本发明涉及人体疲劳检测领域，涉及一种以唾液中出现的蛋白质为疲劳标志物判定疲劳的检测方法。
背景技术：
疲劳又称疲乏，是主观上一种疲乏无力的不适感觉，客观上会失去其完成原来所从事的正常活动或工作的能力，按照形成的原因和发生机制可分为紧张性疲劳、运动性疲劳、情绪性疲劳、癌性疲劳及特定器官的疲劳，如肌肉疲劳、听觉疲劳、视觉疲劳等。疲劳的发生机制比较复杂，多数认为与多种感染，应激等引起的神经-内分泌-免疫网络功能紊乱的结果，另外近期研究进一步发现遗传、代谢等方面的因素也可能参与其中。
精神和躯体疲劳会导致操作人员由适任状态衰退成亚适任和不适任状态，类似醉酒后失去正常活动或工作的能力，对人的警觉、机敏、动作的协调、信息处理和决策都会产生负面影响，大量证据显示疲劳所致判断、决策和操作水平降低，导致了大量的职业伤害，比如：交通事故及医源性伤害。疲劳伤害是各国面临的重大公共卫生问题之一。虽然有些国家对于疲劳作业已经立法如：《欧洲工作时间法》，但因没有方便快捷的检测方法，立法执行困难。全球每年因疲劳导致的伤害占职业性伤害的21.7％，所致死亡占交通死亡的57％；我国每年因疲劳意外死亡约60万人；但迄今未建立类似酒驾检测的无创、便捷的疲劳检测技术。
技术实现要素：
本发明需要解决的技术问题是提供一种非侵入式的用生物分子进行疲劳检测的方法。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：
一种人体疲劳测定方法，通过测定核连蛋白-2确定是否疲劳及疲劳程度。
本发明技术方案的进一步改进在于：所述核连蛋白-2来自于体液。
本发明技术方案的进一步改进在于：所述体液为唾液。
本发明技术方案的进一步改进在于：唾液收集时要先用生理盐水漱口三次，再用清水漱口三次，然后收集唾液。
本发明技术方案的进一步改进在于：唾液收集量不小于0.1毫升。
本发明技术方案的进一步改进在于：唾液收集后需要储存时，需在-80～-70℃下储藏。
本发明技术方案的进一步改进在于：确定是否疲劳及疲劳程度的方法是检测唾液中核连蛋白-2含量，并根据是否含有核连蛋白-2及核连蛋白-2的含量多少确定是否疲劳及疲劳程度，核连蛋白-2的含量与疲劳程度成正相关关系。
本发明技术方案的进一步改进在于：当唾液中的核连蛋白-2大于0小于300ng/ml时，为轻度疲劳；当唾液中的核连蛋白-2大于300ng/ml时，为重度疲劳。
本发明技术方案的进一步改进在于：
A、收集唾液0.1～3毫升；
B、提取蛋白并测定含量
将唾液进行离心处理得到上清液Ⅰ，向上清液Ⅰ中滴入蛋白质提取剂后冷冻一段时间，得到冷冻液；
将冷冻液进行离心处理，取出下层液并再次冷冻，得到蛋白干粉；
将蛋白干粉溶于水化液中，并离心处理，得上清液Ⅱ并与NH4HCO3溶液混合，再次离心处理后向得到的上清液中加入胰酶并控温消化酶解，然后进行分子标记并测得核连蛋白-2的含量。
由于采用了上述技术方案，本发明取得的技术进步是：
本发明是通过测定人体的体液中特定蛋白质的有无或者含量的多少，进行疲劳检测，是一种非侵入式的生物分子检测方法，不会破坏人体组织，其具有无创、无痛、快速的优点。唾液作为体液之一，随时都可以方便地收集到，无创、无痛。其适用于人体，也可以延伸到动物体等。
将唾液中的蛋白作为临床标志物进行检测，可以用来协助疲劳诊断，甚至其他疾病的诊断。未来还可以如检测人体酒精含量(测酒驾)一样建立疲劳快速识别方法。对有效预防和减少因疲劳导致的生命和安全隐患，造福人民意义重大。
本发明利用了人体的唾液等体液成分，在飞行时间质谱检测时的2000～15000Da范围内可以获得良好的肽谱识别，并且多肽的检出与疲劳间呈现一定规律性。本发明建立人体疲劳和唾液标志物核连蛋白-2含量关系模型，为快速测定疲劳提供了理论依据；同时，本发明所利用唾液和其中疲劳时产生的核连蛋白-2等蛋白，具有易得性和易检测性，便于对疲劳进行测定。
本发明的方法可以利用非侵入的方式大量获得基本可溶的肽段和蛋白质，唾液收集时要先用生理盐水漱口三次，再用清水漱口三次，然后才可收集唾液，这样可以大幅度减少唾液中其他杂质的对检测结果的干扰，此收集方法优于刷牙等其它收集方式。收集唾液后利用质谱或其它物理化学方法对唾液样品中的蛋白进行鉴定，可以测定出Nucleobindin-2(NUCB2)：核连蛋白-2的含量，可以作为检测人体疲劳判定依据，而高通量的液相-质谱联用方法测得的结果更加精确。检测过程中体液收集量小，方便取得、储存和保藏。在-80～-70℃下储藏不会使唾液中的蛋白质的含量发生变化。本发明在对志愿者们的唾液样本进行疲劳检测分析之前，都对每位志愿者进行脑电图采集(脑电图是目前国际公认的疲劳金标准)，将持续工作前后的脑电图出现的θ波进行比对，并用它来验证本发明的疲劳测定效果。核连蛋白-2作为疲劳标志物显示效果明显，经过与脑电图测定方法对比，核连蛋白-2含量对测定疲劳与脑电图出现θ波具有良好的一致性，当唾液中检测出含有核连蛋白-2时，脑电图的θ波也会出现。当唾液中的核连蛋白-2高时，脑电图的θ波出现的密度或频率也增加，人体疲劳更加明显，如核连蛋白-2含量在1.0～300ng/ml时，脑电图的θ波也明显出现，当唾液中的核连蛋白-2达到300ng/ml以上时，人体往往已经感到比较严重的疲劳。
本发明将唾液中核连蛋白-2作为疲劳标志物，可以做到非侵入的方式获取，经过胰酶酶解后的肽段和蛋白质基本可溶并且可以利用TMT试剂对蛋白进行标记，同时，该蛋白质稳定性高，易保存，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1是本发明检测样品的液相-质谱图。
具体实施方式
下面对本发明做进一步详细说明：
本发明通过检测体液中的蛋白含量确定是否处于疲劳状态及疲劳程度。体液包括汗液、尿液、血液、泪液、组织液等。本发明以唾液为代表，通过分析唾液中的蛋白质成分，发现当人体疲劳时，在唾液中会含有核连蛋白-2，唾液的提取更加便捷，唾液中的核连蛋白-2也人体疲劳具有高度的对应关系，可以通过检测唾液中核连蛋白-2含量确定是否疲劳及疲劳程度，根据是否含有核连蛋白-2及核连蛋白-2的含量多少确定是否疲劳及疲劳程度，即当检测到唾液中含有核连蛋白-2就可以确定人体已经疲劳，核连蛋白-2的含量越多时，疲劳程度越高，核连蛋白-2的含量与疲劳程度成正相关关系。当唾液中的核连蛋白-2大于零小于300ng/ml时，一般定义为轻度疲劳；当唾液中的核连蛋白-2大于300ng/ml时，为重度疲劳。这些和脑电图检测疲劳时，出现疲劳波(θ波)的结果是一致的。
本发明测定唾液中的核连蛋白-2含量的测定方法具体如下：
A、收集唾液
首先，在收集唾液前用生理盐水漱口三次，再用清水漱口三次，然后将舌上翘或者做咀嚼运动，使唾液在下颌部积聚，然后通过下唇收缩，使得唾液顺着下唇形成的通道自然流入唾液收集管中，收集0.1～3毫升唾液。如果唾液收集后需要储存时，储藏在-80～-70℃的冰箱中。
唾液的收集量只要满足分析使用即可。
B、提取蛋白并测定含量
B1、将唾液进行离心处理得到上清液Ⅰ，离心处理的转速为5000～7000rpm，离心处理时间为10～15分钟，向上清液Ⅰ中滴入质量分数为0.2～0.4％的DTT和质量分数为15～25％的TCA丙酮溶液后，在冷冻温度为-18～-25℃的冰箱内冷冻10～12小时，得到冷冻液；
B2、将冷冻液进行离心处理，离心处理的转速为12000～14000rpm，离心处理时间为10～15分钟，取下后，将下层液再次放入冷冻温度为-75～-85℃的冰箱内冷冻1.0～1.5小时，得到蛋白干粉；
B3、将蛋白干粉溶于水化液中并离心处理，离心处理的转速为5000～7000rpm，离心处理时间为10～15秒，得上清液Ⅱ；将上清液Ⅱ与NH4HCO3溶液混合，并转移至3K的超滤管中进行离心处理，离心处理的转速为5000～7000rpm，离心处理时间为2～4分钟，重复两次；将离心处理后向得到的上清液中加入胰酶，控制温度为36～40℃，消化酶解8～10小时；
B4、利用体外标记法进行TMT试剂标记酶解后的溶液，并将标记后的溶液采用高通量的液相-质谱联用分析，可以得到如图1所示的样品的液相-质谱图。并计算出核连蛋白-2的含量。
为了验证唾液中检测核连蛋白-2与疲劳的对应关系，并为了方便研究，发明人邀请了几十位志愿者参与研究，选取的志愿者身体健康，无器质性疾病和慢性疲劳症状；并排除持续或反复发作的疲劳持续6个月以上、咽喉疼痛、颈部或腋下淋巴结肿痛、肌肉疼痛、多发性非关节炎性疼痛、头疼、睡眠障碍、劳累后不适持续24小时以上的睡眠不足人群队列。
在采集志愿者常规状态下和持续工作后的两种唾液标本，将常规状态下采集的样本标记为“前”，将持续工作后采集的唾液样本标记为“后”。在采集常规状态下和持续工作后的唾液样本时，都通过脑电图(目前国际公认的疲劳金标准)方式检测该志愿者是否出现疲劳，并将此脑电图编号与采集的唾液样品对应保存。在对采集的唾液样品中的核连蛋白-2含量进行检测后，再与该志愿者当时的脑电图进行对比。经分析发现，唾液样品中是否含有核连蛋白-2及核连蛋白-2含量多少与脑电图的θ波是否出现及出现的密度保存高度一致。下表是核连蛋白-2检测结果和脑电图结果对比。脑电图结果中无θ波表示不疲劳，θ波较少表示轻度疲劳，θ波较多表示重度疲劳。
从上表可以反应出核连蛋白-2含量为0时(唾液中不含核连蛋白-2)，脑电图的结果是没有θ波出现，即人体不疲劳；当唾液中检测到核连蛋白-2，并且其值小于300ng/ml时，脑电图出现θ波，但其密度不大，为轻度疲劳范围；当唾液中的核连蛋白-2大于300ng/ml时，脑电图θ波明显增加，密度较大，为重度疲劳。由此可见，利用本发明的非侵入方式收集唾液并通过检测唾液中的核连蛋白-2的含量可以作为检测人体疲劳的指标。