一种超高效液相色谱法测定维生素B时用的色谱柱的制作方法

本实用新型属于色谱柱技术领域，具体来说，涉及到一种超高效液相色谱法测定维生素B时用的色谱柱。

背景技术：

糜子的基本结构由四部分组成，包括含有纤维素的麸皮，含较丰富营养素的糊粉层，含大量淀粉的胚乳，富含蛋白质、脂肪、矿物质、B族维生素和维生素E的谷胚。糜子作为常见的谷物是人们膳食“金字塔”中最基础的部分，其最突出的营养特点是含有丰富的B族维生素。B族维生素是水溶性维生素中重要的一类，其中多种是酶的辅基和酶的组成部分。当人体内缺乏B族维生素时，便可导致多种疾病的产生，而人体自身又无法合成这些化合物，必须通过食物链或服用复合维生素制剂给予补充。

随着人们对生活品质要求的提高，复合维生素制剂及高档营养品的出现，同时测定谷物中B族维生素的含量引起人们的广泛关注。已有B族维生素的检测方法很多，荧光法、微生物法、分光光度法、自动测定法、高压液相色谱法和高效毛细管电泳法等。这些方法多数是针对某个单一维生素的测定，近年来国内外学者对多种B族维生素的同时测定进行了大量研究，出现了许多分析方法，其中以高效液相色谱法和高效毛细管电泳法为代表的色谱分析法较为突出。目前水溶性 维生素种类多、结构复杂、分析测定困难。超高效液相色谱法测定水溶性成分效果较好，但色谱柱种类相对有限。

技术实现要素：

为解决以上问题，本实用新型提供了一种分离度好、重现性好的超高效液相色谱法测定维生素B时用的色谱柱。

本实用新型所述的一种超高效液相色谱法测定维生素B时用的色谱柱，所述色谱柱包括柱管1、柱帽2、柱塞6、固定相层3、过滤密封元件4和标签卷绕架5；柱管1整体为空心圆柱形，上下两端处的外壁长于内壁，形成内部横档，用于搁置过滤密封元件4；柱帽2有两个，密封盖合在柱管1两端；柱帽2中央设有带内螺纹的圆孔，该圆孔与带外螺纹的柱塞6能密封配合；标签卷绕架5呈半个圆形或半个长方形，焊接在柱管1外侧；固定相层3由C18键合硅胶相堆积而成，C18键合硅胶相的密度为3-4毫克每立方毫米。

本实用新型所述的一种超高效液相色谱法测定维生素B时用的色谱柱，所述色谱柱内径为2.1mm，长度为100mm。

本实用新型所述的一种超高效液相色谱法测定维生素B时用的色谱柱，所述C18键合硅胶相的平均粒径为1.8m。

本实用新型所述的一种超高效液相色谱法测定维生素B时用的色谱柱，所述柱管1与柱帽2通过内外螺纹相接。

本实用新型所述的一种超高效液相色谱法测定维生素B时用的色谱柱，所述过滤密封元件4由筛板和密封垫片组成，筛板嵌装在密封垫片内。

与现有技术相比，本实用新型所述的超高效液相色谱法测定维生素B时用的色谱柱的填有高密度、细粒径的C18键合硅胶相，分离效果好，适宜分离水溶性物质；设有的标签卷绕架不仅能贴标签，也便于使色谱柱从盒子中取出；而且结构简单，易于生产制造，经济成本低。

附图说明

图1是超高效液相色谱法测定维生素B时用的色谱柱示意图。图2是维生素混标的超高效液相色图谱。图3是糜子样品的超高效液相色谱图。柱管-1、柱帽-2、固定相层-3、过滤密封元件-4、标签卷绕架-5、柱塞-6。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本实用新型所述的超高效液相色谱法测定维生素B时用的色谱柱做进一步说明，但是本实用新型的保护范围并不限于此。

实施例1

一种超高效液相色谱法测定维生素B时用的色谱柱，包括柱管1、柱帽2、柱塞6、固定相层3、过滤密封元件4和标签卷绕架5；柱管1整体为空心圆柱形，上下两端处的外壁长于内壁，形成内部横档，用于搁置过滤密封元件4；柱帽2有两个，密封盖合在柱管1两端；柱帽2中央设有带内螺纹的圆孔，该圆孔与带外螺纹的柱塞6能密封配合；标签卷绕架5呈半个圆形，焊接在柱管1外侧；固定相层3由C18键合硅胶相堆积而成，C18键合硅胶相的密度为3毫克每立方毫米。所述 色谱柱内径为2.1mm，长度为100mm。所述C18键合硅胶相的平均粒径为1.8m。所述柱管1与柱帽2通过内外螺纹相接。所述过滤密封元件4由筛板和密封垫片组成，筛板嵌装在密封垫片内。

色谱柱分离维生素B效果验证

1实验仪器及步骤

1.1材料与试剂

标准品：维生素B₁(硫胺素)、维生素B₂(核黄素)、维生素B₆(盐酸吡多醇)、(叶酸)维生素B₉均为中国食品药品检定研究院；乙腈、甲酸均为色谱纯；氢氧化钠、盐酸均为优级纯。实验用水均为二次蒸馏水。样品材料：山西省农科院品资所提供的河曲红糜子。

1.2仪器与设备

仪器：超高效液相色谱仪：(Waters HClass，美国waters)；本实用新型所述的色谱柱；电子天平(BSA124S，德国Sartorius)；高速离心机(5804R，Eppendorf)；恒温水浴锅(HHS，上海博讯)；漩涡混合器(VORTEX-5，海门市其林贝尔仪器)。

1.3实验方法

1.3.1维生素标准储备液的配制

分别准确称取10mg VB₁、VB₆标准品于25mL棕色容量瓶中，加入15mL浓度为0.01mol/L盐酸溶液并充分振荡，超声15min，待全部溶解后，用0.01mol/L盐酸溶液定容，即得浓度为0.4mg/mL的储备液。

分别准确称取7.5mg VB₂及VB₉标准品于25mL棕色容量瓶中，先 用1.5mL浓度为2mol/L的NaOH溶液溶解后，再加0.01mol/L盐酸溶液定容，超声15min，即得浓度为0.3mg/mL的储备液。低温避光保存。

1.3.2超高效液相色谱(UPLC)分析条件

流动相A：乙腈；流动相B：0.1％甲酸；柱温20℃；紫外检测器，波长275nm；进样体积5L；流速0.3mL/min，采用梯度洗脱，梯度洗脱程序见表1，分析运行时间10min。

表1梯度洗脱程序

1.3.3工作曲线的绘制

分别吸取一定量的6种标准储备溶液配成不同系列的浓度，于2mL离心管中，配成0.05g/mL～2g/mL浓度的混标溶液。按照上述条 件进样，以峰面积对质量浓度绘制标准曲线。得到4种维生素的线性方程并以3倍信噪比计算相应的检出限。

1.3.4样品预处理方法

称取5g糜子(精确至0.01g)于150mL锥形瓶，用35mL 0.1％甲酸水溶解，超声提取60min后，加入乙酸锌和铁氰化钾溶液混匀，冷却至室温后转移至50mL容量瓶中用0.1％甲酸定容，混匀，滤纸过滤，取滤液过0.22mm水系滤膜，待上机。样品谱图见图2。

2结果与分析

2.1色谱条件的优化

2.1.1流动相选择

流动相pH值对这4种水溶性维生素的保留时间有影响，pH值越大，保留时间越短，确定最佳pH范围。

考虑到流动相的选择对维生素B的色谱分离效果影响较大，实验结果表明，乙腈-0.1％甲酸作为流动相均能较好的实现混标中4种维生素B的分离，结果见附图2。从图中可以看出乙腈-0.1％甲酸为流动相分离效果较好。各维生素B的出峰顺序为：VB₁：0.520min、VB₆:0.990min、VB₉:5.572min、VB₂:6.019min。

2.1.2色谱柱温对分离效果的影响

乙腈-0.1％甲酸为流动相，分别考察了同等条件下，柱温为30℃与20℃时的分离效果，通过对照可以看出，柱温变化对混标中4种维生素B的分离效果影响不大。

2.1.3梯度洗脱条件

色谱条件：流动相A为乙腈，B为0.1％甲酸，柱温20℃，波长275nm，流速0.3mL/min，利用超高效液相色谱柱可以明显缩短检测时间并有较好的分离度。

2.2标准曲线，线性范围和检出限

以标准溶液浓度为横坐标c，峰面积为纵坐标y，得到回归方程。4种水溶性维生素均具有良好的线性，相关系数R²>0.99，满足检测需要。方法的线性回归方程、相关系数及检出限，结果见表。在本试验方法所确定的实验条件下，取一系列标准溶液进行超高效液相色谱测定，以峰面积y对浓度c(ng/mL)做图，找出线性关系。并确定方法最低检测限。

表1四种维生素的标准曲线

2.3精密度与回收率

本法回收率实验选用已知B族维生素含量的糜子样品为基质，设 定了3个添加水平，对每个浓度样品进行6次重复实验，测得4种水溶性维生素回收率和相对标准偏差(RSD)。VB₁、VB₂、VB₆、VB₉、测定回收率分别为96.8％、97.8％、98.9％和102.2％，测定结果的相对标准偏差(RSD)小于2％。

2.4实际样品检测

分别用所建立的超高效液相色谱法测定糜子样品中的水溶性维生素，得到的实际测定数据与国标法实测值比较，图3中的结果表明相对误差在1.5％～2.1％，均在允许范围内，说明此法测得的糜子样品的数据准确可靠，适用于糜子及谷物中水溶性维生素的同时测定。糜子中VB₁、VB₂、VB₆、VB₉的含量分别为：1233.838μg/100g样品、326.191μg/100g样品、1759.678μg/100g样品、724.676μg/100g样品。

3结论

通过采用了本实用新型所述色谱柱的UPLC进行检测，10分钟完成4种水溶性维生素B的测定，方法具有良好的准确度、精密度。测定结果与国标法测定数据比较，结果均在允许范围内，可对较宽浓度范围内的糜子多种水溶性维生素进行同步分析，有助于提高糜子检测的分析效率，降低成本。丰富糜子水溶性维生素品质评价体系，鉴选优良种质。