一种快速检测铜离子的方法与流程

本发明属于检测技术领域，具体是涉及一种基于非标记Amplex Red染料分子检测铜离子的快速检测方法。

背景技术：

铜是人体必需的微量元素之一，铜离子浓度的缺失或过量直接影响人体健康。若铜离子浓度过高，影响肝肾的正常代谢，造成胃肠道功能性紊乱；可沉淀在脑和心脏处，造成神经退行性疾病；与蛋白质活性基团紧密结合，改变酶的立体结构或者取代酶内所需的金属辅助因子，从而使其失去催化活性，对生物和人体造成毒害作用。

生物体和人体内的铜可通过日常生活中是食物如水等摄入。世界卫生组织(WHO)和美国环境保护署(EPA)规定生活饮用水中铜离子的标准量分别为：2mg/mL，1.3mg/mL。建立快速、高灵敏度铜离子的检测方法对于食品安全检测及保护国民身体健康具有重要意义。

目前，国内外检测铜离子的方法主要有酶分析法，免疫分析法和比色法。酶分析法具有快速、稳定等特点，但该方法需要特殊的样品预处理，另外酶费用高且容易受外界环境影响失去活性等不足。免疫分析法是一种常用的检测方法，具有快速、灵敏等特点，但是重金属分子质量较小且带有电荷趋向于和生物分子发生强烈的不可逆反应，自身作为抗体识别目标特异性不强；比色法不需要大型仪器，操作简单，适用于现场实时检测，但检测的专一性和精确性不够，多为定性或半定量检测。因此，需要开发一种简单灵敏的铜离子的检测方法。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明创造旨在提出一种快速检测铜离子的方法。为达到上述目的，本发明创造的技术方案如下：

对目标物实现精度高、准确性高的快速检测方法是分析化学的一个重要发展方向。本发明提供一种快速检测铜离子的方法。本方法将铜离子与Amplex Red(10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine)和H₂O₂混合，进行孵育相互作用后，在铜离子作用下可增强Amplex Red的荧光，其荧光增强与铜离子浓度呈线性相关，通过检测Amplex Red荧光强度即可实现对铜离子的快速检测。

同时，本发明也提供了一种快速检测双氧水的新途径。之前的报道中通常基于酶催化Amplex Red检测生物体中的双氧水(Free Radical Biology&Medicine,2016,95,323-332)。酶的使用不仅价格高，而且使用条件比较受限，容易受到外界环境如温度、缓冲体系等的影响，最终影响检测结果。本发明可克服以上不足，一方面可用于铜离子的检测，另一方面，还可以用于双氧水的无酶检测。

本发明具体包括以下步骤：

(1)在0.001-0.5μM不同浓度铜离子溶液中同时加入0.1μM Amplex Red和8mM H₂O₂溶液，用荧光分光光度仪检测非标记荧光染料Amplex Red的荧光强度，激发波长为540nm，发射波长为583nm；

(2)根据Amplex Red，H₂O₂与0.001-0.5μM铜离子浓度作用后的荧光强度得到拟合曲线及线性回归方程；

(3)在待测溶液中同时加入0.1μM Amplex Red和8mM H₂O₂溶液，用荧光分光光度仪检测非标记荧光染料Amplex Red的荧光强度，激发波长为540nm，发射波长为583nm；根据步骤(2)得到的线性回归方程计算待测溶液中铜离子的浓度。

本发明所述的方法是一种无酶免标的快速检测方法。

相对于现有技术，本发明创造所述的铜离子的检测方法具有以下优势：

本发明利用铜离子，Amplex Red和H₂O₂作用，具有免标记、灵敏度高和特异性强且检测费用低的优势。

附图说明

构成本发明创造的一部分的附图用来提供对本发明创造的进一步理解，本发明创造的示意性实施例及其说明用于解释本发明创造，并不构成对本发明创造的不当限定。在附图中：

图1为本发明创造实施例所述的铜离子增强Amplex Red和H₂O₂荧光强度的原理验证实验数据。

图2为本发明创造实施例所述的Amplex Red和H₂O₂荧光强度随铜离子浓度变化的拟合曲线图。

图3为本发明创造实施例所述AR荧光响应与铜离子低浓度范围的线性关系。

图4为本发明创造实施例所述AR荧光响应与铜离子高浓度范围的线性关系。

图5为本发明创造实施例所述的检测多种重金属离子(Cr³⁺，Fe²⁺，Zn²⁺，Ca²⁺，Mg²⁺，Cd²⁺，Ni²⁺，Pb²⁺，Fe³⁺，Hg²⁺)特异性干扰实验数据。

具体实施方式

为了使本发明上述特征和优点更加清楚和容易理解，下面将结合附图对本发明的实施方式作进一步详细描述。

实施例1

0.5μM铜离子溶液与0.1μM Amplex Red荧光染料混合后(a)；0.1μM Amplex Red荧光染料与8mM H₂O₂混合后(b)；0.5μM铜离子溶液，0.1μM Amplex Red荧光染料与8mM H₂O₂混合后(c)，利用荧光分光光度仪测其荧光强度(如图1所示)。激发波长为540nm，发射波长为583nm。

实施例2

0.001-0.5μM的铜离子溶液与Amplex Red染料混合后，利用荧光分光光度仪测其荧光强度。激发波长为540nm，发射波长为583nm。以铜离子浓度为横坐标，以(F-F₀)/(F'-F₀)为纵坐标做拟合曲线，其中F₀、F和F’分别表示没加铜离子时Amplex Red在584纳米处的荧光强度，添加不同浓度铜离子后Amplex Red的荧光强度及加入0.5μM铜离子时Amplex Red在583纳米处的荧光强度(如图2所示)，可得到Amplex Red荧光响应与铜离子浓度分别在0.001～0.008μM，0.008～0.1μM的两区域浓度范围内的线性关系(如图3、图4所示)，根据图3得到式(1)的线性回归方程，根据图4得到式(2)的线性回归方程：

Y＝15.36184X+0.00703 式(1)；

Y＝5.32477X+0.1024 式(2)。

实施例3

选择Cr³⁺，Fe²⁺，Zn²⁺，Ca²⁺，Mg²⁺，Cd²⁺，Ni²⁺，Pb²⁺，Fe³⁺，Hg²⁺作为竞争物，研究该方法的特异性。配制0.5μM Cu²⁺和0.5μM其他金属离子。分别与Amplex Red荧光染料及8mM H₂O₂混合，利用荧光分光光度仪测其荧光值。如图5所示，铜离子可以强烈的增加Amplex Red的荧光。而其他干扰金属离子对其荧光影响较小。说明该方法对铜离子具有特异性。

实施例4

以XX矿泉水和XX纯净水为实际样品，无需进行样品处理，分别添加铜离子量为：0.02,0.05,0.08μM；再将实际样品加入Amplex Red(0.1μM)与H₂O₂(8mM)的混合溶液中反应，进行样品检测。根据检测结果确定根据式(2)计算得出铜离子的实际检出浓度，据此计算加标回收率(见表1)，证明此方法可应用于实际样品检测。

Y＝5.32477X+0.1024 式(2)

表1

实际样品中添加铜离子后，利用得到的线性方程计算出铜离子的实际检出量，可以得到回收率符合80-120％内，说明此方法用于检测铜离子的浓度是准确。

以上所述仅为本发明创造的较佳实施例，并不用于限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。