一种绿色荧光蛋白突变体作为铝离子检测探针的应用的制作方法

本发明涉及铝离子检测领域，具体涉及一种绿色荧光蛋白突变体作为铝离子检测探针的应用。

背景技术：

铝是一种常见的金属，已经被广泛地应用于生活中。但由于食物链堆积、乱用滥用等原因，铝元素极易以铝离子地形式影响生态环境，甚至进入人体内，导致大脑神经退化、记忆力衰退等。因此，对铝离子在不同环境中的浓度检测具有重要的意义。

目前，与传统的元素检测法，如原子吸收法、原子发射法和电感耦合等离子体质谱等方法相比，荧光探针检测具有快速、便捷、灵敏度低等优点。但是，目前报导的荧光探针通常都是通过有机全合成的手段获得，制备过程繁琐，而且在合成过程中使用了大量有机试剂、重金属催化剂等。为了检测某种金属离子，却在检测过程中造成了二次污染，有违绿色化学原则。此外，在生物医药分析中，很多检测均在活体中进行，要求荧光探针具有高生物亲和性，无毒无害、易于降解。

绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)是一种天然存在在于绿色荧光水母中的蛋白，由238个天然氨基酸构成。经过折叠后，其荧光生色团被很好地包裹在11个β-折叠嵌段之中，形成桶装结构。其荧光发光稳定，效率高，是一种高效的荧光探针。此外，由于蛋白获取过程不涉及任何毒害物质的使用，而且其生物相容性高，被广泛地应用在分子标记、药物筛选、抗体融合、生物传感器等研究领域。

Ayyadurai等人(Bioconjugate chemistry,2011,22(4):551-555.)在酪氨酸缺陷型大肠杆菌中培养得到了一种非天然氨基酸嵌入的绿色荧光蛋白(GFPdopa)，蛋白氨基酸序列中的酪氨酸被左旋多巴所替代。该研究对GFPdopa的性质进了研究，但是并未公开将其应用于铝离子的检测。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种绿色荧光蛋白突变体作为铝离子检测探针的应用，该方法操作简单，铝离子检测限可达μmol·L^-1级，且选择性高，满足实际样品的检测需要。

本发明所提供的技术方案为：

一种绿色荧光蛋白突变体作为铝离子检测探针的应用，所述绿色荧光蛋白突变体以绿色荧光蛋白为母体，其氨基酸序列中酪氨酸被定向突变为左旋多巴。

上述技术方案中，由于左旋多巴在水溶液体系中，对铝离子有极高的亲和性。因此当绿色荧光蛋白生色团中的酪氨酸被突变成左旋多巴后，生色团可以与游离的铝离子进行配合，继而产生荧光的变化。

所述绿色荧光蛋白母体氨基酸序列已经在Ayyadurai等(Bioconjugate chemistry,2011,22(4):551-555.)发表的文章中公开。

所述绿色荧光蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1。

所述绿色荧光蛋白是一种具有荧光生色团的桶状蛋白，可以在正常大肠杆菌中进行表达，其最大荧光发射波长在450～550nm之间，其紫外最大吸收峰在450～550nm之间。

所述的绿色荧光蛋白突变体是在酪氨酸缺陷型大肠杆菌中表达；所述绿色荧光蛋白突变体氨基酸总数在为238(不包括Histag标签)，相对分子量在25000～30000道尔顿之间。

作为优选，所述绿色荧光蛋白突变体经过透析、冻干后，分散到待测液中进行检测。

作为优选，所述检测温度为4～60℃，反应时间在1～60min，待测液pH值为5～9。

进一步优选，所述检测温度为15～40℃，反应时间在1～10min，待测液pH值为6～8。

作为优选，所述待测液为实际污染液或者模拟缓冲液。

作为优选，所述实际污染液为被铝离子污染的土壤浸出液或是被铝离子污染的细胞培养液。

作为优选，所述模拟缓冲液为磷酸盐缓冲液(PBS)、2-N-吗啡啉丙磺酸缓冲液(MES)、3-N-吗啡啉丙磺酸缓冲液(MOPS)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液(HEPES)或三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(Tris-HCl)。进一步优选为3-N-吗啡啉丙磺酸缓冲液(MOPS)或4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液(HEPES)。

作为优选，所述绿色荧光蛋白突变体在待测液中的添加量为1～10μmol·L^-1。

同现有技术相比，本发明的有益效果体现在：

(1)本发明提供了一种全新的铝离子检测探针，制备过程绿色无污染，且探针水溶性高，生物相容性好，可以用于生物样品包括细胞内铝离子浓度的检测；

(2)本发明所提供的探针选择性高，在Na⁺,K⁺,Ag⁺,Ca²⁺,Mg²⁺,Ba²⁺,Zn²⁺,Cd³⁺,V³⁺等不同离子存在下，对铝离子浓度均存在明显响应。

具体实施方式

以下应用例可以使本专业人员更全面理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

绿色荧光蛋白突变体的表达

绿色荧光蛋白突变体采用残基特异性嵌入非天然氨基酸的手段进行定向突变。将含有绿色荧光蛋白质粒DNA的酪氨酸缺陷型大肠杆菌在基本培养基(Minimal medium)中进行培养，而后在含有左旋多巴的基本培养基中，在IPTG诱导下进行表达。将完全表达后的大肠杆菌裂解，并在用镍柱对裂解上清液进行纯化，其中发出黄绿色荧光的洗脱部分即为目标蛋白。将蛋白溶液透析后再冻干即得到黄绿色固体即为绿色荧光蛋白突变体(GFPdopa)。

铝离子浓度的检测是通过将探针与不同待测样品混合后，通过荧光分光光度计计算荧光强度变化得到相应铝离子浓度。

应用例1

1、称取0.14g GFPdopa蛋白固体溶于1L HEPES缓冲溶液(pH＝7.4)中作为检测液(5μmol·L^-1)。

2、取适量硝酸铝和硝酸钠溶于HEPES缓冲溶液(pH＝7.4)，配成10、20、40、80μmol·L^-1Al³⁺和50μmol·L^-1Na⁺共存在的模拟污染液。

3、将100μL检测液分别与100μL HEPES缓冲液(空白对照)和100μL模拟污染液(待测液)混合摇匀后，静置5min，控制检测温度为25℃时，用荧光分光广度计检测待测液荧光强度变化，根据拟合线性方程，计算得到Al³⁺浓度。结果表明，所述检测探针可以检测模拟污染液中铝离子浓度，且不受Na⁺存在的干扰。

应用例2

1、称取0.28g GFPdopa蛋白固体溶于1L HEPES缓冲溶液(pH＝7.0)中作为检测液(10μmol·L^-1)。

2、取适量硝酸铝和硝酸钾溶于HEPES缓冲溶液(pH＝7.0)，配成10、20、40、80μmol·L^-1Al³⁺和50μmol·L^-1K⁺共存在的模拟污染液。

3、将200μL检测液分别与200μL HEPES缓冲液(空白对照)和200μL模拟污染液(待测液)混合摇匀后，静置1min，控制检测温度为25℃时，用荧光分光广度计检测待测液荧光强度变化，根据拟合线性方程，计算得到Al³⁺浓度。结果表明，所述检测探针可以检测模拟污染液中铝离子浓度，且不受K⁺存在的干扰。

应用例3

1、称取0.14g GFPdopa蛋白固体溶于1L HEPES缓冲溶液(pH＝8.0)中作为检测液(5μmol·L^-1)。

2、取适量硝酸铝和硝酸银溶于HEPES缓冲溶液(pH＝8.0)，配成10、20、40、80μmol·L^-1Al³⁺和50μmol·L^-1Ag⁺共存在的模拟污染液。

3、将50μL检测液分别与50μL HEPES缓冲液(空白对照)和50μL模拟污染液(待测液)混合摇匀后，静置5min，控制检测温度为15℃时，用荧光分光广度计检测待测液荧光强度变化，根据拟合线性方程，计算得到Al³⁺浓度。结果表明，所述检测探针可以检测模拟污染液中铝离子浓度，且不受Ag⁺存在的干扰。

应用例4

1、称取0.084g GFPdopa蛋白固体溶于1L Tris-HCl缓冲溶液(pH＝6.0)中作为检测液(3μmol·L^-1)。

2、取适量硝酸铝和硝酸钙溶于Tris-HCl缓冲溶液(pH＝6.0)，配成10、20、40、80μmol·L^-1Al³⁺和50μmol·L^-1Ca²⁺共存在的模拟污染液。

3、将100μL检测液分别与100μL Tris-HCl缓冲液(空白对照)和100μL模拟污染液(待测液)混合摇匀后，静置3min，控制检测温度为15℃时，用荧光分光广度计检测待测液荧光强度变化，根据拟合线性方程，计算得到Al³⁺浓度。结果表明，所述检测探针可以检测模拟污染液中铝离子浓度，且不受Ca²⁺存在的干扰。

应用例5

1、称取0.14g GFPdopa蛋白固体溶于1L Tris-HCl缓冲溶液(pH＝6.5)中作为检测液(5μmol·L^-1)。

2、取适量硝酸铝和硝酸钡溶于Tris-HCl缓冲溶液(pH＝6.5)，配成10、20、40、80μmol·L^-1Al³⁺和50μmol·L^-1Ba²⁺共存在的模拟污染液。

3、将200μL检测液分别与200μL Tris-HCl缓冲液(空白对照)和200μL模拟污染液(待测液)混合摇匀后，静置10min，控制检测温度为25℃时，用荧光分光广度计检测待测液荧光强度变化，根据拟合线性方程，计算得到Al³⁺浓度。结果表明，所述检测探针可以检测模拟污染液中铝离子浓度，且不受Ba²⁺存在的干扰。

应用例6

1、称取0.28g GFPdopa蛋白固体溶于1L Tris-HCl缓冲溶液(pH＝6.0)中作为检测液(10μmol·L^-1)。

2、取适量硝酸铝和硝酸镁溶于Tris-HCl缓冲溶液(pH＝6.0)，配成10、20、40、80μmol·L^-1Al³⁺和50μmol·L^-1Mg²⁺共存在的模拟污染液。

3、将500μL检测液分别与500μL Tris-HCl缓冲液(空白对照)和500μL模拟污染液(待测液)混合摇匀后，静置10min，控制检测温度为37℃时，用荧光分光广度计检测待测液荧光强度变化，根据拟合线性方程，计算得到Al³⁺浓度。结果表明，所述检测探针可以检测模拟污染液中铝离子浓度，且不受Mg²⁺存在的干扰。

应用例7

1、称取0.028g GFPdopa蛋白固体溶于1L MOPS缓冲溶液(pH＝8.0)中作为检测液(1μmol·L^-1)。

2、取适量硝酸铝和硝酸锌溶于MOPS缓冲溶液(pH＝8.0)，配成10、20、40、80μmol·L^-1Al³⁺和50μmol·L^-1Zn²⁺共存在的模拟污染液。

3、将100μL检测液分别与100μL MOPS缓冲液(空白对照)和100μL模拟污染液(待测液)混合摇匀后，静置10min，控制检测温度为37℃时，用荧光分光广度计检测待测液荧光强度变化，根据拟合线性方程，计算得到Al³⁺浓度。结果表明，所述检测探针可以检测模拟污染液中铝离子浓度，且不受Zn²⁺存在的干扰。

应用例8

1、称取0.14g GFPdopa蛋白固体溶于1L MOPS缓冲溶液(pH＝7.0)中作为检测液(5μmol·L^-1)。

2、取适量硝酸铝和硝酸钴溶于MOPS缓冲溶液(pH＝7.0)，配成10、20、40、80μmol·L^-1Al³⁺和50μmol·L^-1Co²⁺共存在的模拟污染液。

3、将50μL检测液分别与50μL MOPS缓冲液(空白对照)和50μL模拟污染液(待测液)混合摇匀后，静置3min，控制检测温度为37℃时，用荧光分光广度计检测待测液荧光强度变化，根据拟合线性方程，计算得到Al³⁺浓度。结果表明，所述检测探针可以检测模拟污染液中铝离子浓度，且不受Co²⁺存在的干扰。

应用例9

1、称取0.28g GFPdopa蛋白固体溶于1L MOPS缓冲溶液(pH＝7.5)中作为检测液(10μmol·L^-1)。

2、取适量硝酸铝和硝酸钒溶于MOPS缓冲溶液(pH＝7.5)，配成10、20、40、80μmol·L^-1Al³⁺和50μmol·L^-1V³⁺共存在的模拟污染液。

3、将1000μL检测液分别与1000μL MOPS缓冲液(空白对照)和1000μL模拟污染液(待测液)混合摇匀后，静置10min，控制检测温度为37℃时，用荧光分光广度计检测待测液荧光强度变化，根据拟合线性方程，计算得到Al³⁺浓度。结果表明，所述检测探针可以检测模拟污染液中铝离子浓度，且不受V³⁺存在的干扰。

应用例10

1、称取0.14g GFPdopa蛋白固体溶于1L HEPES缓冲溶液(pH＝7.4)中作为检测液(5μmol·L^-1)。

2、取适量土壤，与MOPS缓冲溶液混匀后10000rpm离心取上清液，并加入适量硝酸铝，配成10、20、40、80μmol·L^-1Al³⁺实际污染液。

3、将100μL检测液分别与100μL HEPES缓冲液(空白对照)和100μL实际污染液(待测液)混合摇匀后，静置5min，控制检测温度为25℃时，用荧光分光广度计检测待测液荧光强度变化，根据拟合线性方程，计算得到Al³⁺浓度。结果表明，所述检测探针可以检测模拟污染液中铝离子浓度，且不受土壤浸出液中其他物质的干扰。

应用例11

1、称取0.084g GFPdopa蛋白固体溶于1L HEPES缓冲溶液(pH＝7.4)缓冲溶液中作为检测液(3μmol·L^-1)。

2、在培养过细胞的DMEM培养基中加入适量硝酸铝，配成10、20、40、80μmol·L^-1Al³⁺实际污染液。

3、将2000μL检测液分别与2000μL HEPES缓冲液(空白对照)和2000μL实际污染液(待测液)混合摇匀后，静置3min，控制检测温度为37℃时，用荧光分光广度计检测待测液荧光强度变化，根据拟合线性方程，计算得到Al³⁺浓度。结果表明，所述检测探针可以检测模拟污染液中铝离子浓度，且不受细胞培养液中其他物质的干扰。

应用例12

1、将刚表达完毕的大肠杆菌离心后，重悬于HEPES缓冲溶液(pH＝7.4)中，使OD(600nm)值为0.1，作为检测液。

2、在取适量硝酸铝溶于HEPES缓冲溶液(pH＝7.4)，配成10、20、40、80μmol·L^-1Al³⁺模拟污染液。

3、将1000μL检测液分别与1000μL HEPES缓冲液(空白对照)和1000μL实际污染液(待测液)混合摇匀后，静置10min，控制检测温度为37℃时，用荧光分光广度计检测待测液荧光强度变化，根据拟合线性方程，计算得到Al³⁺浓度，同时也可利用共聚焦荧光显微镜观察大肠杆菌荧光变化情况。结果表明，所述检测探针可以检测细菌体内铝离子浓度，可以用于体内(in vivo)铝离子浓度检测。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江大学

<120> 一种绿色荧光蛋白突变体作为铝离子检测探针的应用

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 238

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val

1 5 10 15

Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly Glu

20 25 30

Gly Glu Gly Asp Ala Thr Asn Gly Lys Ile Thr Leu Lys Leu Ile Cys

35 40 45

Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Cys

50 55 60

Gly Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Arg

65 70 75 80

His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg

85 90 95

Thr Ile Ser Phe Lys Asp Asp Gly Thr Phe Lys Thr Arg Ala Glu Val

100 105 110

Lys Phe Glu Gly Asp Thr Ile Val Asn Arg Ile Lys Leu Lys Gly Ile

115 120 125

Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn

130 135 140

Phe Asn Ser His Asn Lys Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly

145 150 155 160

Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Val Glu Asp Gly Ser Val

165 170 175

Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro

180 185 190

Arg Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Val Ile Leu

195 200 205

Glu Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu His Glu Phe Val

210 215 220

Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys

225 230 235