一种基于拉曼光谱测量的细胞培养液质量检测方法与流程

本发明属于细胞培养液检测领域，尤其涉及一种基于拉曼光谱测量的细胞培养液质量检测方法。
背景技术：
：使用拉曼光谱技术结合化学计量学方法可开发出一种快速、高效且无创的检测方法，用于评价复杂组分的细胞培养液，从而判断细胞生长状态。由于不需要进行复杂的样本制备，且水没有响应信号，拉曼光谱技术在对多组分水溶液检测上具有显著的优势。光谱技术操作方便，成本低廉，已广泛应用于医学领域，在应用理念和技术创新方面具有突破性。在实际应用中，迫切需要一种能够快速、准确且成本较低的细胞活性鉴定技术。低分子量代谢物作为细胞调控进程中的最终产物，可以揭示生物系统对营养及环境因素改变的应答，更快速地反映细胞活力。因此，可以通过测量细胞培养液中的代谢产物变化和培养基消耗偏好来对细胞生长质量进行评估。对于细胞培养液影响细胞发育的机理方面，早期有较多研究集中在分析某几种明确的代谢物，以作为生物标记物来表征细胞发育潜力，但由于代谢物水平存在时序性和多样性，目前并无明确的生物标记物可以在所有的培养条件和培养过程中适用，哪些成分对细胞生长活性起核心作用也没有定论。近期有研究关注于分析整个代谢指纹图谱，即对特定生理阶段或发育期细胞中所有低分子量化合物(相对分子量<1000)的动态定量分析。当前使用拉曼光谱法检测细胞培养液的研究尚处于发展阶段。现有技术中有使用avalon拉曼光谱仪检测了五种化学成分清晰的混合物溶液，如多种氨基酸、多种有机酸或无机酸等，使用主成分分析法和独立软模式类簇法进行数据分析比较，所建立的分析模型可准确的进行培养基质量鉴定。还有使用拉曼光谱仪检测多种cho细胞培养液，使用最小二乘法进行数据分析，建立了拉曼光谱法在线无创实时测定培养液中葡萄糖和乳酸含量的方法。本文在已有研究的基础上，通过检测同一类型细胞在同等培养条件下的培养液的拉曼光谱，使用支持向量机法对数据进行分类建模，建立了完善的数据采集、预处理及数据建模流程，实现了高效的且无创的细胞生长活性鉴定，可进一步推广做临床应用。技术实现要素：发明目的：本发明旨在提供一种准确率高、检测流程简便、成本低廉的基于拉曼光谱测量的细胞培养液质量检测方法。技术方案：一种基于拉曼光谱测量的细胞培养液质量检测方法，包括如下步骤：(1)细胞培养液的采集：取经细胞培养一段时间的细胞培养液；(2)拉曼光谱信号的采集：使用拉曼光谱技术测量步骤(1)所得细胞培养液中代谢产物的原始拉曼光谱信号；判断原始拉曼光谱信号是否合格，是则进入步骤(3)，否则，重复对该细胞培养液进行拉曼光谱技术测量；(3)拉曼光谱信号的处理：对步骤(2)获取的合格原始拉曼光谱信号进行数据信号处理，得到可分析信号；(4)拉曼光谱信号的分析：对步骤(3)得到的可分析信号进行差异统计分析得到差异信号，利用差异信号建模，并利用支持向量机对差异信号进行分类，对正常和异常的细胞培养液光谱信号进行区分，得到细胞培养液质量结果。进一步的，所述步骤(1)中所取的细胞培养液为7微升。进一步的，所述7微升细胞培养液放置在微量溶液检测池中。进一步的，所述微量溶液检测池包括半球面反射镜，或者由半球面反射镜和圆柱面反射镜构成反射镜组，所述半球面反射镜和反射镜组都具有高反射的镜面。进一步的，所述镜面镀介质膜或惰性金属膜。进一步的，所述步骤(1)中一段时间为3-4天。进一步的，所述步骤(2)判断原始拉曼光谱信号是否合格过程为：0.5％的乙醇溶液在880cm-1处散射峰绝对峰强cv≤5％，拉曼位移波动范围≤2cm-1。进一步的，所述步骤(3)中对获取的原始拉曼光谱信号进行数据信号处理步骤包括：1)对获取的原始拉曼光谱信号进行数据校正；利用最小二乘算法，通过最小化误差的平方和寻找数据的最佳函数匹配，最佳函数匹配通过让采样点跟拟合曲线的距离平方和最小实现数据校正；2)将经数据校正后的信号进行去除荧光信号背景；a利用墨西哥帽小波为母函数的连续小波模式匹配方法准确确定峰位置；b.继续利用以haar小波为母函数的连续小波求导方法确定峰的起始位置；c.利用惩罚最小二乘法拟合出平滑可调背景；3)对去除荧光信号背景的信号进行均一化处理基于stouffer'sz-score算法对去除荧光信号背景的信号进行均一化处理，得到可分析信号。有益效果：相对于现有技术，本发明通过拉曼光谱检测细胞培养液中差异信号，检测出细胞培养液质量，从而达到无创评价细胞生长状态的目的，从而在多个领域有重要价值，例如在临床应用中可推广至胚胎质量无创检测，在医药重组蛋白生产时，可进行实时在线检测细胞生长和蛋白表达状态。本发明便捷有效、低成本、适宜大规模推广，且不受地域限制、专业人员缺乏的限制，可大规模产业化、流程化。附图说明图1为本发明方法流程图；图2为本发明中一种微量溶液检测池示意图；图3为本发明中另一种微量溶液检测池示意图；图4为本发明实施例中最佳重复测量次数对比图；图5为本发明实施例中k值与频率关系图；图6为本发明实施例中信号处理前后对比图；图7为本发明实施例中list1和list2的u检验t值分布图；图8为本发明实施例中list1和list2的p值差异最大的100个点示意图。具体实施方式下面将结合附图，对本发明进行详细的描述：如图1所示，本发明所述的一种基于拉曼光谱测量的细胞培养液质量检测方法，包括如下步骤：(1)细胞培养液的采集：取经细胞培养一段时间的细胞培养液；(2)拉曼光谱信号的采集：使用拉曼光谱技术测量步骤(1)所得细胞培养液中代谢产物的原始拉曼光谱信号；判断原始拉曼光谱信号是否合格，是则进入步骤(3)，否则，重复对该细胞培养液进行拉曼光谱技术测量；判断原始拉曼光谱信号是否合格过程为：0.5％的乙醇溶液在880cm-1处散射峰绝对峰强cv≤5％，拉曼位移波动范围≤2cm-1。(3)拉曼光谱信号的处理：对步骤(2)获取的合格原始拉曼光谱信号进行数据信号处理，得到可分析信号；对获取的原始拉曼光谱信号进行数据信号处理步骤具体为：1)对获取的原始拉曼光谱信号进行数据校正；利用最小二乘算法，通过最小化误差的平方和寻找数据的最佳函数匹配，最佳函数匹配通过让采样点跟拟合曲线的距离平方和最小实现数据校正；2)将经数据校正后的信号进行去除荧光信号背景；a利用墨西哥帽小波为母函数的连续小波模式匹配方法准确确定峰位置；b.继续利用以haar小波为母函数的连续小波求导方法确定峰的起始位置；c.利用惩罚最小二乘法拟合出平滑可调背景；3)对去除荧光信号背景的信号进行均一化处理基于stouffer'sz-score算法对去除荧光信号背景的信号进行均一化处理，得到可分析信号。(4)拉曼光谱信号的分析：对步骤(3)得到的可分析信号进行差异统计分析得到差异信号，利用差异信号建模，并利用支持向量机对差异信号进行分类，对正常和异常的细胞培养液光谱信号进行区分，得到细胞培养液质量结果。下面结合具体实施例详述本发明所述的基于拉曼光谱测量的细胞培养液质量检测方法，其包括如下步骤：(1)细胞培养液的采集：取经按标准方法培养的细胞培养液。使用经接种后第3-4天的细胞培养液7微升，使用拉曼光谱技术测定细胞培养液中代谢产物的光谱信号。由于溶液是极微量的，所以该过程必须在为此技术设计的微量溶液检测池中方能进行信号检测。如图2、3所示，所述微量溶液检测池是由半球面反射镜和圆柱面反射镜构成，或者由半球面反射镜组成，通过采用金刚车对金属铝或铜进行加工，获得高反射的镜面，对探测光和拉曼散射光都有很高的反射；为防止氧化或者腐蚀所述镜面可镀介质膜或惰性金属膜。拉曼检测使用785nm激光和由半球面反射镜和圆柱面反射镜构成的微量溶液检测池。检测池放入预设好的固定装置中，使圆柱面反射镜中心与激光束同心并使激光束焦点与半球面反射镜圆心重合。(2)拉曼光谱信号的采集：使用拉曼光谱技术测量步骤(1)所得细胞培养液中代谢产物的原始拉曼光谱信号；判断原始拉曼光谱信号是否合格，是则进入步骤(3)，否则，重复对该细胞培养液进行拉曼光谱技术测量。由于光谱信号的特性，对于同一样本需要进行多次重复测量，以此提高光谱信号的检测精度。本实施例中，数据建模和测试的样本数如表1所示。表1数据建模和测试的样本数根据贝塞尔公式，理论上标准偏差是一个常量δ，随着测量次数的增多，s值逼近δ，而不是趋近于零。适当增多测量次数，可以提高算数平均值的精密度，也便于发现出大误差。但是测量次数达到一定值后，比如10次以后，平均值的标准差随着测量次数的增加减少的很慢。贝塞尔公式：其中：s(vi)为实验标准差；n为重复测量次数；v为n次测量结果的算术平均值。根据这一结论，我们从list2的文件列表中随机抽取2-30个样本计算其sd1值，并且比较其sd1与全部的list2计算的到的sd2之间的差值大小。具体如图4所示，图4中差值曲线：表示随机抽样得到的sd减去list2全部样本的sd值；差值变化趋势曲线：表示增加样本量后相邻两个取样点之间的差值，可反映随着样本量的增加，抽样得到的sd越来越趋近与真实样本的sd值。从图4可知在，在第9次抽样后，差值变化趋势曲线的变化范围越来越稳定，其sd值越来越趋近与真实值，所以可以选择9为最少的测量次数。(3)拉曼光谱信号的处理：对步骤(2)获取的合格原始拉曼光谱信号进行数据信号处理，得到可分析信号。由于细胞培养液体积只有7微升，信号中有较强的背景干扰(大约99.9％的信号来自于培养液背景)，可以预见由于细胞代谢对培养液引起的涨落信号不到0.1％。利用背景信号消除算法，从而到达降低噪声信号，增强目标信号的目的。对获取的原始拉曼信号需要进行数据信号处理，该步骤包括：1)数据校正；2)去除荧光信号背景；3)均一化。1)对获取的原始拉曼光谱信号进行数据校正；利用最小二乘算法，通过最小化误差的平方和寻找数据的最佳函数匹配，最佳函数匹配通过让采样点跟拟合曲线的距离平方和最小实现数据校正；2)将经数据校正后的信号进行去除荧光信号背景；首先，利用墨西哥帽小波为母函数的连续小波模式匹配方法准确确定峰位置；然后，继续利用以haar小波为母函数的连续小波求导方法确定峰的起始位置；最后，利用惩罚最小二乘法拟合出平滑可调背景；3)对去除荧光信号背景的信号进行均一化处理为了使多组数据能够进行比较，需要对数据进行均一化，基于stouffer'sz-score算法对去除荧光信号背景的信号进行均一化处理，得到可分析信号。为了增强目标信号，我们使用的是stouffer'sz-score算法，这就需要确认k值的最佳解。按照不同的参数k统计list1中数据与list2数据中的差异点(p＜0.05)，为了选择最优化的参数k，我们需计算每个参数k下所有异常点的频率(公式1)，这样我们得到list1下面各个参数k的频率，如表2所示。公式1：公式1说明：a、常数24：我们对k进行5-51，step＝2进行取值，总共进行了24组异常点数据；b、该位点在不同参数k中出现异常次数：在当前k值下的某个异常位点在所有24次分析中出现的次数；c、当前k值下异常点数目：在当前k值下，所有p<0.05的点的数目；公式1计算得到的在当前k值下freq1频率分布，如图3所示，选取频率最大的k值做为最优k。可以发现当k＝29时，频率达到最高。表2list1下面各个参数k的频率表k值579111315频率0.5270.6300.6560.6840.7170.749k值171921232527频率0.7520.7630.7580.7650.7720.776k值293133353739频率0.7780.7740.7730.7720.7590.743k值414345474951频率0.7360.7230.7190.7050.6890.674确定最优k值后，利用背景信号消除算法，可以得到经过处理后的信号，其处理前后信号比较如图6所示。如图7、8所示，对处理后list1和list2信号进行双样本u检验比较，找出差异最大的100个数据点(或者p值<0.05的数据点)，作为后续svm分类所需的明显差异点。(4)拉曼光谱信号的分析：对步骤(3)得到的可分析信号进行差异统计分析得到差异信号，利用差异信号建模，并利用支持向量机对差异信号进行分类，对正常和异常的细胞培养液光谱信号进行区分，得到细胞培养液质量结果。(5)利用支持向量机(supportvectormachine，svm)算法对细胞培养液进行分类：由于细胞培养液正常/异常分类使用的是svm算法，所以对正常细胞培养液信号和异常细胞培养液信号进行分组(训练集和预测集)，训练集包含样本409例，预测集中包含样本200例(100例正常细胞培养液、100例异常细胞培养液)。经svm算法分析后，结果显示在细胞培养液中信号识别率为78％。表3svm分类结果统计正常细胞培养液(svm)异常细胞培养液(svm)正常细胞培养液(原始)7228异常细胞培养液(原始)1684本发明通过细胞培养液的采集；拉曼光谱信号的采集、处理和分析；使用拉曼光谱技术测量细胞培养液中代谢产物的原始拉曼光谱信号；判断原始拉曼光谱信号是否合格，对合格的原始拉曼光谱信号进行数据信号处理，得到可分析信号；再对可分析信号进行差异统计分析得到差异信号，利用差异信号建模，并利用支持向量机对差异信号进行分类，对正常和异常的细胞培养液光谱信号进行区分，得到细胞培养液质量结果。本发明通过拉曼光谱检测细胞培养液中差异信号，检测出细胞培养液质量，从而达到无创评价细胞生长状态的目的，且本发明便捷有效、低成本，可大规模产业化、流程化。当前第1页12