一种免疫印迹薄膜及其制备方法与流程

本发明属于蛋白质分析领域，更具体地，涉及一种免疫印迹薄膜及其制备方法与应用。

背景技术：

免疫印迹(westernblot)技术是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的技术。免疫印迹常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。结合化学发光检测，可以同时比较多个样品同种蛋白的表达量差异。由于免疫印迹具有sds-page的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。

免疫印迹技术所用的薄膜为硝酸纤维素膜、尼龙膜或聚偏氟乙烯膜，形状为条状(《抗体技术实验指南》，科学出版社，2002.9)。该薄膜仅能进行单个待测样本的单次检测，若需进行多个待测样本的平行检测，则需将该多个蛋白样本转移到不同的薄膜上后，针对不同的薄膜单独进行孵育，同时进行振荡以加快反应速度。因此使用该薄膜具有以下缺点：一、在进行平行检测时，反应效率低下；二、由于免疫印迹薄膜需要浸泡在待测样本溶液中，所需的样本量大，耗费试剂，且难以进行痕量检测；三、薄膜需要进行干燥后显色拍照，再进行分析，从而无法实现原位检测；四、由于薄膜通常浸泡在不同窗口或反应槽中，不同薄膜的反应条件略有差异，从而影响免疫印迹的准确性。以上缺点也间接导致了应用该薄膜进行免疫印迹的自动检测仪器的结构较为复杂，生产成本较高。

技术实现要素：

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种免疫印迹薄膜及其制备方法，其目的在于将薄膜表面划分为多个亲水区域，从而实现多个蛋白样本的平行检测。

为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种免疫印迹薄膜，所述免疫印迹薄膜表面具有以疏水区域间隔的多个平行的条状亲水区域，所述条状亲水区域具有一个或多个结合区，所述结合区上具有目标抗原，用于结合免疫印迹的目标抗体。

优选地，所述条状亲水区域具有多个结合区，所述多个结合区包括实验区以及对照区。

作为进一步优选地，所述对照区包括阳性对照区、阴性对照区或结合物对照区。

优选地，所述条状亲水区域的材料为硝酸纤维素、尼龙或聚偏氟乙烯。

优选地，所述疏水区域具有硅烷基。

作为进一步优选地，所述疏水区域的材料为聚二甲基硅氧烷或其衍生物。

优选地，所述条状亲水区域以及疏水区域的宽度为1mm～5mm。

优选地，所述免疫印迹薄膜沿条状亲水区域的方向绕制为卷轴结构。

作为进一步优选地，所述卷轴结构的直径为2cm～6cm。

作为进一步优选地，所述卷轴结构绕制于支撑轴上。

作为更进一步优选地，所述支撑轴为圆柱状或圆筒状。

按照本发明的另一方面，还提供了一种上述免疫印迹薄膜的制备方法，包括：

在衬底膜上结合目标抗原，以形成与目标抗原的数量相同的结合带，所述衬底膜的材料为硝酸纤维素、尼龙或聚偏氟乙烯；

用疏水涂料在衬底膜上形成疏水区域，以将衬底膜分隔为多个条状亲水区域，同时将结合带分隔为结合区，使得每个条状亲水区域都具有与目标抗原的数量相同的结合区。

按照本发明的另一方面，还提供了一种上述免疫印迹薄膜的制备方法，包括：

将多个条状亲水薄膜平行贴制于疏水薄膜上，使得所述疏水薄膜上具有与多个条状亲水薄膜形成的多个平行的条状亲水区域，所述条状亲水区域以疏水区域相间隔。

优选地，所述疏水薄膜表面具有与条状亲水薄膜相配合的凹槽，所述凹槽用于固定条状亲水薄膜。

总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，由于通过疏水区域，将免疫印迹薄膜分隔为多个平行的条状亲水区域，能够取得下列有益效果：

1、在同一张免疫印迹薄膜上，可以检测多个目标抗体的样本，从而提高了平行检测的反应效率；

2、免疫印迹薄膜具有以疏水区域间隔的多个平行的条状亲水区域，通过亲水区域的吸附力与目标抗体结合，从而更加节省试剂，同时适用于痕量检测；

3、免疫印迹薄膜由于通过亲水区域的吸附力与目标抗体结合，从而使得所需的溶液量较少，简化了检测步骤，更适用于原位检测；

4、多个目标抗体的样本结合于同一张免疫印迹薄膜上，从而更适于在完全相同的条件下进行反应，更容易进行平行对照，提高了检测的准确率。

附图说明

图1为本发明实施例1俯视图；

图2为本发明实施例1制作过程示意图；

图3为本发明实施例2制作过程示意图；

图4为本发明实施例3制作过程示意图；

图5为本发明实施例4结构示意图；

在所有附图中，相同的附图标记用来表示相同的元件或结构，其中：1-免疫印迹薄膜，11-疏水区域，12-亲水区域，13-结合区，2-支撑轴。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

本发明提供了一种免疫印迹薄膜1，所述免疫印迹薄膜1表面具有以疏水区域11间隔的多个条状亲水区域12，所述条状亲水区域12的材料为硝酸纤维素、尼龙或聚偏氟乙烯，以便结合目标抗原，所述疏水区域11通常为具有硅烷基的有机疏水聚合物，同时还可能携带有硅氧基或硅羟基，如聚二甲基硅氧烷或其衍生物；

所述条状亲水区域12沿其长度方向具有一个或多个结合区13，所述结合区13上具有目标抗原，所述目标抗原用于与免疫印迹的目标蛋白结合；当所述条状亲水区域12包括多个结合区13时，结合区13可分为实验区以及对照区，实验区用于与目标蛋白结合，而对照区根据其功能，可分为阳性对照区、阴性对照区或结合物对照区；其中，阳性对照区通常含有能与待测溶液中除目标抗体以外的其它成分结合的抗原，例如，当以血液为待测溶液时，阳性对照区的目标抗原则可采用血清抗体，阳性对照区显色证明免疫印迹薄膜1未变质，且待测溶液种类无误；而阴性对照区可涂覆有未标记的二抗，使得在标准条件下阴性对照区无法显色，若其显色，证实可能有免疫印迹薄膜1变质等异常情况，应该更换免疫印迹薄膜1而重新测定；而结合物对照区的目标抗原为igg结合物、igm结合物或iga结合物，由于igg、igm和iga为常见的免疫球蛋白，结合物对照区的存在可指示目标抗体是否已经成功结合。

所述条状亲水区域12以及疏水区域11的宽度通常为1mm～5mm，在便于做免疫印迹测试的同时，可保证各条状亲水区域12完全间隔，同时有效利用免疫印迹薄膜1的空间。

为了便于储存和使用，所述免疫印迹薄膜1可沿条状亲水区域的方向围绕圆柱状或圆筒状的支撑轴2绕制为直径为2cm～6cm的卷轴结构，如图5所示。

该免疫印迹薄膜1的制备方法大致分为两种：

第一种：在衬底膜上结合目标抗原，以形成与目标抗原的数量相同的结合带，所述衬底膜的材料为硝酸纤维素、尼龙或聚偏氟乙烯；用疏水涂料在衬底膜上形成疏水区域11，以将衬底膜分隔为多个条状亲水区域12，同时将结合带与结合带对应的结合区13，使得每个条状亲水区域12都具有与目标抗原的数量相同的结合区13；该疏水涂料需要无毒，且在37度以下即可干燥，以免影响目标抗原的活性，如专利文件cn201380057250中的疏水涂层。

第二种：将多个条状亲水薄膜平行贴制于疏水薄膜上，使得所述疏水薄膜上具有与多个条状亲水薄膜形成的条状亲水区域12，所述条状亲水区域12以疏水区域11相间隔；所述疏水薄膜表面可以设置有与条状亲水薄膜相配合的凹槽，以于与条状亲水薄膜结合并固定，使得条状亲水区域12所在的表面低于疏水所在的表面，这样可进一步保证条状亲水区域12之间的反应液不会互相影响混合。

上述免疫印迹薄膜1可应用于免疫印迹检测，以间接法进行化学发光检测为例，具体包括以下步骤：

s1.在距条状亲水区域12上方0.1mm～2mm处设置与条状亲水区域12数量对应的加液管，将多种待测溶液通过加液管以添加于不同的条状亲水区域12表面，使待测溶液中的目标抗体与结合带上的目标抗原完全结合；同时，使得加液管的条状亲水区域12以1cm/s～15cm/s的速度相对往复运动，运动的同时，仍可以将待测溶液通过加液管缓慢添加于条状亲水区域12表面，以防液体蒸发，以保持条状亲水区域12上的液面高度为0.1mm～1mm；在此情况下，经计算，即使将加液管中残留的待测溶液计算在内，所需的待测溶液的体积也仅需数十微升至毫升级；

s2.在各条状亲水区域12的一端可设置集液管，集液管的一端距条状亲水区域12上方0.1mm～2mm，另一端连接真空泵，在反应完成后，真空泵通过集液管抽吸条状亲水区域12上多余的待测溶液；

s3.以s1-s2.中同样的方式，以缓冲液替代原加液管中的待测溶液，将免疫印迹薄膜1表面的待测溶液冲洗干净；由于缓冲液通常为pbs等成本较低的溶液，相对于待测溶液，可以添加较多体积；

s4.以s1-s2.中同样的方式，以二抗溶液替代原加液管中的缓冲液，使得二抗完全与目标抗体结合；

s5.以s3.中同样的方式，以缓冲液替代原加液管中的二抗溶液，将免疫印迹薄膜1表面的二抗溶液冲洗干净；

s6.以s1-s2.中同样的方式，以化学发光剂溶液替代原加液管中的缓冲液，使得标记过的二抗发光；

s7.以s3.中同样的方式，以缓冲液替代原加液管中的化学发光剂溶液，将免疫印迹薄膜1表面的化学发光剂溶液冲洗干净；

s8.获得免疫印迹检测结果。

实施例1

图1为本发明实施例1的免疫印迹薄膜1，其材料为尼龙膜；该免疫印迹薄膜1表面具有以疏水区域11间隔的多个条状亲水区域12，所述条状亲水区域12以及疏水区域11的宽度均为1mm，所述条状亲水区域12具有一个或多个结合区13，所述结合区13上具有目标抗原；

该免疫印迹薄膜1的制备方法如图2所示，首先在尼龙的衬底膜上结合四种目标抗原，以形成四条结合带，如图2a-b所示；然后用疏水涂料在衬底膜上形成疏水区域11，以将衬底膜分隔为多个条状亲水区域12，同时将结合带分隔为与结合带数量相同的结合区13，使得每个条状亲水区域12都具有与目标抗原的数量相同的结合区13，如图2c所示，即获得图1所示的免疫印迹薄膜1。疏水涂料的成分为1.448wt％的原硅酸四乙酯，0.1588wt％的十二烷基三甲氧基硅烷，0.0698wt％的氢氧化铵，0.1938wt％的hcl，208wt％的乙醇以及78.1198wt％的软化水。

实施例2

图3为本发明实施例2免疫印迹薄膜1的制作过程示意图，先放置聚二甲基硅氧烷(pdms)的衬底，然后将具有多个结合区13的，宽度为3mm的硝酸纤维素薄膜以3mm的间隔粘制于衬底上。

实施例3

图4为本发明实施例3免疫印迹薄膜1的制作过程示意图，与实施例2的区别在于，在该pdms衬底上，每间隔5mm，有一条5mm宽的凹槽，宽度为5mm的聚偏氟乙烯薄膜可以刚好粘制于该凹槽内。

实施例4

图5为本发明实施例4免疫印迹薄膜1结构示意图，与实施例1的区别在于，长度为10cm的免疫印迹薄膜1绕制于直径约为3.2cm的支撑轴2上。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。