本发明涉及一种生物蛋白检测技术方案，特别是一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒。
背景技术：
：人类中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophilgelatinase-associatedlipocalin，NGAL)分子量约为25kDa，共价结合于中性粒细胞明胶酶。NGAL生理状态下是一种生长因子，主要参与了早期肾脏上皮的发生、生长。在正常组织包括肾脏，肺，胃及结肠的上皮组织中表达量较低。肾脏缺血再灌注损伤后，近曲小管上皮大量表达NGAL，是近来发现的早期诊断AKI(急性肾损伤)的敏感的生物学标志物。尿NGAL是肾脏缺血再灌注损伤的一个敏感的指标，同时其表达量与肾脏缺血时间相关。在寻找AKI早期诊断标记物的研究中，人们发现NGAL是一个很好的预测及诊断指标。有学者在急性缺血再灌注和顺铂诱导的AKI小鼠模型中，发现在损伤发生数小时之内即可检测到NGAL的表达明显增高。尿NGAL是缺血性肾损伤的一个早期、敏感的指标，即AKI时血、尿NGAL水平均升高，尿NGAL水平升高更为显著。并且NGAI升高较早期肾脏损伤的其他指标如肾脏损伤分子(kidneyinjurymolecular1，KIM一1)、Cyr61(cysteinrichprotein61)、132一微球蛋白等出现得要早。同时，NGAL水平与肾脏损伤程度呈正相关，血和尿NGAL可作为诊断AKI的早期、敏感、特异性的早期生物学标记物，并在一定程度上可以反映AKI严重程度及判断预后。NGAL已被证实作为小儿心脏搭桥手术后，预测急性肾损害的早期可靠指标。NGAL也是反映肾脏慢性损害的一种有潜力的新标记物，在慢性肾脏病(chronickidneydis-ease，CKD)患者中，NGAL能确切反映肾脏损害的程度，是CKD进展的一个强力和独立的风险指标。Suzuki等发现与血NGAL水平相比，尿NGAL是儿童SLE(系统性红斑狼疮)患者LN(狼疮性肾炎)活动度和肾损害的一个新的标记物，且LN病理分型不同其NGAL水平亦不同(依据WHO的LN分型，IV型患儿NGAL水平明显高于V型)。在对抗中性粒细胞胞浆抗体(antineutrophilcytoplasmican-tibodies，ANCA)相关性血管炎的研究中，Chen等发现患者血清NGAL水平在疾病初期和复发期均较缓解期显著升高，提示循环NGAL水平可作为评价ANCA相关性血管炎疾病活动的一个有用指标。目前NGAL的检测方法有酶联免疫法、放射免疫法、Western-blotting、化学发光法以及胶乳免疫比浊法。酶联免疫法自动化程度不高，且受人为因素影响较大；放射免疫法存在着环境污染问题；Western-blotting操作复杂，测定精密度低；而化学发光法灵敏度虽高，但测试程序复杂且检测成本较高，并且需要特定化学发光检测仪；胶乳免疫比浊法也是测定人血浆或尿液中NGAL浓度的常用方法，它与上述其他几种方法相比较，存在操作简单、灵敏度高、线性范围宽、无污染、应用范围广等显著的特点。因此，胶乳免疫比浊法有着极大的研究价值，但是目前市场上的胶乳免疫比浊法检测试剂盒存在着检测不到NGAL二聚体、NGAL/MMP-9复合物等问题，有待改进。中国专利CN103048464公开了一种NGAL检测试剂盒，采用中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体既能和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗原结合又能和MMP-9/NGAL复合物相结合，有效避免了NGAL/MMP-9复合物对检测结果的影响。但是此方法容易造成对游离MMP-9的非特异性反应的结果假阳性升高；另外，对NGAL二聚体的响应信号与NGAL单体相同，造成结果的假阴性降低。技术实现要素：为了解决现有技术的不足，本发明提供一种能够解离自身聚合形成46kD的同源二聚体，也能够解离与MMP-9聚合形成135kD的异源二聚体，释放出NGAL单体，消除上述两种二聚体对检测干扰的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的检测试剂盒。本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒，该试剂盒由试剂Ⅰ(R1)和试剂Ⅱ(R2)组成，所述试剂Ⅰ的组分包括缓冲剂；所述试剂Ⅱ的组分包括包被中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)抗体的胶乳颗粒，所述试剂Ⅰ还包括变性剂。本发明变性剂的加入能够解离自身聚合形成46kD的同源二聚体，也能够解离与MMP-9聚合形成135kD的异源二聚体，释放出NGAL单体，消除上述两种二聚体对检测干扰。本发明所述的变性剂优选为：盐酸胍、异硫氰酸胍、硫氰酸胍、尿素、SDS(十二烷基硫酸钠)中的一种或者两种以上。过度的变性则可能会影响抗体的特异性反应，因此变性剂的浓度选择是非常重要的；因此，本发明的变性剂浓度范围控制在0.01mmol/L～10mmol/L，进一步优选为0.1mmol/L～2mmol/L；在此浓度下NGAL聚集体解离，但是变性程度不大，基本维持其三维结构，不影响抗体的结合。由于同源异源二聚体中含有二硫键，试剂中如果添加巯基解离剂会使NGAL单体释放的更加彻底，因此，在试剂Ⅰ中添加将有助于NGAL的释放；优选的巯基解离剂为：三(2-羧乙基)膦、DTT(二硫苏糖醇)、GSH(谷胱甘肽)、半胱氨酸中的一种或者两种以上，优选的巯基解离剂的浓度为0.1mmol/L～2mmol/L。为了增加解离的速度，在试剂Ⅰ中添加表面活性剂是很有帮助的，对于解聚蛋白质两性离子表面活性剂却具有良好的作用，因此优选为两性离子表面活性剂；优选的两性离子表面活性剂为CHAPS(3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸)、3-磺丙基十四烷基二甲基铵、Pluracare1307中的一种或者两种以上，优选的两性离子表面活性剂的浓度为0.02％～1％(质量百分比)。在试剂Ⅰ中除了上述的两性离子表面活性剂外，还可以包括促进试剂体系中各组分以及检测样本中各物质的均匀分散及提高检测的精密度、达到减少样本浊度对测定结果的影响目的的表面活性剂；因此，现有的具有增溶性质的表面活性剂都可作为试剂Ⅰ的表面活性剂，例如，吐温20、吐温40、曲拉通X-100、乙基苯基聚乙二醇等中的一种或者两种以上。上述的两性离子表面活性剂可以单独添加，或者与具有增溶性质的表面活性剂混合添加到本发明的试剂Ⅰ中。本发明试剂Ⅰ中的缓冲剂是能够用于维持一定pH值的各种缓冲剂，例如可以是三羟甲基氨基甲烷(Tris)、三羟甲基甲胺基乙磺酸(TES)、2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸(HEPES)、三羟甲基甲胺基丙磺酸(TAPS)、哌嗪-1,4-二羟基丙磺酸(POPSO)、3-(N-吗啉)丙磺酸(MOPS)等各种常用生物缓冲液，为了达到更好的检测效果，试剂Ⅰ中所述的生物缓冲剂优选为三羟甲基氨基甲烷(Tris)。试剂Ⅰ还包括：促凝剂、防腐剂、稳定剂、阻断剂、螯合剂。试剂Ⅰ中的促凝剂可以促进抗原抗体反应，有利于胶乳颗粒交联物的形成和增大，提高检测灵敏度和线性范围，本发明检测试剂盒中的促凝剂优选为PEG-6000(PEG为聚乙二醇，PE6000)或PEG-8000(PEG8000)或NaCl等。试剂Ⅰ所述的防腐剂主要是为了防止细菌滋生导致的产品变质，所以任何一种能起到防止细菌滋生作用的防腐剂均能适用于本发明；本发明试剂Ⅰ中的防腐剂优选为Proclin-300(Proclin300)，该产品毒性小，使用剂量小，杀菌谱广。试剂Ⅰ中所述的稳定剂，主要作用是保护抗体的活性及防止胶乳颗粒的凝集、下沉，同时还可以增加试剂盒中各组分的稳定性，延长产品的货架期及开瓶后使用时间。常用的稳定剂为糖类、醇类、蛋白类(如牛血清白蛋白，BSA)以及一些氨基酸等中的一种或者两种以上的混合，本发明中的试剂Ⅰ中的稳定剂优选为蔗糖、BSA等。试剂Ⅰ中的阻断剂可以有效避免非特异性反应对检测结果的干扰。检测试剂盒中常见的干扰因素有以下两类：异嗜性抗体干扰、类风湿因子干扰。本发明优选的阻断剂为类风湿因子阻断剂。部分类风湿关节炎、各种胶原结缔组织病、肝病以及多种慢性疾病病人体内会出现的一类自身抗体，可与自身IgG分子的Fc段抗原决定簇起反应，该类抗体被称为类风湿因子。试剂Ⅰ中的螯合剂能够络合检测样本中的金属离子，以减少金属离子造成的干扰；因此，能够络合金属离子的各种螯合剂均能够适用，例如：乙二胺四乙酸二钠，氨基三乙酸、二亚乙基三胺五乙酸及其盐等中的一种或者两种以上，本发明试剂优选乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)为螯合剂。试剂Ⅱ包被中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)抗体的胶乳颗粒的制备，可以采用本领域技术人员所熟知的公知方法；优选的乳胶为表面带有羧基基团的聚苯乙烯乳胶微球，微球大小为优选为50～500nm，通过NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)、EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)活化微球表面羧基，进而交联抗体。试剂Ⅱ还包括：缓冲剂、防腐剂、稳定剂、助悬剂。试剂Ⅱ中所述的缓冲剂作用与试剂Ⅰ中相同，优选为3-(N-吗啉)丙磺酸(MOPS)。试剂Ⅱ中所述的防腐剂作用与试剂Ⅰ中相同，优选为Proclin-300。试剂Ⅱ中所述的稳定剂作用与试剂Ⅰ中相同，优选为蔗糖。试剂Ⅱ中所述的助悬剂可以帮助胶乳颗粒维持一个很好的分散状态，防止胶乳颗粒下沉影响检测试剂盒的品质及开瓶稳定性，常用的助悬剂有乙二醇、丙三醇、乳糖和麦芽糖等中的一种或者一种以上，本发明试剂Ⅱ优选乙二醇作为助悬剂。本发明的试剂Ⅰ还包括的：促凝剂、防腐剂、稳定剂、阻断剂、螯合剂；以及试剂Ⅱ还包括的：缓冲剂、防腐剂、稳定剂、助悬剂；以及缓冲剂等的浓度均为行业常规的浓度范围即可，不需要做特殊的限定。本发明的优点和有益效果:1.蛋白质的聚集体状态通过添加变性剂使之产生某种程度的变性，暴露出物理和(或)化学结合部位，然后巯基解离剂断裂化学结合部位的化学结合作用，表面活性剂则分散物理结合部位的物理结合作用，使聚集体解聚；因此，合适的变性剂、巯基解离剂、表面活性剂的种类和浓度选择就尤为重要，既要解聚聚集体，又不能干扰随后的免疫学检测；而本发明的变性剂、巯基解离剂、表面活性剂的种类和浓度通过特定的筛选和确定，正好解决了上述技术问题。2.本发明在试剂Ⅰ中添加两性离子表面活性剂，对于解聚蛋白质两性离子表面活性剂却具有良好的作用，同时还能提高解离速度。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。包被中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)抗体的胶乳颗粒的制备方法：1.羧化活化聚苯乙烯胶乳溶液的制备：称取0.1g粒径为150nm的聚苯乙烯胶乳颗粒((该聚苯乙烯胶乳颗粒为市售常规产品))干燥物，加入10mL0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.5)分散，然后加入4mg1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)，再加入2mg的NHS，在室温下搅拌反应0.5小时，离心弃上清液保留沉淀，再用10mL0.1M的磷酸盐缓冲液稀释分散沉淀胶乳既得羧化改性聚苯乙烯胶乳；2.NGAL抗体溶液的制备：将250μgNGAL抗体用0.5mL去离子水溶解，得到NGAL抗体溶液；3.包被NGAL抗体的胶乳颗粒的制备：取100μL第2步所制得的NGAL抗体溶液，用5mL0.1M磷酸盐缓冲液稀释后，加入5mL第1步制得胶乳溶液(羧化改性聚苯乙烯胶乳)，在室温下搅拌反应2小时，加入0.2mL0.1M甘氨酸缓冲液和2mL10％BSA溶液，搅拌30分钟，终止反应，离心弃上清液保留沉淀，用0.1M磷酸盐缓冲液洗涤沉淀2次，得到包被NGAL抗体的胶乳颗粒。实施例11、试剂Ⅰ的制备方法：按照下表配制试剂Ⅰ：试剂Ⅰ浓度三羟甲基氨基甲烷(Tris)0.1mol/L盐酸胍0.1mmol/L用NaOH或者HCl调试剂Ⅰ的pH值为7.4。2、试剂Ⅱ的制备方法：按照下表配制试剂Ⅱ：用NaOH或者HCl调试剂Ⅱ的pH值为7.0。实施例21、试剂Ⅰ的制备方法：按照下表配制试剂Ⅰ：用NaOH或者HCl调pH值为7.4。2、试剂Ⅱ的制备方法：按照下表配制试剂Ⅱ：用NaOH或者HCl调pH值为7.0。实施例31、试剂Ⅰ的制备方法：按照下表配制试剂Ⅰ：试剂Ⅰ浓度三羟甲基甲胺基乙磺酸(TES)0.1mol/LSDS0.15mmol/L曲拉通X-1000.1mmol/LPEG-60002％(w/w)CHAPS0.05％(w/w)DTT0.1mmol/L用NaOH或者HCl调pH值为7.4。2、试剂Ⅱ的制备方法：按照下表配制试剂Ⅱ：试剂浓度3-(N-吗啉)丙磺酸(MOPS)0.05mol/L制备的包被NGAL抗体的乳胶0.2％(w/w)Proclin-3000.025％(w/w)蔗糖10％(w/w)用NaOH或者HCl调pH值为7.0。实施例41、试剂Ⅰ的制备方法：按照下表配制试剂Ⅰ：用NaOH或者HCl调pH值为7.4。2、试剂Ⅱ的制备方法：按照下表配制试剂Ⅱ：试剂Ⅱ浓度3-(N-吗啉)丙磺酸(MOPS)0.05mol/L制备的包被NGAL抗体的乳胶0.2％(w/w)Proclin-3000.025％(w/w)蔗糖10％(w/w)乙二醇2％(w/w)用NaOH或者HCl调pH值为7.0。实施例51、试剂Ⅰ的制备方法：按照下表配制试剂Ⅰ：用NaOH或者HCl调pH值为7.4。2、试剂Ⅱ的制备方法：按照下表配制试剂Ⅱ：试剂Ⅱ浓度3-(N-吗啉)丙磺酸(MOPS)0.05mol/L制备的包被NGAL抗体的乳胶0.2％(w/w)Proclin-3000.025％(w/w)蔗糖10％(w/w)乙二醇2％(w/w)用NaOH或者HCl调pH值为7.0。对比例1试剂Ⅰ除了不加异硫氰酸胍、SDS、Pluracare1307、半胱氨酸之外，其它组分与实施例5相同；试剂Ⅱ与实施例5的试剂Ⅱ完全一样。实施例6将NGAL蛋白(购自R&D公司)，用生理盐水溶解，配制为5000ng/ml。添加Proclin-300使之浓度为0.1％。放置在2-8℃条件下3天，采用Superdex-200凝胶柱层析，监测280nm吸收，第一个峰为二聚体NGAL，第二个峰为NGAL单体。经浓缩分别得到NGAL同源二聚体和NGAL单体高浓度溶液。采用考马斯亮蓝-G250染色法分别测定二者的蛋白浓度，配制成下表所示的浓度，分别采用实施例1-5和对比例1测试其浓度。NGAL测试方法：校准品浓度：4800ng/ml、3200ng/ml、1600ng/ml、800ng/ml、400ng/ml、0ng/ml，采用单体NGAL溶液配制；测试波长：主波长：570nm，副波长：800nm；加样方式：R1：S：R2＝150μl：4μl：50μl；校准方式：spline；读点方式：在150μl的R1中加入样本4μl，37℃反应5min，读取吸光度A1，然后加入R2，反应5min，读取吸光度A2，计算A2-A1。结果如下(单位：ng/ml)：表1：NGAL二聚体对测试的影响从上表可以看出实施例1-5的结果相比对比例1而言，更加接近蛋白的真实浓度。受NGAL聚合形态的影响更小，避免检测结果偏低导致的临床误诊和误判。实施例7从医院取回尿液样本，采用HumanMMP-9/NGALcompleximmunoassay(购自R&D公司)进行检测，选取20支MMP-9/NGAL浓度较高的样本，再采用实施例1-5和对比例1测试NGAL浓度(测试方法同实施例6)，结果如下表2所示(单位：ng/ml)：表2：MMP-9/NGAL二聚体对测试的影响表2NGAL浓度从表2中可见本发明检测试剂盒检测的NGAL含量要高于对比实施例1-4所制备的检测试剂盒，说明本发明试剂盒可以避免NGAL/MMP-9复合物对检测结果的影响，避免检测结果偏低导致的临床误诊和误判。对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。当前第1页1 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