一种MOF模板无酶超氧阴离子电化学传感器及其修饰的玻碳电极的制备的制作方法

本发明涉及一种无酶超氧阴离子电化学传感器材料，尤其涉及一种MOF（金属有机骨架材料）模板无酶超氧阴离子电化学传感器的制备方法；本发明同时还涉及该电化学传感器修饰的玻碳电极的制备方法，用于对活细胞中超氧阴离子（O2•−）的电化学检测，属于电化学检测领域和生理学及病理学研究领域。
背景技术：
：活性氧(ROS)是重要的细胞内信号分子，主要用于调节DNA损伤、蛋白质合成、细胞凋亡等等。其中，超氧阴离子(O2•−)作为最重要且最活跃的ROS之一，参与了许多生理和病理过程，会对生物器官造成损伤。近年来，O2•−浓度与人类健康之间的关系引起了极大关注。从体内应用学的角度，要求O2•−的动态检测线性范围宽，不仅在毫摩尔、微摩尔的摩尔浓度，甚至需要延伸至纳摩尔级别的摩尔浓度。与此同时，由于O2•−极不稳定，很容易衰变为其它活性氧单元。因此，建立高效、可靠的定性定量检测方法仍是一个难点。电化学方法由于其简单易用、低成本、可靠性高、灵敏度高、选择性好、检出限低而受到广泛关注。研究较为广泛的是将铜-锌超氧化物歧化酶(Cu-ZnSOD）固定在电极表面构建酶传感器。然而，由于酶的活性中心被表面蛋白质覆盖，造成电子传递困难。此外，酶的价格昂贵，容易失活，对环境要求较高，酶电极的制备较为繁琐且不易储存，这些不足都大大限制了酶传感器的发展。因此，研制具有低检测限的无酶超氧阴离子传感器就显得尤为重要。随着纳米技术的发展，纳米材料尤其是贵金属及金属氧化物，在改善传感器性能方面起着至关重要的作用。贵金属及金属氧化物由于其可以降低O2•−在裸电极上的过电位，故在电化学传感器中可以很好地代替酶来催化O2•−，因而被广泛用于O2•−传感器的构建。Co3O4对于活性氧的氧化具有很好的电催化活性，从而被广泛关注及应用。然而，O2•−传感器的催化性能与Co3O4纳米粒子的大小、形状、结晶度及分布情况有着密切的关系。因此，选择一种合适的Co3O4合成方法非常重要。技术实现要素：本发明的目的是提供一种基于MOF模板的无酶超氧阴离子电化学传感器的制备方法；本发明的另一目的是一种基于上述电化学传感器修饰的的玻碳电极的制备方法，主要用于对活细胞中的O2•−进行检测。一、MOF模板无酶超氧阴离子电化学传感器的制备本发明以金属节点为钴纳米粒子的金属有机框架材料与碳纳米管（MWCNTs）为前躯体，对其进行碳化及进一步的氧化，制得一种小颗粒四氧化三钴纳米粒子Co3O4@C-MWCNTs复合材料。其具体制备工艺如下：（1）MOF-MWCNTs复合材料的制备：将六水合硝酸钴、苯并咪唑以及多壁碳纳米管超声分散于二甲基甲酰胺中，以3~5℃/min的速率加热加热至100~130℃并保持24~36h，之后以0.2~0.4℃/min降至室温，得到的灰紫色晶体，离心，洗涤，真空干燥，得MOF-MWCNTs复合材料；六水合硝酸钴与苯并咪唑的质量比为1:0.8~1:1；碳纳米管的用量为六水合硝酸钴及苯并咪唑总质量的5~50%。（2）Co3O4@C-MWCNTs复合材料的合成：将上述制备的MOF-MWCNTs复合材料置于管式炉中，氩气保护下以1~3℃/min的速率加热至500~700℃并恒温1.5~2h，随后降至室温，得到黑色粉末；黑色粉末继续在管式炉中以1~2℃/min的速率加热至200~250℃并恒温60~90min，随后降至室温，得到Co3O4@C-MWCNTs复合材料。二、修饰电极的制备及电化学性能1、修饰电极的制备（1）玻碳电极预处理：将经清洗处理的玻碳电极插入含有1.0mM铁氰化钾探针分子的0.1M氯化钾电解质溶液中，并采用以玻碳电极为工作电极、铂柱为对电极、饱和甘汞电极为参比电极组成的三电极体系进行循环伏安扫描；取出电极用二次蒸馏水冲洗并吹干。循环伏安扫描的工艺条件为：扫速：50mV/s，扫描电位窗设置为-0.8V~0.2V，扫描圈数为3~4圈。（2）Co3O4@C-MWCNTs修饰电极的制备：将Co3O4@C-MWCNTs复合材料溶于水与乙醇的混合液中，配成0.2~1.0mg/mL的分散液，然后滴涂在上述处理好的玻碳电极上，室温干燥，制得Co3O4@C-MWCNTs修饰玻碳电极。水与乙醇的混合液中，二者的体积比为1:0.5~1:2。2、修饰电极的电化学性能测试以Co3O4@C-MWCNTs修饰电极为工作电极、铂柱为对电极、饱和甘汞电极为参比电极组成三电极体系，将其共同浸入含有1.0mMO2•−的N2饱和的0.2MpH=7.0的磷酸盐缓冲溶液中进行循环伏安扫描。电化学表征结果表明（图3），Co3O4@C-MWCNTs/GCE对O2•−的还原有明显的电催化作用，以MOF为模板合成的Co3O4@C-MWCNTs复合材料，不仅有效的提高了修饰电极的导电性，改善了Co3O4纳米粒子的大尺寸及团聚现象，另外，该复合材料具有大的比表面积及介孔结构，为快速捕获溶液中的O2•−提供条件，进一步提高O2•−在修饰电极上的电化学响应。本发明相对于现有技术具有以下优点：1、本发明利用MOF为模板构建了一种新型的Co3O4@C-MWCNTs无酶O2•−传感器，相比于传统酶传感器，该传感器制备简单，易操作，成本低，可以长期保存使用；2、本发明的修饰电极对O2•−有超灵敏的电化学响应，宽的线性范围：5.00×10-12~1.00×10-4mol/L，低的检测限：1.67×10-12mol/L，以及好的稳定性和重复性等优点，在生命病理分析中具有极大的潜在价值，并有望应用于与O2•−有关的医学疾病诊断。附图说明图1为本发明所制备不同材料的透射电镜图（TEM）。其中，A：MOF；B：Co3O4@C复合材料；C、D：Co3O4@C-MWCNTs复合材料。图2为本发明所制备不同材料的扫描电镜图（SEM）。其中，A：MOF；B：MWCNTs；C：Co3O4@C复合材料；D：Co3O4@C-MWCNTs复合材料Co3O4@C-MWCNTs复合材料(插图为Co3O4的粒度分布图)。E图和F图分别为MWCNTs与Co3O4@C-MWCNTs复合材料的X射线衍射图（XRD）和拉曼光谱图（Raman）。图3为a:裸电极；b:Co3O4@C-MWCNTs/GCE在含有1.0mM的O2•−的N2饱和的0.2MPBS（pH=7.0）中的循环伏安曲线。c是Co3O4@C-MWCNTs/GCE在不含O2•−的N2饱和的0.2MPBS（pH=7.0）中的循环伏安曲线。图4为Co3O4@C-MWCNTs/GCE对不同浓度的O2•−检测的线性扫描伏安曲线图（图4A，4C）及O2•−的还原峰电流与其浓度之间的线性关系图（图4B，4D）。图5为Co3O4@C-MWCNTs/GCE在含有1×105个鼠肾上腺嗜铬细胞（PC12）的生理PBS缓冲溶液中不同情况下检测PC12释放出的O2•−的计时电流曲线图。具体实施方式下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步的说明。仪器和药品：CHI660C电化学工作站（上海辰华仪器公司）用于进行循环伏安、线性扫描伏安、计时电流的实验，石英管加热式自动双重纯水蒸馏器（1810B，上海亚太技术玻璃公司）用于蒸超纯水。电子天平（北京赛多利斯仪器有限公司），用于称量药品。超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。三氧化二铝打磨粉（0.30μm，0.05μm，上海辰华仪器试剂公司）用于处理玻碳电极。饱和甘汞参比电极，铂对电极，氯化钾、氯化钠、磷酸二氢钠（西安化学试剂厂）；多壁碳纳米管（深圳纳米港有限公司）；苯并咪唑、六水合硝酸钴、超氧化钾（阿拉丁试剂）；二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺（北京化学试剂厂）；18-冠醚-6、4A型分子筛（上海能源化学有限公司）；超氧化物歧化酶、12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇、酵母多糖A、3-[3-(胆酰胺丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸内盐（美国西格玛奥德里奇）。实施例1、Co3O4@C-MWCNTs电化学传感器材料的制备a.MOF-MWCNTs复合材料的制备：将0.84g六水合硝酸钴、0.68g苯并咪唑、不同质量的碳纳米管（5，10，20，30，40，50wt%六水合硝酸钴与苯并咪唑总质量），分散在含有72mL二甲基甲酰胺的100mL玻璃烧瓶中，超声1h分散均匀。将烧瓶置于烘箱中，以5℃/min的速率加热至130℃并保持36h，之后以0.4℃/min降至室温，得到的灰紫色晶体，1200rmp离心，二甲基甲酰胺洗4次，60℃真空干燥。b.Co3O4@C-MWCNTs复合材料的合成：将步骤a制备的MOF-MWCNTs复合材料置于管式炉中，氩气保护1h（流速为30mL/h）。之后以3℃/min的加热速率加热至700℃并恒温2h，随后降至室温，得黑色粉末。紧接着将黑色粉末继续在管式炉中以1℃/min的速率加热至250℃并恒温90min，随后降至室温，得Co3O4@C-MWCNTs复合材料。比较例：a.MOF的合成：将0.84g六水合硝酸钴和0.68g苯并咪唑分散在含有72mL二甲基甲酰胺的100mL玻璃烧瓶中，超声分散均匀。将烧瓶置于烘箱中，以5℃/min的速率加热至130℃并保持36h，之后以0.4℃/min降至室温，得到的紫色晶体，1200rmp离心，二甲基甲酰胺洗4次，60℃真空干燥。Co3O4@C的合成：将MOF置于管式炉中，氩气保护1h（流速为30mL/h）。之后以3℃/min的加热速率加热至700℃并恒温2h，随后降至室温，得黑色粉末。紧接着将黑色粉末继续在管式炉中以1℃/min的速率加热至250℃并恒温90min，随后降至室温，得Co3O4@C复合材料图1为上述制备的不同材料的透射电镜图TEM图。其中，A：MOF；B：Co3O4@C复合材料的TEM图，图C、D分别为不同放大倍数的Co3O4@C-MWCNTs复合材料的TEM图。从图A可以清楚地看出MOF材料的晶体结构；从B图中可以看到，MOF中的碳成分部分自主合成为石墨碳及碳纳米管，另外，大尺寸的Co3O4纳米粒子呈团聚状态包覆在其余碳基底内，平均尺寸为50~60nm。从图C、D可以看出，当加入多壁碳纳米管后，小尺寸的Co3O4纳米粒子（30~35nm）均匀地分散在碳纳米管管壁上，团聚现象明显改善。图2为上述制备不同材料的扫描电镜图（SEM）、X射线衍射图（XRD）及拉曼光谱图（Raman）。其中，图A和B为MOF和MWCNTs的扫描电镜结构图，从图A、B知道，MOF为具有棱角的多面晶体结构，高密度的MWCNTs呈管状紧密地交织在一起。图C为Co3O4@C纳米复合材料的SEM图，图D为Co3O4@C-MWCNTs复合材料（SEM），二者相比，我们可以看出，当加入多壁碳纳米管后，Co3O4的大尺寸团聚现象消失，小尺寸的Co3O4纳米粒子牢固地附着在碳纳米管上，且能保持MOF自身的介孔骨架结构而不坍塌。D中的插图为Co3O4纳米粒子的粒度分布图，由插图可知Co3O4纳米粒子的粒径约为30nm，这一结果与TEM所述一致。图E为MWCNTs（a）及Co3O4@C-MWCNTs（b）的X射线衍射图（XRD），曲线a中2θ=22~25°和41°的两个峰分别对应于MWCNTs(002)、(101)晶面。曲线b中除了具有碳纳米管的两个晶面峰外，其余特征峰一次对应于Co3O4纳米粒子的(111)，(220)，(311)，(222)，(400)，(422)，(511)，(440)，(533)及(622)晶面。图F为MWCNTs（a）及Co3O4@C-MWCNTs（b）的拉曼光谱图（Raman），其中1348cm-1处的D峰和1598cm-1处的G峰是碳材料标志性的峰。D峰对应于碳材料上缺陷处的sp3杂化碳原子，而G峰对应于碳材料上sp2杂化的平面碳原子。我们常用拉曼光谱中D峰与G峰的强度比（ID/IG）表示碳材料的缺陷密度。如图F，b曲线的ID/IG为1.60，而a曲线ID/IG为1.21，这进一步证明了Co3O4@C-MWCNTs具有更多的结构缺陷及介孔特征。此外，b曲线上483.4cm-1和696.0cm-1的两个峰分别为O和Co的振动峰，结合图E，这些结果证明最终材料已成功制备，且纯度很高。对加入不同质量碳纳米管对于电化学传感器的性能影响做了电流优化，发现，碳纳米管的质量为六水合硝酸钴及苯并咪唑总质量的30%时，对超氧阴离子响应性能最好。实施例2、电化学传感器修饰的玻碳电极的制备及应用a.玻碳电极预处理。玻碳电极依次用0.30μm、0.05μm的三氧化二铝悬浊液抛光成镜面，再依次经体积分数为95%的乙醇、二次蒸馏水超声清洗后，得到处理后的玻碳电极；插入含有1.0mM铁氰化钾探针分子的0.1M氯化钾电解质溶液中，并采用以玻碳电极为工作电极、铂柱为对电极、饱和甘汞电极为参比电极的三电极体系进行循环伏安扫描，对裸玻碳电极进行表征；再将电极取出用二次蒸馏水冲洗并吹干，备用。b.制备Co3O4@C-MWCNTs修饰电极。将实施例1得到的Co3O4@C-MWCNTs溶于水与乙醇的混合液中（v:v=1:1），配成1.0mg.mL-1的分散液；取6µL的分散液滴涂在直径为3mm上述处理好的玻碳电极上，室温下干燥，得Co3O4@C-MWCNTs修饰玻碳电极。c采用步骤b所得修饰电极为工作电极、铂柱为对电极、饱和甘汞电极为参比电极组成三电极体系（扫速：50mV/s，电位窗设置为-0.8V~0.2V。），得到修饰电极对O2•−的电化学响应。图3为a:裸电极；b:Co3O4@C-MWCNTs/GCE在含有1.0mM的O2•−的N2饱和的0.2MPBS（pH=7.0）中的循环伏安曲线。c是Co3O4@C-MWCNTs/GCE在不含O2•−的N2饱和的0.2MPBS（pH=7.0）中的循环伏安曲线。由图3可得：相比于裸电极，O2•−在Co3O4@C-MWCNTs/GCE上的还原峰电位发生了略微正移，且还原峰电流显著的增大，这表明Co3O4@C-MWCNTs/GCE对O2•−的还原有明显的电催化作用，这主要归因于四氧化三钴纳米粒子对O2•−的还原有很强的催化性能。以MOF为模板合成的Co3O4@C-MWCNTs复合材料，不仅有效的提高了修饰电极的导电性，改善了Co3O4纳米粒子的大尺寸及团聚现象，另外，该复合材料具有大的比表面积及介孔结构，为快速捕获溶液中的O2•−提供条件，进一步提高O2•−在修饰电极上的电化学响应。图4为Co3O4@C-MWCNTs/GCE对不同浓度的O2•−检测的计时电流曲线图（A、C）、O2•−的还原峰电流与其浓度的线性关系图（B、D）。由图可知，本传感器线性范围非常宽，达到9个数量级，我们以浓度为横坐标，以电流值为纵坐标作图，发现整体呈现两段线性，其中，低浓度范围内电流与lg[浓度]呈线性，高浓度范围内电流与浓度直接呈线性。对O2•−检测的线性范围为5×10-12~3×10-6mol/L、3×10-6~1×10-4mol/L，检测限为1.67×10-12mol/L。本发明与其他O2•−传感器相比（表1），检测范围宽，检测限低，检测过程简单，灵敏度高、快速简便。表1为本发明与现有的O2•−传感器对O2•−检测性能的比较：电极线性范围(μM)检测限(nM)SOD/海藻酸钠/玻碳电极0.4-229.9230SOD/孔状铂-钯/丝网印刷电极16-536130SOD/铂-钯/多壁碳纳米管/丝网印刷电极40-1550710氧化锌/SOD/氧化铟锡电极0.12-250100聚二烯丙基二甲基氯化铵/多壁碳纳米管-铂/玻碳电极0.7-3000100银纳米粒子/L-半胱氨酸-多壁碳纳米管/玻碳电极7×10-5-74.12.33×10-2四氧化三钴@碳基底-多壁碳纳米管/玻碳电极5×10-6-1001.67×10-33、Co3O4@C-MWCNTs/GCE对活细胞中超氧阴离子（O2•−）的电化学检测a.鼠肾上腺嗜铬细胞(PC12)在湿度为95%的37℃恒温的DMEM培养基中培育24小时，该培养基的主要成分包括：10%热灭活的胎牛血清，100U/mL的青霉素，100mg/mL的链霉素，5%的CO2。将培养好的PC12细胞的培养基移除，用磷酸盐缓冲溶液洗涤三次，后加入3mL磷酸盐缓冲溶液于待测细胞中。PC12细胞数目约为1×105个/孔板。b.将上述三电极体系共同浸入含有鼠肾上腺嗜铬细胞（PC12）的0.2MPBS（pH=7.4），利用同浓度三种不同的刺激物刺激PC12释放O2•−（12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇（PMA）、酵母多糖A（ZymosanA）、3-[3-(胆酰胺丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸内盐（CHAPS）），并用计时电流法进行检测选出最优刺激物，进而得到修饰电极对O2•−的计时电流曲线。c.采用origin软件作图，绘制步骤循环伏安曲线、计时电流曲线以及O2•−峰电流与其浓度对数、浓度之间的线性关系图。图5显示了Co3O4@C-MWCNTs/GCE在含有1.5×105个鼠肾上腺嗜铬细胞（PC12）的0.2MPBS（PH=7.4）中不同情况下检测PC12释放出的O2•−的计时电流曲线图。图A为比较同浓度三种不同的刺激物刺激PC12释放O2•−情况的计时电流曲线图（12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇（PMA）、酵母多糖A（ZymosanA）、3-[3-(胆酰胺丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸内盐（CHAPS））。由图可知，在刺激物浓度一定的情况下，PMA刺激下PC12释放O2•−电流响应最大，因此本发明选择PMA为最优刺激物进行实验。由图B可知，当在空白PBS中滴加5mg/mLPMA（曲线a）或未刺激的PC12（曲线b）时，均无明显电流变化产生，且曲线b的稳态电流明显高于曲线a，这可能是因为超灵敏的修饰电极可以检测到PC12自身所产生的ROS。当连续加入5mg/mLPMA刺激PC12时，电流响应明显增加（曲线c）。这说明PC12在刺激下能够短时间内释放大量的O2•−。为了证实增加的电流响应是由刺激的PC12所释放的O2•−引起的，我们在曲线c200s处加入300U/mL超氧阴离子的特异性酶（SOD），此时响应电流显著降低至基线，这说明本修饰电极能够成功检测到PC12所释放的O2•−，这为进一步研究与O2•−相关的生理学及病理学奠定了基础。当前第1页1 2 3