按照设计的时间点，每隔十几分钟，从细菌培养瓶中取样，放到比色皿中，用分光光度计测量细菌的OD值，通过测定一些列时间点的OD值，从而观察细菌生长状态。现有技术中，CN102749516B中公开了一种食品中微生物生长曲线自动测绘的方法，该方法使用压电体声波传感器避免双电层电容的影响，提高了电信号的稳定性，增强了信噪比。CN104931443A公开了一种测定黄酒酵母生长曲线的方法。

传统的细菌生长状态测量方法虽然操作简单，但是也存在一定问题：

一、容易在取样时引入其他细菌污染，造成实验失败；

二、取样十分耗时间，耗人力；

三、测量时间的可控性差：手工测量无法长时间，例如大于二十四小时；同时由于测量一个样品至少需要10～20min，使得很短时间间隔测量细菌的OD值也无法及时测量；

四、条件对结果存在影响，实验重复性不好：室温跟细菌培养温度有温差时，取样会对细菌生长造成很大影响，细菌样品受到影响，该样品的细菌生长检测的准确值也会受到影响。

五、对于需在特殊条件培养的细菌，例如厌氧细菌或高温条件下，也无法通过手工测量细菌的生长状态。

本申请发明人提出了一项新的发明来克服现有技术的缺点，所述新发明是一种关于细菌浓度和生长状态的测量方法和装置，特别是属于在无干扰状态下和其他特殊培养条件下，连续测量细菌的浓度，从而动态实时监测和研究细菌生长状态的方法和装置。

技术实现要素：

为解决现有技术中的上述不足，本发明提供了一种连续检测细菌生长曲线的装置和方法，本发明采用以下技术方案：

一种连续检测细菌浓度的装置，包括：检测单元模块，用于对含有或未含有细菌的溶液区域部分进行检测，生成测量值；传感器数据线和/或激光器控制线，用于数据传输；单片机控制平台，用于控制一个或多个检测单元模块，并对生成的测量值进行记录；第一无线数据通信模块，用于数据信息输出；第二无线数据通信模块，用于接收第一无线数据通信模块的数据信息；和终端数据处理设备。

在本发明的一个实施例中，检测单元模块包括：激光器，用作光源；数字式光强检测传感器，用于测量透射激光束的光强度并转换为数字信号，信号传输到单片机控制平台；细菌培养光学玻璃器皿固定槽；和细菌培养光学玻璃器皿。其中，单片机控制平台(3)控制激光器(8)稳定间隔输出激光，激光束透过细菌培养光学玻璃器皿(11)，照射到数字式光强检测传感器(9)上，数字式光强检测传感器(9)检测出激光的光强并将光强度转换为数字信号，信号通过传感器数据线和/或激光器控制线(2)传输到单片机控制平台(3)上，单片机控制平台(3)随时间分别记录一组或多组检测单元模块(1)的光强度信息，然后通过第一无线数据通信模块(4)和第二无线数据通信模块(5)传输到终端数据处理设备(6)。

在一个实施例中，数字式光强传感器为自带把光信号转换为数值的仪器，原理是通过光能改变光敏电阻阻值，测量电流经过光敏电阻从而获得电信号，然后再通过AD转换器，把电信号转化为数字信号。

优选的，本发明涉及的装置还包括细菌培养光学玻璃器皿密封塞和/或细菌菌液。

更优选的，本发明涉及的检测单元模块数目为2-10个。

在本发明的一个实施例中，连续检测细菌菌液的OD值范围为0.01-0.5之间，优选的，所述细菌菌液的OD值是指待测样品的吸光度与参照样品的吸光度的差值。

优选的，所述终端数据处理设备为电脑。

在本发明的一个实施例中，选择波长为635nm的激光器作为光源。

本发明涉及的装置，可以在在无干扰条件下以及其他特殊条件测量细菌菌液浓度随时间的变化，从而监测细菌的生长状态。优选的，可以选择放置在有氧条件、无氧或厌氧培养条件、密闭恒温培养箱，密封或不密封摇床，密闭二氧化碳培养箱和高温培养箱组成的组中的任一项。

同时，本发明还涉及一种使用本发明涉及的装置连续检测细菌浓度的方法，其特征在于包括如下步骤：

步骤一：将待测样品或参照样品放入细菌培养光学玻璃器皿中，将细菌培养光学玻璃器皿固定于细菌培养光学玻璃器皿固定槽；

步骤二：设定了检测时间和/或检测时间间隔；

步骤三：检测单元模块开始工作，激光器通电并预热2s后，激光束穿透细菌培养光学玻璃器皿，照射到数字式光强检测传感器上，数字式光强检测传感器测量透射激光束的光强度并转换为数字信号，信号传输到单片机控制平台并转换成光强度A。

步骤四：为了减少测量误差，每隔0.5s测量一个数值，连续测量3次并取平均值I；

步骤五：检测单元模块测量后关闭激光，避免长时间激光照射细菌。平均值I以及该时间记录在单片机控制平台中，并通过无线数据通信模块之间的数据传递，将数据传输到终端数据处理设备；

优选的，第N个检测单元模块检测过程中，第N+1个检测单元模块激光已经开始预热；并且当第N个检测单元模块测量完成后，第N+1个检测单元模块立即开始测量，其中，N为正整数。

在本发明的一个实施例中，数字信号就是指光的强度这个数值。

在本发明的一个有关上述方法的实施例中，检测时间间隔为10s到600s，优选的为15s到20s。

在本发明另一个有关上述方法的实施例中，该方法能够长时间连续测定细菌浓度；

优选的总测量时间不小于7天；

更优选的，总测量时间不大于20天；和/或，总测量时间不少于2个小时。

同时，本发明还涉及装置在检测细菌浓度以及生长状态方面的应用。

本发明的有益效果包括但不限于：

1、本发明能够同时精确、可靠地连续长时间测定多个样品的细菌在无外界干扰情况和需特殊培养条件下的生长状态，并且获得大量精确数据，拟合细菌生长速率，节省研究人员的时间和人力。

2、本发明装置使用了无线数据传输模块传输数据到终端，以达到可把检测单元放置在特殊密闭环境中，例如二氧化碳培养箱，恒温摇床等环境。

3、传统测量方法最短也只能在10～20min时间间隔内测量一个样品的细菌浓度，本发明能够在很短时间间隔15～20s内测定细菌浓度，而且本发明装置的测量时间间隔可调，可适应不同的应用需求。

4、本发明控制平台连接终端电脑，实时输出细菌浓度值，为实时监控细菌生长状态提供了可用的手段。

5、本发明装置能够长时间连续测定细菌浓度，总测量时间可大于7天，根据使用者需求，可以进行更长时间的测量。

6、本发明装置测量的细菌菌液OD值，测量结果精准度高。

定义:

术语“吸光度”定义为光线通过溶液或某一物质前的入射光强度与该光线通过溶液或物质后的透射光强度比值的以10为底的对数。

术语“无干扰状态”定义为细菌在特制的光学玻璃器皿生长，测量时用透气或不透气塞封口，能够在隔绝外界污染条件下，根据实际需求对细菌进行正常透气，或不透气培养。

术语“OD值”定义为光密度(optical density)的缩写，表示被检测物吸收掉的光密度，是检测方法里的专有名词，检测单位用OD值表示。

除非另有说明，本发明的实施将采用分子生物学、微生物学、细胞生物学和生物化学的常规技术，这落入本领域技术范围内。这样的技术在文献中有充分的说明，例如：《分子克隆实验指南》，第2版，Sambrook等人，1989；Oligonucleotide Synthesis，MJ Gait编辑，1984；Animal Cell Culture，R.I.Freshney编辑，1987；Methods in Enzymology，Academic Press，Inc.；Handbook of Experimental Immunology，第4版，D.M.Weir&CC.Blackwell编辑，Blackwell Science Inc.，1987；GeneTransfer Vectors for Mammalian Cells，J.M.Miller&M.P.Calos编辑，1987；Current Protocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel等人编辑，1987；以及PCR：The Polymerase Chain Reaction，Mullis等人编辑，1994。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

图1：一种连续检测细菌浓度或生长状态的装置的主要结构和组成模块；

图2：检测单元模块的结构和组成；

图3：手工测量和应用本发明分别检测细菌OD值；

图4：手工测量和应用本发明分别检测金色葡萄糖球菌生长曲线，(A)使用手工测量的方法每隔20min测量金色葡萄糖球菌的生长曲线，(B)使用本发明的方法和设备每隔15s测量金色葡萄糖球菌的生长曲线，测量总时间是4小时；

图5：手工测量和应用本发明分别检测大肠杆菌的生长曲线，(A)使用手工测量的方法每隔20min测量大肠杆菌的生长曲线，(B)使用本发明的方法和设备每隔15s测量大肠杆菌的生长曲线，测量总时间都是10小时；

图6：使用本发明的方法和设备多检测单元模块同时测量大肠杆菌细菌的生长曲线；(A)表示同时测量的10个样品中的一个样品，生长曲线代表一个检测单元模块测量大肠杆菌的生长曲线，测量时间间隔15s；(B)表示同时测量的10个样品中的一个样品，生长曲线代表一个检测单元模块测量大肠杆菌的生长曲线，测量时间间隔15s；(C)表示同时测量的10个样品中的一个样品，生长曲线代表一个检测单元模块测量大肠杆菌的生长曲线，测量时间间隔15s；(D)表示同时测量的10个样品中的一个样品，生长曲线代表一个检测单元模块测量大肠杆菌的生长曲线，测量时间间隔15s，测量总时间是24小时。图中，1.检测单元模块，2.传感器数据线和/或激光器控制线，3.单片机控制平台，4.第一无线数据通信模块，5.第二无线数据通信模块，6.终端数据处理设备，7.特殊培养环境，8.激光器，9.数字式光强检测传感器，10.细菌培养光学玻璃器皿固定槽，11.细菌培养光学玻璃器皿，12.细菌培养光学玻璃器皿密封塞，13.细菌菌液。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

在下述每一实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司购得：本发明实施例涉及的主要材料如下：

金黄色葡萄球菌(ATCC 29213)；

无菌M9培养基:7.1g/L Na2HPO4，3.4g/L KH2PO4，0.58g/L NaCl，1g/L NH4Cl，0.4％(w/v)Glucose，0.2mM CaCl2，5mM MgSO4；

胰蛋白胨大豆肉汤培养基：Tryptic Soy Broth(TSB)T8907(Sigma)30g/L；

分光光度计GENESYS 10S UV-VIS(Thermo SCIENTIFIC，美国)；

单片机控制系统采用Arduino平台BlunoMega256(DFRobot,上海)。

实施例1：细菌OD值的测定

细菌的OD值是指吸光度的差值，样品的吸光度与参照样品的吸光度差值。吸光度是指是指光线通过溶液或某一物质前的入射光强度与该光线通过溶液或物质后的透射光强度比值的以10为底的对数，使用的原理为朗伯比尔定律(Bouguer-Lambert-Beer law)：

其中，A:吸光度；k:光吸收率；d:光程，细菌培养光学玻璃器皿厚度(液层厚度)；C:样品浓度；I₀:初始透射光强度；I:透射光强度。OD值的计算方法为：

其中，A_t0:纯清培养基吸光度；A_t:接种细菌后菌液的吸光度；I₀:初始透射光强度；I_t0:纯培养基透射光强度；I_t:接种细菌后时间t菌液的透射光强度；

细菌OD值的测定首先需要用本发明测量纯清培养基，在接种细菌前(t₀时间)溶液的透射光强度I_t0，然后测量接种细菌后t时间，细菌菌液的透射光强度I_t，根据公式3，计算出细菌浓度的OD值。通过一系列时间点的OD值，可以制作细菌生长曲线。

实施例2：细菌OD值的测定装置

一种连续检测细菌浓度或生长状态的装置，包括：检测单元模块1，用于对含有或未含有细菌的溶液区域部分进行检测，生成测量值；传感器数据线和/或激光器控制线2，用于数据传输；单片机控制平台3，用于控制一个或多个检测单元模块1，并对生成的测量值进行记录；第一无线数据通信模块4，用于数据信息输出；第二无线数据通信模块5，用于接收第一无线数据通信模块4的数据信息；和终端数据处理设备6，如图1所示。

其中，检测单元模块1包括：激光器8，用作光源；数字式光强检测传感器9，用于测量透射激光束的光强度并转换为数字信号，信号传输到单片机控制平台3；细菌培养光学玻璃器皿固定槽10；和细菌培养光学玻璃器皿11；细菌培养光学玻璃器皿密封塞12；和细菌菌液13，如图2所示。

单片机控制平台3控制激光器8稳定间隔输出激光，激光束透过细菌培养光学玻璃器皿11，照射到数字式光强检测传感器9上，数字式光强检测传感器9检测出激光的光强并将光强度转换为数字信号，信号通过传感器数据线和/或激光器控制线2传输到单片机控制平台3上，单片机控制平台3随时间分别记录一组或多组检测单元模块1的光强度信息，然后通过第一无线数据通信模块4和第二无线数据通信模块5传输到终端数据处理设备6。

实施例2：细菌OD值的测定方法

将待测样品或参照样品放入细菌培养光学玻璃器皿11中，将细菌培养光学玻璃器皿11固定于细菌培养光学玻璃器皿固定槽10；设定了检测时间和/或检测时间间隔；第一个检测单元模块开始工作，激光器8通电后发出激光束，激光束穿透细菌培养光学玻璃器皿11，照射到数字式光强检测传感器9上，数字式光强检测传感器9测量透射激光束的光强度并转换为数字信号，信号传输到单片机控制平台3并转换成光强度A。为了减少测量误差，每隔20ms测量一个数值，连续测量3次并取平均值I；第一个检测单元模块测量后关闭激光，避免长时间激光照射细菌。平均值I以及该时间记录在单片机控制平台中，并通过无线数据通信模块之间的数据传递，将数据传输到终端数据处理设备6。激光器通电预热3s，所有检测模块的激光器同时预热3s。第一个检测单元模块整个测量过程大概需要0.2s-0.6s，在这个过程中，第二个检测单元模块激光已经开启，并且当第一个检测单元模块测量3次完成后，第二个检测单元模块立即开始3次测量。如此类推到下一个检测单元模块。共设置10个模块，10个模块完成一次测量时间一般不超过10s，所以时间间隔只需要大于检测单元的模块数至少1s，本实施例优选15s。

实施例4：细菌菌液OD值检测装置和方法准确性的评价

对照：使用实验室常用的细菌浓度测量仪器分光光度计测量样品的OD值；

实验组：使用本发明细菌菌液OD值检测装置和方法测量同一样品的OD值。

通过对对照组和实验组进行检测，测量一系列不同OD值的样品，得到的结果做相关性分析，从而评价本发明的测量结果的准确性以及与传统精密仪器测量值的对应性。

具体实验方法，包括以下步骤：

1、将大肠杆菌E.coli BL21(DE3)培养过夜，用培养基按12个不同的稀释度稀释，制取12个不同OD值得菌液样品。

2、对照组：使用Thermo分光光度计GENESYS 10S UV-VIS，测量12个样品的OD值。

3、实验组：使用本发明装置和方法检测上述12个样品的OD值：首先放入M9纯清培养基到细菌培养光学玻璃器皿11中，把细菌培养光学玻璃器皿11，例如比色皿，插入到检测单元模块中的细菌培养光学玻璃器皿固定槽10，开始测量透射光强度I_t0；

取出比色皿，去除纯清培养基，放入菌液样品，重新把细菌培养光学玻璃器皿11放入细菌培养光学玻璃器皿固定槽10中，检测样品菌液的透射光强I_t；

根据公式3计算该样品菌液浓度OD值；

清洗比色皿，放入下一个样品，重复上述测量过程；

4、针对对照组，以Thermo分光光度计测量结果为x值；针对实验组，本发明测量结果为y值作图，并拟合，计算两种测量方法的相关性，结果如图3所示。

从结果可以看到，Pearson相关系数r＝1，线性拟合R2＝0.999，两种方法测量结果具有很强相关性，说明在OD＝0.05～0.5范围内，本发明的测量结果能达到通用分光光度计的测量准确度和精度。但是，使用本方法具有明显的时间优势，可以高效准确的完成上述检测。

实施例5：细菌生长状态准确性的评价

对照：使用实验室常用的细菌浓度测量仪器分光光度计观察革兰氏阳性菌金色葡萄糖球菌ATCC 29213的生长状态；

实验组：使用本发明的装置和方法观察革兰氏阳性菌金色葡萄糖球菌ATCC 29213的生长状态。具体步骤包括：

1、细菌培养光学玻璃器皿11和胰蛋白胨大豆肉汤培养基高温灭菌，细菌培养光学玻璃器皿密封烘干备用；

2、革兰氏阳性菌金色葡萄糖球菌ATCC 29213活化过夜；

3、在细菌培养光学玻璃器皿11中加入5mL纯清培养基，海绵塞密封避免污染，然后把细菌培养光学玻璃器皿11，例如比色皿，放入检测单元模块中，测量样品培养基透射光强度I_t0；

4、取一定量菌液，按照1:50体积比接种到细菌培养光学玻璃器皿11中；把细菌培养光学玻璃器皿11放入检测单元模块中，设定检测时间间隔20s，该时间间隔为默认设定，恒温摇床温度设定为37℃，摇速为180r.p.m，通过终端电脑连接控制平台，输入第3步测量结果I_t0，建立数据记录文件，并点击开始测量。每测量一个时间点，使用实施例1得方法计算该时间点的菌液浓度OD值；

5、同时使用传统的手工测量方法，把菌液按照1:50体积比接种到灭菌锥形瓶中，放入恒温中培养；

6、手工测量方法每隔20min，从锥形瓶中取出1mL菌液，用Thermo GENESYS 10S UV-VIS分光光度计测量菌液浓度OD值。

对两种方法获得的结果进行分析，以时间为X轴，OD值为Y轴作图，并拟合数据的平滑曲线，如图4所示。

从结果可以看到，对比传统的手工测量方法，本发明可以在很短的时间间隔进行测量，测量数据点多，测量误差较小，拟合的生长曲线较平滑，符合标准的生长曲线模型。

实施例6：细菌生长状态准确性的评价

对照：使用实验室常用的细菌浓度测量仪器分光光度计观察革兰氏阴性菌大肠杆菌E.coli BL21(DE3)的生长状态；

实验组：使用本发明的装置和方法观察革兰氏阴性菌大肠杆菌E.coli BL21(DE3)的生长状态。具体步骤包括：

1、细菌培养光学玻璃器皿11和M9培养基灭菌处理，细菌培养光学玻璃器皿11密封烘干备用；

2、大肠杆菌E.coli BL21(DE3)活化过夜；

3、在细菌培养光学玻璃器皿11中加入5mL纯清培养基，海绵塞密封避免污染，然后把细菌培养光学玻璃器皿11，例如比色皿，放入检测单元模块中，测量样品培养基透射光强度I_t0；

4、取一定量菌液，按照1:50体积比接种到细菌培养光学玻璃器皿11中；把细菌培养光学玻璃器皿11放入检测单元模块中，设定检测时间间隔60s，恒温摇床温度设定为37℃，摇速为180r.p.m，启动终端电脑连接控制平台，输入第3步测量结果I_t0，建立数据记录文件，并点击开始测量。每测量一个时间点，使用实施例1所述方法计算细菌浓度OD值；

5、同时使用传统的手工测量方法，把菌液按照1:50体积比接种到灭菌锥形瓶中，放入恒温中培养；

6、手工测量方法每隔20min，从锥形瓶中取出1mL菌液，用Thermo GENESYS 10S UV-VIS分光光度计测量菌液浓度OD值。

两种方法的结果使用编写的软件进行分析，以时间为X轴，OD值为Y轴作图，并拟合数据的平滑曲线，如图5所示。

从结果也可以看到，对比传统的手工测量方法，本发明在测量时间间隔上具有很大优势，工作量少，测量精准度高，拟合的生长曲线较平滑，更加符合标准的生长曲线模型。

实施例7：多检测单元模块长时间测量厌氧条件下大肠杆菌E.coliBL21(DE3)的生长状态

1、细菌培养光学玻璃器皿11和M9培养基灭菌处理，细菌培养光学玻璃器皿密封烘干备用；

大肠杆菌E.coli BL21(DE3)活化过夜；

在培养光学玻璃器皿中加入5mL纯清培养基，海绵塞密封避免污染，然后把细菌培养光学玻璃器皿11，例如比色皿，放入检测单元模块中，测量样品培养基透射光强度I_t0；

2、每个检测单元模块的样品按照上述步骤所述的进行操作；

3、取一定量菌液，按照1:50体积比接种到培养光学玻璃器皿中；

4、把细菌培养光学玻璃器皿放入检测单元模块中设定检测时间间隔20s(默认设定)，装置放入二氧化碳恒温摇床中，恒温摇床温度设定37℃，摇速为180r.p.m，通过终端电脑连接控制平台，输入上述测量结果I_t0，建立数据记录文件，并点击开始测量。每测量一个时间点，软件计算该时间点的菌液浓度OD值；

5、每个检测单元模块测量培养基初始透射光强I_t0，重新放入细菌培养光学玻璃器皿11后和设定了检测时间后，开始测量。

6、每个检测单元模块激光依次通电，同时每检测单元模块依次测量菌液的透射光强I_t，一当该检测单元模块样品测量完成后，激光器8立即关闭。当所有检测单元模块测量完成后，单片机Arduino控制平台把所有检测检测单元模块样品数据整合起来并通过蓝牙无线传输至电脑；

7、与上一次测量间隔15s后，进行下一轮的测量，重复上述步骤；

8、24小时测量完成后，传输到终端数据处理设备进行分析处理，图6中显示了四个检测单元模块的结果。

需要注意，细菌浓度过高时，溶液中的颗粒数过多，这时不符合朗伯比尔定律，测量的OD值与细菌菌液浓度不再高度线性相关，只能定性反应细菌菌液浓度。合适的测量范围是OD＝0.01～0.5，而通常实验室使用的分光光度计合适测量范围也是OD＝0.01～0.5。由此可见，本发明和传统方法相比，两者的测量范围是一样的，但是本发明可以实现自动化，并且可以在极端条件测量细菌的生长状态。而传统方法是手动测量，十分耗时间和耗人力。由此可见，本发明所述方法可以有效的替代传统的测量方法。

结果可以看到，本发明测量结果精准度高，重复性好，一次能进行多个样品测量，能够大大减少工作量。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。