一种利用叶绿素荧光技术筛选耐高温玉米品种的方法与流程

本发明属于玉米品种选育及评价技术领域，涉及一种利用叶绿素荧光技术筛选耐高温玉米品种的方法，尤其是涉及一种应用叶绿素荧光技术考察玉米离体叶片的叶绿素荧光参数从而筛选出耐高温玉米品种的方法。

背景技术：

全球变暖已成为不争的事实，IPCC第四次评估报告显示，过去100年全球地面温度升高了0.74℃，预测本世界末气温将增加1.1-6.4℃。在全球气候变暖背景下，1951-2009年，中国平均温度上升了1.38℃，变暖速率达到0.23℃/10年，与全球变暖趋势一致。《中国应对气候变化国家方案》(2007)指出：未来我国气候变暖趋势将进一步加剧，与2000年相比，2020年年平均温度可能将升高1.3-2℃，2050年将升高2.3-3.3℃。

2015年3月21日，世界气象组织发布2015年气候状况声明，声明称受人类活动和强厄尔尼诺的影响，2015年全球温度屡破纪录，高温热浪侵袭全球多国，多地温度创新高。2015年是自有现代观测以来最热的年份，比1961-1990平均值高出约0.76℃。热浪、暴雨、极度干旱和热带气旋等极端天气增多。其中93％的余热被释放到海洋中，海洋温度明显升高，海平面上升突破新纪录，这一气候趋势还将在2016年持续。2015年12月12日，全球195个国家通过了具有历史意义的全球气候变化新协议《巴黎协定》，这一协议成为历史上首个关于气候变化的全球性协定。根据协定，各方同意把可持续发展的要求和消除贫困的努力相结合，加强对气候变化威胁的全球应对，将全球平均气温升幅与前工业化时期相比控制在2℃以内，并继续努力争取把温度升幅限定在1.5℃之内，以大幅减少气候变化的风险和影响。中国科学家利用区域气候模式(RCM)对中国未来气候进行预估，结果表明：本世纪末中国冬季、夏季和年平均气温将较本世纪初分别上升3.6℃、3.8℃和3.5℃，未来中国大部分地区日最高和最低气温将显著升高，极端天气和高温事件呈增加趋势。

玉米是世界第一大农作物，黄淮海地区是我国最大的玉米产区，随着全球气候变暖，高温胁迫对玉米的影响日益突出，35℃高温是田间危害玉米生长常出现的高温。光合作用是作物产量形成的基础，也是对高温最为敏感的生理反应之一，在其他高温诱导的伤害症状出现之前，光合作用已经受到高温的抑制。玉米属喜温作物，在生长发育过程中需要相对较高的温度，但温度过高会对玉米的光合作用过程、光合产物积累和产量形成造成不良影响。高温会破坏光系统Ⅱ(PSⅡ)，致使PSⅡ部分失活及光合电子传递以分子态氧为受体的支路反应增加，抑制光合代谢中的电子供应，明显降低PSⅡ的光能转化效率和光合电子传递效率，导致光合器官损伤从而抑制光合作用。

高温对光系统Ⅱ的破坏可以通过叶绿素荧光参数的变化反映出来。在高温(热)胁迫下，植物体内叶绿素蛋白复合体发出的荧光可以作为热诱导引起的膜流动性和稳定性变化的敏感指标，研究高温胁迫下作物光合生理反应。叶绿素荧光与光合作用各个反应过程紧密相关，任何逆境胁迫对光合作用各过程产生的影响都可通过叶绿素荧光参数变化反映出来。当环境条件改变时，叶绿素荧光参数的变化在一定程度上可以反映环境因子对植物的影响，作为逆境条件下植物抗逆响应的指标。该技术对探讨非生物胁迫下植物光合生理机制及品种选育具有重要意义。叶绿素荧光参数可作为光合作用的有效指标，检测植物光化学活性的所有过程。能够在不影响植物正常生长的条件下，快速准确反映植物的光合生理状况。植物叶绿素效率分析仪(Handy PEA，Hansatech，英国，以下简称PEA仪)通过测定叶片光合作用过程中光系统对光能的吸收、传递、耗散、分配等参数，从而获得较为丰富的植物光合作用信息，为深入研究植物光合作用和选育优良品种提供依据。该技术具有测定快速且损伤小的特点，研究开发该技术可为育种工作者深入研究植物光合作用及选育优良品种提供相对迅速、简洁信息。

但是，植物叶绿素效率分析仪测定叶片叶绿素荧光参数时会产生很多个参数，其中可作分析的参数有47个，包括：Tf(max)、Area、Fo、Fm、F1、F2、F3、F4、F5、Fo/Fm、Fv/Fo、dV/dto、dVG/dto、Vj、Vi、PHI(Po)、PSIo、PHI(Eo)、PHI(Do)、Sm、N、Sm/T(fmax)、Sum K、Kn、Kp、ABS/RC、TRo/RC、ETo/RC、DIo/RC、RC/CSo、ABS/CSo、TRo/CSo、ETo/CSo、DIo/CSo、RC/CSm、ABS/CSm、TRo/CSm、ETo/CSm、DIo/CSm、SFI(abs)、10RC/ABS、PHIo/(1-PHIo)、PSIo/(1-PSIo)、PI(abs)、PI(cso)、PI(csm)、D.F.等，不同指标的意义、数值大小、量纲不同。全部分析工作量太大。究竟哪些参数能够反映植物光合作用耐高温的能力尚不清楚，耐高温的指标是什么也没有相关标准。这对于叶片荧光参数在品种光合耐高温潜力筛选中的应用是个重要障碍，限制了玉米高光效品种的选育。一旦遇到高温，导致玉米光合作用下降，严重减产。前人研究多用Fo(初始荧光)、Fv/Fm(最大光化学速率)、ETO/CS(单位面积电子传递的量子产额)和DIo/CS(单位面积的热耗散)等参数来鉴定品种在逆境下光合器官活力的变化。但一直未能确定一个有效的参数和测量方案作为衡量玉米叶片耐高温性状的指标和方法。

表1：PEA相关叶绿素荧光参数的含义

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有玉米耐高温能力检测和评价技术的不足，通过研究不同温度、不同生育期、离体与活体条件下玉米叶片的叶绿素荧光参数，在47个荧光参数中筛选出11种数据：Fo、TRo/CS、ABS/CS、Fm、Fv、Fv/Fm、ETo/CS、PI(abs)、DIo/CS、RC/CSo，再进一步对11个参数分析发现，高温条件下，不同品种叶片的PI(abs)差异明显，该性能指数能够准确反映高温逆境胁迫对光合作用的影响。从而提供了一种利用叶绿素荧光技术快速鉴定光合作用耐高温(光合作用耐高温是指在高温逆境下光合作用效率降低效果较小)玉米品种的技术，选择PI(abs)作为筛选叶片抗高温的高光效玉米品种的主要检测指标，快速鉴定玉米叶片耐高温逆境的潜力。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种利用叶绿素荧光技术筛选耐高温玉米品种的方法，以PI(abs)作为筛选玉米耐高温玉米品种的检测指标，对离体叶片进行高温黑暗处理，获得高温黑暗处理前后的待测玉米品种叶片的PI(abs)，将待测玉米品种的PI(abs)与对照品种的PI(abs)，PI(abs)高于对照品种的待测玉米品种即为耐高温玉米品种；或在白天日最高温度35℃及以上的晴天，待天黑暗1小时后，测定田间待测玉米品种活体叶片的PI(abs)，将待测玉米品种的PI(abs)与对照品种的PI(abs)，PI(abs)高于对照品种的待测玉米品种即为耐高温玉米品种；或在玉米生育期内每7天测定1次田间待测玉米品种PI(abs)值，当待测玉米品种的PI(abs)全生育期的平均值高于或等于对照品种全生育期的PI(abs)的平均值，该待测玉米品种即为耐高温玉米品种。

具体选自下述任一一种方法，或者方法(1)与方法(3)的结合，或者方法(2)与方法(3)的结合，或者方法(1)、方法(2)与方法(3)的结合：

(1)、在玉米小喇叭口至大喇叭口期，选取玉米上部叶片，在中部1/2处横向剪取上部叶片，在黑暗环境、室温下测定玉米叶片的PI(abs)；再将叶片置于恒温箱内35-40℃下高温黑暗处理30分钟，取出叶片在黑暗环境、室温下测定PI(abs)；每个待测玉米品种取3张以上叶片，在每个叶片上选取3个以上区域进行测量；计算出在高温处理前后PI(abs)的平均值；在相同的测定条件下，测定对照品种的高温处理前后PI(abs)的平均值；分别比较待测玉米品种与对照品种高温处理前后PI(abs)的平均值，PI(abs)的平均值高于对照品种的待测玉米品种即为叶片光合作用能力强、耐高温的玉米品种。

(2)、在玉米小喇叭口至大喇叭口期，选择白天日最高温度35℃及以上的晴天，在天黑暗1小时后，测定田间玉米上部叶片的PI(abs)，每个品种测定不少于10株，连续测定不少于3次，每次间隔5天，取平均值；在相同的测定条件下，测定对照品种PI(abs)的平均值；比较待测玉米品种与对照品种PI(abs)的平均值，高于对照品种的待测玉米品种即为叶片光合作用能力强、耐高温的玉米品种。

(3)、从3叶期开始至成熟期结束，天黑暗半小时后，测定田间玉米上部叶片的PI(abs)，每个品种每次测定不少于10株，取平均值；每7天测定1次，获得全生育期(即从3叶期开始至成熟期)的PI(abs)平均值，获得PI(abs)值的变化趋势；在相同的测定条件下，测定对照品种全生育期的PI(abs)平均值；比较全生育期的待测玉米品种与对照品种PI(abs)的平均值，待测玉米品种全生育期的PI(abs)平均值高于或等于对照品种全生育期的PI(abs)平均值，该待测玉米品种即为叶片光合作用能力强、耐高温的玉米品种。此方法在田间不出现35℃以上高温的情况下，是鉴定不同品种叶片光合能力的有效方法。

所述的玉米叶片为功能正常、无损伤的玉米叶片，表现为：叶片形态挺直，叶色均一鲜艳，无明显虫咬和病害痕迹。

方法(1)中，优选玉米倒4叶作为测定对象；每个待测玉米品种取3-10张叶片，在每个叶片上选取3个区域进行测量；

剪取获得的上部叶片用湿纱布包裹，保持湿度为70％左右，装入自封袋，置于遮光泡沫箱内密闭，在1小时内带回实验室处理。

方法(1)中，高温黑暗处理的温度优选为35℃；高温黑暗处理前后的叶片在同一温度下测定PI(abs)。

方法(2)中，优选玉米倒4叶作为测定对象。优先选择倒4叶中部作为测定区域。

每个品种测定10株，连续测定3次，每次间隔5天，取平均值。

方法(3)中，优选玉米倒4叶作为测定对象。优先选择倒4叶中部作为测定区域。

测定时间优选为每天20:00。

所述的对照品种为郑单958品种，郑单958品种的叶片耐高温及产量性状最稳定，推广面积最大。

本发明所述的室温是指室内实时温度，一般在25-28℃。

和现有技术相比，本发明的有益效果：

1、本项发明克服了荧光参数的变量太多，分析工作量太大，难以将荧光参数用于玉米及其它作物育种的难题。相比其他育种方法，本发明方法具有测量快速、损伤小、节约劳力和财力等特点，适合从大量品种选育优良玉米品种，具有较好的应用前景。育种过程中，根据PI(abs)值可以对大量的玉米自交系、杂交种进行筛选，多种条件下的荧光参数PI(abs)值可以准确反映叶片耐高温的功能。2、确定了35℃作为玉米叶片荧光参数耐高温测定的指标，克服了筛选过程中高温标准缺乏的问题。也克服了设置过多温度，带来测定与分析工作量太大的问题。3、活体叶片与离体叶片相结合，在田间无高温逆境时，可以采集叶片在实验室进行35℃高温处理，发现品种间的差异与田间测定趋势一致。4、可以对大量材料进行高通量筛选，因为测定每个样品仅需要3-4秒钟。5、天气条件基本不影响测定，晴天、阴天均可以测定。6、确定玉米小喇叭口至大喇叭口期为荧光参数PI(abs)值的最佳测定时期。7、种植密度基本不影响玉米植株上部叶片在高温下的PI(abs)值。可采用常规种植密度(每亩5000株)作为测定材料的种植密度。8、确定郑单958可以作为测定对照。

附图说明

图1为六合试验点玉米品种在不同温度处理下初始荧光Fo变化；

图2为淮安试验点玉米品种在不同温度处理下初始荧光Fo变化；

图3为六合试验点玉米品种在不同温度处理下单位面积捕获光能TRo/CS变化；

图4为淮安试验点玉米品种在不同温度处理下单位面积捕获光能TRo/CS变化；

图5为六合试验点玉米品种在不同温度处理下反应中心吸收光能ABS/CS变化；

图6为淮安试验点玉米品种在不同温度处理下反应中心吸收光能ABS/CS变化；

图7为六合试验点玉米品种在不同温度处理下可变荧光Fv变化；

图8为淮安试验点玉米品种在不同温度处理下可变荧光Fv变化；

图9为六合试验点玉米品种在不同温度处理下最大荧光Fm变化；

图10为淮安试验点玉米品种在不同温度处理下最大荧光Fm变化；

图11为六合试验点玉米品种在不同温度处理下反应中心数量RC/CSo变化；

图12为淮安试验点玉米品种在不同温度处理下反应中心数量RC/CSo变化；

图13为六合试验点玉米品种在不同温度处理下最大光化学速率Fv/Fm变化；

图14为淮安试验点玉米品种在不同温度处理下最大光化学速率Fv/Fm变化；

图15为六合试验点玉米品种在不同温度处理下电子传递速率ETO/CS变化；

图16为淮安试验点玉米品种在不同温度处理下电子传递速率ETO/CS变化；

图17为六合试验点玉米品种在不同温度处理下热耗散DIo/CS变化；

图18为淮安试验点玉米品种在不同温度处理下热耗散DIo/CS变化；

图19为六合试验点玉米品种在不同温度处理下性能指数PI(abs)变化；

图20为淮安试验点玉米品种在不同温度处理下性能指数PI(abs)变化；

图21不同温度处理下性能指数PI(abs)变化；

图22为高温期性能指数PI(abs)的变化；

图23为2016年六合试验点全生育期玉米品种PI(abs)荧光参数趋势；

图24为2016年六合试验点玉米全生育期气温变化；

图25为灌浆期不同种植密度玉米不同叶位Fo变化；

图26为灌浆期不同种植密度下玉米不同叶位叶片Fv/Fm变化；

图27为灌浆期玉米不同种植密度不同叶位PI(abs)变化；

图28为灌浆期不同密度玉米不同叶位叶片ETo/ABS变化。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明的技术方案做进一步说明，实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1

玉米叶片叶绿素荧光参数测定

六合试验点，2015年6月16日10:00左右，20个处于扬花期的玉米品种，将功能正常、无损伤的倒四叶在中部1/2处横向剪断，取上部叶片；叶片包湿纱布以保持一定湿度，装入自封袋，置于泡沫箱内密闭，迅速带回实验室暗适应30分钟；黑暗环境、室温(25℃)下，利用植物叶绿素效率分析仪(Handy PEA，Hansatech，英国)测定叶绿素荧光参数，再在35℃恒温箱内暗处理30分钟后再于黑暗环境、室温(25℃)下测定玉米叶片叶绿素荧光参数；导出叶绿素荧光参数，分析每个参数的变化；其中，每个玉米品种剪取9张叶片，每叶片测3个区域，取平均值作为对应品种的叶绿素荧光参数。

淮安试验点，在玉米灌浆期测定叶绿素荧光参数，其中，室温为28℃，高温处理温度为40℃，其他处理方法与六合试验点相同。

表1：2015年种植玉米品种名

分析不同温度处理下叶绿素荧光参数，尤其是Fo(初始荧光)、TRo/CS(单位面积捕获光能)、ABS/CS(反应中心吸收光能)、Fv(可变荧光)、Fm(最大荧光)、RC/CSo(反应中心数量)、Fv/Fm(最大光化学速率)、ETO/CS(单位面积电子传递的量子产额)、DIo/CS(单位面积的热耗散)、PI(abs)(吸收光能为基础的性能指数)等参数。

1.1初始荧光Fo变化

Fo是PSⅡ反应中心全部开放时的荧光水平，Fo升高意味着PSⅡ受到了伤害或者是不可逆失活。图1、2中，室温下两地区不同品种玉米的Fo值较低，并且变化幅度平稳。高温处理后Fo呈上升趋势，但Fo值升高不明显，高温处理前后所试验玉米品种Fo值变化幅度较小，说明高温处理对叶片光合机构Fo影响不大。如图1所示，六合地区35℃处理后初始荧光处于前三的品种是承玉5号、苏玉23号和浚单23号，Fo值分别为484、471和468；绍单8号、蠡玉37号、粟玉2号和苏玉31号初始荧光Fo处于同一水平，四个品种Fo平均值450；苏玉27、苏玉42和苏玉30品种间无差异；位于后七位的品种是浚单20号、苏玉22号、郑单958、蠡玉37号、强盛369、神玉2号和苏玉10号，7个品种Fo差异显著。如图2所示，淮安地区高温处理后位于前两位品种是苏玉29和蠡玉37，苏玉10、苏玉19、浚单20、郑单958、美豫5号、苏玉27、苏玉31和浚单29号品种间无差异，强盛369和大成168处于同一水平，苏玉22、绍单8号、粟玉2号、苏玉23、承玉5号和苏玉42六个品种间Fo无差异且均值为361，初始荧光最低的两品种是苏玉30和苏玉42。Fo值分别是349和337。

1.2单位面积捕获光能TRo/CS变化

TRo/CS反映光合系统Ⅱ单位面积捕获的光能，两地区高温处理后TRo/CS呈增加趋势(图3、图4)，但高温处理后TRo/CS略有上升，变化幅度不明显，说明高温对PSⅡ系统捕获光能影响不大。六合地区室温下20个品种TRo/CS变化幅度不大，TRo/CS位于前列的品种是浚单20号和苏玉27号；承玉5号和苏玉31号之间TRo/CS值无差异，分别是359，358；蠡玉37号、苏玉42、绍单8号、浚单20号、美豫5号和苏玉29号处于同一水平，大成168、浚单29、神玉2号、强盛369、苏玉10号、苏玉22号和苏玉30号品种间无差异。淮安地区高温处理前TRo/CS变化不明显，其中增幅较小的品种是郑单958、粟玉2号、美玉30号、美豫5号、苏玉22号和苏玉42号，高温处理后浚单20号和苏玉29号无差异，TRo/CS均值302；神玉10号和苏玉27号处于同一水平TRo/CS均值298；苏玉23号、浚单20号、苏玉22号之间无差异；粟玉2号、苏玉31号和大成168处于同一水平且TRo/CS均值为275；位于后5位的品种是美豫5号、苏玉30、承玉5号、苏玉19号和神玉2号。

1.3反应中心吸收光能ABS/CS变化

ABS/CS表示光合系统Ⅱ反应中心吸收的光能，研究发现20个玉米品种经高温处理后ABS/CS值表现出不同程度的增加，但处理前后变化幅度不大，多数品种ABS/CS值差异不显著(图5、图6)。六合地区室温下品种间ABS/CS变化平稳，高温处理后ABS/CS有不同程度的增加，升高幅度较大的品种有大成168、美豫5号、和承玉5号，变化较小的品种有郑单958、神玉2号和苏玉31号，神玉2号、强盛369、苏玉30、苏玉22和苏玉10品种间无差异。淮安地区高温处理前后ABS/CS变化幅度较大的品种有蠡玉37号、苏玉29号和美豫5号，高温下ABS/CS最高的品种是苏玉29，说明高温下苏玉29反应中心吸收光能的能力仍较强；苏玉10、苏玉19、浚单20、郑单958、美豫5号、苏玉31和浚单29品种间无差异，大成168和苏玉22ABS/CS值均为366，苏玉22、绍单8号、粟玉2号、苏玉23号、承玉5号和苏玉42六个品种ABS/CS均值为361，且品种间无差异。

1.4可变荧光Fv变化

Fv表示光合系统可变荧光，两地区高温处理后Fv呈下降趋势，六合地区品种下降幅度高于淮安地区(图7、图8)。六合高温处理后下降幅度较大的品种是苏玉27、承玉5号、苏玉29和苏玉23，说明这几个品种初始光合系统可变荧光对高温比较敏感；高温处理后Fv位于前两位的品种是苏玉27和苏玉31，承玉5号、苏玉42、浚单20号、郑单958和美豫5号品种间无差异，强盛369、苏玉19、苏玉29、苏玉23和浚单29号可变荧光处于同一水平且均值为1532，绍单8号、神玉2号、大成168、苏玉10和苏玉22品种间无差异，Fv位于后三位的品种是承玉5号、苏玉30和蠡玉37号。淮安地区高温前后品种Fv变化幅度小于六合地区，高温处理后Fv位于前三的品种是苏玉27、苏玉29和浚单20号，苏玉23、苏玉10、绍单8号、强盛369、和郑单958品种间无差异，苏玉22和神玉2号处于同一水平且均值为1245，浚单29号、蠡玉37号和粟玉2号处于同一水平，承玉5号、大成168和苏玉31品种间无差异，Fv较低的品种是美豫5号和苏玉19号。

1.5最大荧光Fm变化

Fm代表光合系统ⅡRC处于完全关闭状态时的荧光产量，可反映PSⅡ的电子传递情况。如图9、图10所示，室温下品种间Fm差异显著，高温处理后品种Fm均变现出不同程度的降低，六合地区温度处理前后Fm降低幅度大于淮安地区。结果表明高温降低了PSⅡ的电子传递，抑制了玉米叶片的光合碳代谢。六合地区高温处理后Fm位于前两位的品种是苏玉27和苏玉31，其次是粟玉2号、苏玉42和美豫5号，三个品种Fm差异不明显平均值为2040；浚单20号、苏玉29、苏玉23、郑单958、浚单29号、绍单8号、强盛369、苏玉19和承玉5号品种间差异不显著，苏玉22、神玉2号、苏玉10和苏玉30处于同一水平均值为1878，Fm最低的品种是蠡玉37号Fm为1776。淮安地区高温处理后Fm位于前三位的品种是苏玉29、苏玉27和浚单20号，其次是处于同一水平的苏玉23、苏玉10和绍单8号，强盛369、郑单958两品种Fm无差异，苏玉42和苏玉22之间无差异，蠡玉37号、神玉2号、浚单29号和粟玉2号Fm处于同一水平均值为1570，Fm位于后六位的品种是苏玉30、大成168、承玉5号、美豫5号和苏玉19号。

1.6反应中心数量RC/CSo变化

RC/CSo表示光合系统单位面积反应中心数量Ⅱ。如图11、图12所示，研究发现六合地区经35℃高温处理后品种RC/CSo总体呈升高趋势，不同品种升高幅度差异显著，其中上升幅度较高的品种是苏玉29、浚单29号、苏玉42、美豫5号和苏玉30。室温下RC/CSo位于前三的品种是苏玉27、苏玉23和苏玉31，其次是处于同一水平的粟玉2号和苏玉19，承玉5号和郑单958均值为145两品种间无差异，美豫5号、蠡玉37号、强盛369、绍单8号、神玉2号、苏玉29和大成168处于同一水平且均值为142，苏玉42、浚单20、苏玉22和苏玉10品种间无差异，RC/CSo最低的两品种是浚单29号和苏玉30。淮安地区40℃高温处理后品种RC/CSo表现出下降趋势，下降率较高的品种是郑单958和苏玉31号，室温下RC/CSo位于前三的品种是苏玉29、浚单20号和郑单958，其次是处于同一水平的苏玉10、苏玉31、绍单8号、苏玉22和粟玉2号，强盛369、大成168、浚单29、苏玉30、苏玉27号、美豫5号、蠡玉37号、苏玉23和苏玉19品种间无差异，RC/CSo位于最后两位的品种是神玉2号和承玉5号。推测两地区变化趋势不同的原因可能是测定的生育时期不同。六合地区在玉米抽雄扬花期测定，淮安地区在玉米灌浆期测定，叶片功能开始衰老。

1.7最大光化学速率Fv/Fm变化

最大光化学效率Fv/Fm反映PSⅡ利用光能的能力，表示叶绿体光系统Ⅱ受到的伤害程度，Fv/Fm值下降是植物受到光抑制的重要指标，其大小可反映植物受伤害的程度。图13、图14所示，高温处理半小时后两地区最大光化学速率均表现出下降的规律。六合地区室温下苏玉27号Fv/Fm值最高，其次是苏玉42号、苏玉31号和苏玉19号，较低的是浚单29号和美豫5号，蠡玉37号、强盛360、神玉2号、苏玉2号、粟玉2号和承玉2号品种间最大光化学速率无差异，苏玉22号、大成168、浚单20号、苏玉10号和绍单8号品种间差异不显著。35℃处理后郑单958、苏玉27号两品种Fv/Fm值较高且无差异，苏玉31号、神玉24号、苏玉19号、浚单20号、苏玉42号和苏玉10号品种间无差异，苏玉10号、绍单8号、苏玉23号、浚单29和苏玉30号品种间无差异，承玉5号和蠡玉37号最大光化学速率处于较低水平，两品种光合叶绿体光系统Ⅱ对高温胁迫较为敏感，受到光抑制明显。35℃高温处理后各品种最大光化学速率均有不同程度下降，其中蠡玉37号、苏玉5号、苏玉23号、苏玉29号、承玉5号和大成168下降率超过7％，蠡玉37号下降率达到最高8.6％，下降率较小的是浚单20号、郑单958和神玉10号，20个品种中郑单958在35℃高温时Fv/Fm较高且在高温处理时下降率较低，说明郑单958光合机构对高温逆境的抵抗力强。

淮安地区28℃时苏玉29号、粟玉2号最大光化学速率处于较高水平，较低的是承玉5号和苏玉19号，苏玉42、苏玉31号、苏玉10号、蠡玉37号、郑单958、浚单20号、强盛369和大成168之间无差异，苏玉17号、绍单8号、美豫5号和神玉2号无差异，40℃处理下苏玉27号、苏玉23号和浚单20最大光化学速率较高且处于同一水平，郑单958、苏玉19号、苏玉29号、苏玉30号和粟玉2号品种间无差异。40℃处理时大多数品种Fv/Fm值呈下降规律，其中苏玉23、苏玉27号、号神玉2号和邵单8号呈上升趋势，可能是因为测量时叶片衰老或测量误差造成的。其中下降率较低的品种浚单20号下降1.4％，苏玉30号下降2.2％；下降率较高的品种是美豫5号、苏玉19号和苏玉31号，分别下降7.3％、8.2％、8.7％。

1.8电子传递速率ETo/CS变化

当植物在环境胁迫条件下发生光抑制时，会影响叶绿体PSⅡ光能转化为电势能的能力，使叶绿体光合链上电子传递速率受到抑制，ETo/CS能够很好的光合反应光合系Ⅱ电子传递特性。两个试验点室温下苏玉27号和苏玉31号ETo/CS值较高且处于同一水平，强盛369、粟玉2号、苏玉19后、苏玉29号和绍单8号ETo/CS值在20个品种中处于中间水平且品种之间无差异(图15、图16)，美豫5号、苏玉42和浚单29品种间无差异，电子传递速率较小的品种是苏玉22号和苏玉30号。35℃高温处理30min后ETo/CS值均降低，高温逆境造成各品种电子传递速率降低，高温下苏玉31号、苏玉27号ETo/CS值仍处于前两位且差异显著，大成168、苏玉42、承玉5号、浚单29号、美豫5号和绍单8号ETo/CS值较低且处于同一水平，最低的是蠡玉37号和苏玉29号。常温和高温处理时苏玉27号和苏玉31号值均最高，说明两个品中电子在不同环境下的电子传递较高。下降率较低的品种是苏玉10号和苏玉31号。苏玉31号在不同温度下电子传递较高且下降率较低说明苏玉31号品种在20个品种中电子传递速率高。

1.9热耗散DIo/CS变化

叶绿体吸收的光能一部风转变为热能散发出去即热耗散，是植物在高温逆境下的自我保护机制，可以通过叶绿素荧光参数DIo/CS表现出来。两试验点在温度处理后，热耗散值均表现出升高规律(图17、图18)。六合地区室温时苏玉23号和承玉5号热耗散值位于前列，苏玉27号、浚单29号、美豫5号、绍单8号、苏玉19号、浚单20号、粟玉2号、大成168、蠡玉37号、苏玉30号、郑单958和苏玉29号品种之间无差异，位于最后五位的品种苏玉22号、神玉2号、苏玉10号、苏玉42号和强盛369处于同一水平。35℃高温处理后所有品种的热耗散值均有不同程度升高，热耗散值较高的品种仍然是承玉5号、苏玉23号。苏玉31号、苏玉22号、浚单27号和苏玉27号品种间无差异，热耗散值位于最后两位的品种是郑单958和神玉2号。结果表明不同温度下承玉5号和苏玉23号热耗散值均最高。

淮安地区热耗散值较高的品种是苏玉23号、苏玉19号，苏玉27号、绍单8号、美豫5号、苏玉22号、苏玉30号，浚单29号、浚单20号、郑单958、神玉2号、强盛369、大成168和蠡玉37号品种间无差异，最低的三个品种粟玉2号、苏玉31号和苏玉29号品种间无差异。40℃处理处理后苏玉19号和美豫5号热耗散值较高，粟玉2号、苏玉10号、苏玉22号、苏玉30号、强盛369、浚单20号、绍单8号、苏玉27号和苏玉23号品种间无差异，最低的是神玉2号。不同温度下苏玉19号热耗散值均最高。

1.10性能指数PI(abs)变化

性能指数PI(abs)可以准确地反映植物光合机构的状态，它们对某些胁迫比Fv/Fm更敏感，能更好地反映胁迫对光合机构的影响。图19、图20分别表示六合、淮安地区不同温度处理后品种PI(abs)值变化。25℃下20个品种差异显著，PI(abs)值较高的是强盛369、郑单958、神玉2号和苏玉31号，PI(abs)值最低的是绍单8号，其中苏玉27号、浚单20号和栗玉2号PI(abs)值无差异，蠡玉8号、苏玉23号、绍单8号和苏玉大成168号之间也无差异。35℃处理下20个品种PI(abs)值均下降，其中性能指数较高的有苏玉10号、郑单958、神玉2号和苏玉31号，性能指数最低的是绍单8号，其中苏玉27号、强盛369和苏玉27号无差异，承玉5号、绍单8号、美豫5号和苏玉42号差异不显著，郑单958、神玉2号和苏玉31号在不同温度下PI(abs)值都较高，说明这三个品种光合机构强于其他品种。高温处理后下降率较小的是苏玉10号、苏玉19号、苏玉31号和郑单958。25℃和35℃下PI(abs)值均较高的是郑单958、浚单20和苏玉29号。

室温时，淮安地区PI(abs)值较高的品种是苏玉29号、粟玉2号、粟玉31号、郑单958、浚单20号，强盛369、蠡玉37号、大成168和苏玉10号处于同一水平，神玉2号、苏玉27号、承玉5号和绍单8号品种间无差异，性能指数最低的是苏玉19号，其次是苏玉30号。40℃高温处理下，PI(abs)较高品的种是苏玉29号、苏玉23号、浚单20号、苏玉27号和郑单958，粟玉2号、苏玉22号和承玉5号品种间无差异，PI(abs)值较小的是苏玉19号和美豫5号。淮安地区不同温度下PI(abs)值较高的品种是苏玉29号、郑单958和浚单20号。

1.11两地区不同温度处理时PI(abs)变化

六合地区25℃和35℃处理下苏玉29号PI(abs)值最高，其次是苏玉31号、郑单958号、粟玉2号和浚单20号，淮安试验点28℃和40℃处理下郑单958号PI(abs)值最高，其次是苏玉10号、神玉2号、苏玉31号、强盛369、苏玉27号和浚单20号(图21)。比较发现两地区不同温度处理下郑单958号、浚单20号和苏玉31号均位于20个品种前列。说明郑单958号、浚单20号和苏玉31号不同地区生态适应性好于其他品种，尤其是光合机构抵抗高温的能力强于其他品种。

综上所述，对上述20个品种的叶绿素荧光参数做了分析，发现Fo、TRo/CS、abs/CS高温前后没有明显变化，Fm、Fv、Fv/Fm、ETo/CS、PI(abs)等五个参数呈下降趋势，DIo/CS、RC/CSo表现出升高趋势，产量较高的品种是苏玉29、苏玉23和郑单958。进一步对11个参数分析发现，PI(abs)是一个比较综合的参数，可以准确反映高温逆境胁迫对光合作用的影响，与最大光化学效率(Fv/Fm)相比，更能准确反映PSⅡ的状态。在不同区域、不同温度处理下，郑单958号、浚单20号、苏玉31叶绿素荧光参数PI(abs)都较高；且考虑到郑单958适应性广、抗性好、耐干旱、耐高温的特点，从侧面说明性能指数PI(abs)可作为筛选热稳定性品种的可靠性。因此可以将郑单958作为对照品种。

采用本实施例的方法，选择PI(abs)作为筛选叶片抗高温的高光效玉米品种的检测指标，以郑单958作为对照品种，苏玉29、苏玉23、浚单20、苏玉27等玉米品种的PI(abs)高于郑单958，初步筛选出上述玉米品种为耐高温玉米品种，且结合具体的种植情况可知，上述玉米品种没有出现高温诱导的伤害症状，且产量和郑单958持平或超出郑单958，表现出耐高温特性。综上所述，确定苏玉29、苏玉23、浚单20、苏玉27为耐高温玉米品种。

实施例2玉米高温期荧光参数测定

分别在2016年8月5日、8月11日和8月17日20：00左右，在六合试验点玉米抽雄扬花期选取倒4叶为测量叶，每个品种10个重复，在天黑暗1小时后，利用植物叶绿素效率分析仪分别测定Fv/Fm、ETO/CS、DIo/CS、PI(abs)等参数。

如图22，在经过高温期后，PI(abs)数值有所降低。结合六合的天气情况(图24)可以分析，在到8月11日前，气温未达到或高于35℃，11日至17日之间经历了一次高温，PI(abs)在11日达到最大值后开始下降，在高温胁迫的压力下PI(abs)得以下降。可见，在玉米抽穗扬花期特别是玉米小喇叭口至大喇叭口期，高温对PI(abs)参数有降低作用，可以选择在玉米小喇叭口至大喇叭口期，白天日最高温度35℃及以上的晴天，待天黑暗后1小时，测定田间玉米倒4叶的PI(abs)，优先选择倒4叶中部作为测定区域，每个品种测定不少于10株，连续测定次数不少于3次，每次间隔5天，取平均值；并在相同的测定条件下，测定对照品种郑单958的PI(abs)的平均值；比较待测玉米品种与对照品种PI(abs)的平均值，高于对照品种的待测玉米品种即为叶片光合作用能力强、耐高温的玉米品种。

采用本实施例的方法，选择PI(abs)作为筛选叶片抗高温的高光效玉米品种的检测指标，以郑单958作为对照品种，浚单20玉米品种的PI(abs)高于郑单958，初步筛选出上述玉米品种为耐高温玉米品种，且结合具体的种植情况可知，上述玉米品种没有出现高温诱导的伤害症状，且产量和郑单958持平或超出郑单958，表现出耐高温特性。综上所述，确定浚单20玉米为耐高温玉米品种。

实施例3玉米全生育期荧光参数测定：

2016年5月底3叶期开始到8月玉米成熟，选取气候条件晴好的天气，在天黑暗半小时以上，优先选择每天20：00左右，在六合试验点玉米植株上选取倒4叶为测量叶，每个品种10个重复，利用植物叶绿素效率分析仪分别测定Fv/Fm、ETO/CS、DIo/CS、PI(abs)等参数，每7天测定1次，取平均值。

结合全生育期的气候条件(图24)以及全生育期玉米品种PI(abs)趋势(图23)可以看出，各品种玉米苗期PI(abs)参数的数值都很低；从小喇叭口期开始至大喇叭口期，PI(abs)参数的数值开始突然上升并达到最大值；抽雄扬花期后，PI(abs)参数的数值再次降低，并在灌浆期后再次上升但不会超过喇叭口期的数值。由此可见，从小喇叭口期到大喇叭口期这一阶段是叶绿素荧光参数PI(abs)测量的最佳时期。因此可以选择从3叶期开始，天黑暗后半小时以上，优先选择每天20：00左右，测定田间玉米倒4叶的PI(abs)，优先选择倒4叶中部作为测定区域，每个品种测定不少于10株，每7天测定1次，取平均值，计算出PI(abs)值的变化趋势，并获得待测玉米品种全生育期(即从三叶期至成熟期)PI(abs)的平均值；并在相同的测定条件下，测定对照品种郑单958的PI(abs)全生育期的平均值；比较全生育期(即从三叶期至成熟期)待测玉米品种与对照品种PI(abs)的平均值，当待测玉米品种的PI(abs)全生育期的平均值高于或等于对照品种全生育期的PI(abs)的平均值时，该待测玉米品种即为叶片光合作用能力强、耐高温的玉米品种。

通过结合图23和图24，采用本实施例的方法，选择PI(abs)作为筛选叶片抗高温的高光效玉米品种的检测指标，以郑单958作为对照品种，所获得的苏玉23、栗玉2号、苏玉27等玉米品种其全生育期的PI(abs)高于或等于郑单958的PI(abs)，初步筛选出上述玉米品种为耐高温玉米品种，且结合具体的种植情况可知，上述玉米品种没有出现高温诱导的伤害症状，且产量和郑单958持平或超出郑单958，表现出耐高温特性，从而确定苏玉23、栗玉2号、苏玉27为耐高温玉米品种。

实施例4种植密度、叶位对玉米叶片荧光特性的影响

以我国主栽玉米品种郑单958为供试玉米品种。试验于2013年在江苏南京六合试验农场进行，2013年6月10日开沟播种，每穴2粒，肥料随播种施入沟内(种子之间)，播种深度为4～5cm，播后压实土层，保证足够的墒情。当幼苗长至30cm高时间苗。生长期内遇旱及时浇水，田间管理措施统一按超高产田玉米管理规程进行管理。每块小区面积为30m²(5m×6m)，行距0.6m。种植密度分别为4.5、6.0、7.5和9.0万株·hm^-2(分别用4.5、6、7.5、9表示四个不同的种植密度)，重复3次，相同的密度下，灌浆期，叶片自基部向上计数，分别测定郑单958第3、6、9叶测定光合荧光参数。

当植物遭受胁迫时，Fo明显升高。灌浆期，相同密度条件下，叶位自基部向上，Fo呈现逐渐降低的趋势(图25)，说明与第6、9叶相比，第3片叶遭受明显的胁迫，而不同种植密度间相同叶位叶片Fo差异不明显。种植密度升高可以增强第3叶遭受的胁迫。非环境胁迫条件下叶片的Fv/Fm极少变化，不受物种和生长条件的影响，胁迫条件下该参数明显下降。灌浆期，第6、9片叶的荧光参数Fv/Fm在各个种植密度下没有明显的变化，而第3片叶的Fv/Fm则随着种植密度的增加呈现逐渐降低的趋势(图26)。在不同种植密度条件下，随着叶位的升高，灌浆期叶片的PI(abs)呈逐渐升高的趋势；第3、6、9片叶的PI(abs)随着密度的升高有下降的趋势。与4.5万株·hm^-2处理第9、6、3片叶相比，9万株·hm^-2处理下叶片的PI(abs)分别下降了10％、20.76％和30.94％(图27)。说明在高密度条件下，第3叶的光合性能下降明显，比第6、9叶更容易遭受胁迫。随着密度的升高，第3叶片ETo/ABS有明显降低(图28)，与4.5万株·hm^-2处理第3、9片叶相比，9.0万株·hm^-2第3、9片叶的ETo/ABS分别下降10.2％、3.2％，但没有达到显著水平。随着密度的增加，第6、9叶光合电子传递链的电子传递效率维持在较高的水平，而第3叶电子传递效率下降明显，表明高种植密度对第3叶光合器官的电子传递效率有显著的影响。

上述试验结果表明，Fo随着种植密度增加而逐渐升高，也表明高种植密度使光合系统受到胁迫，尤其对第3叶的影响更加明显。随着种植密度的增加，叶绿素荧光参数Fv/Fm呈逐渐降低的趋势；同时第3叶Fv/Fm明显低于第6、9叶的Fv/Fm，且高种植密度的第3叶的Fv/Fm低于其他低种植密度的第3叶的Fv/Fm，表明第3叶的光能转化效率低于第6和第9叶的光能转化效率，说明虽然第3叶由于叶片之间的遮挡作用，所接受的光照已经有较大幅度的降低，但是高种植密度还是加速了第3叶的光能转化效率的降低。随着种植密度的增加，第3叶电子传递占所捕获的光能的比例逐渐降低。这些数据都表明，种植密度的改变对第9叶叶片荧光特性的影响并不大，且第9叶在叶绿素荧光参数测量时表现的最好。所以选取上部叶片作为测量叶绿素荧光参数的最佳部位。