一种ASE‑HPLC法测定黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的方法与流程

本发明属于化学检测领域，尤其是一种ase-hplc法测定黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的方法。
背景技术：
：《中国药典》2015年版一部制备供试品方法：供试品溶液的制备取本品粉末(过四号筛)约1g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，加热回流4小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。该方法回流时间较长，且对技术人员的专业水平较高。技术实现要素：针对上述不足，本发明旨在提供一种ase-hplc法测定黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的方法，该方法提取时耗时少，且检测精度高。为了实现上述技术效果，本发明提供的技术方案是这样的：一种ase-hplc法测定黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的方法，依次包括下述步骤：步骤1：采用ase法萃取黄芪粉末，并收集甲醇萃取液；步骤2：采用hplc法测定甲醇萃取液中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量。优选地，所述的步骤1包括下述子步骤：步骤s1：将黄芪样品粉碎，过四号筛，取1g与1g硅藻土混合；步骤s2：将步骤s1所得的混合物装于放有滤膜的ase萃取池中，加硅藻土至与池口平行；步骤s3：用甲醇萃取，结束后，将其蒸干后，再用甲醇定容至10ml，过滤。优选地，步骤s3所述的萃取参数为：压力为1500psi，温度为110℃，时间为5min，次数为3次，冲洗体积为60％，吹扫时间为60％。优选地，步骤2所述的hplc法的检测参数为仪器：色谱柱为thermosyncronisdim.aq；柱温为40℃；流速为0.3ml/min；流动相为甲醇-醋酸-水；检测波为283nm。优选地，所述的色谱柱的规格为1.7μm，50×2.1mm。优选地，所述的流动相为体积比等于35:4:65的甲醇-醋酸-水。优选地，所述的ase萃取池的体积为10ml。优选地，步骤s3所述的过滤步骤所使用的滤膜为0.22μm。本发明与传统方法相比，具有下述优点：本发明曾对快速溶剂萃取使用的溶剂进行考察，有论文提到使用50％乙醇提取毛蕊异黄酮葡萄糖苷相对含量较高，杂质较少，故对使用甲醇和50％乙醇进行了溶剂考察，结果显示甲醇与50％乙醇提取毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量一致，且杂质峰基本相同，故采用与药典一致的提取溶剂。本发明采用3因素3水平正交实验方案l9(33)安排实验，考察了3个因素对加速溶剂萃取黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷过程的影响。并最终确定最佳的葡萄糖苷的快速溶剂萃取工艺。附图说明图1为以毛蕊异黄酮葡萄糖苷的浓度(ng)-峰面积进行的线性回归图；图2为毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品的色谱图；图3为采用ase法萃取所得的样品供试品溶液的色谱图；图4为采用药典方法提取所得的样品供试品溶液的色谱图。具体实施方式下面结合具体实施方式，对本发明的权利要求书做进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制，任何在本发明的权利要求保护范围内所做的有限次修改，仍在本发明的权利要求保护范围内。实施例11、仪器设备及试剂1.1仪器：电子分析天平(xa205du)、ase350快速溶剂萃取仪(美国dionex公司)、thermou3000uhplc液相色谱仪1.2试剂：水：符合gb/t6682规定的一级水；甲醇(ch4o)：色谱纯(液相色谱用)；醋酸(ch3cooh)：分析纯。1.3材料黄芪(产地内蒙古，批号1511100；产地甘肃，批号15081901；产地内蒙古，批号150718)均购于梧州或玉林药材市场，经广西梧州食品药品检验所副主任中药师黄蘅鉴别。对照品毛蕊异黄酮葡萄糖苷由中国生物制品检定研究院提供，批号：111920-201505。2、方法2.1对照品溶液的制备：取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含50μg的溶液，即得。2.2供试品溶液的制备《中国药典》2015年版一部制备供试品方法：供试品溶液的制备取本品粉末(过四号筛)约1g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，加热回流4小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。快速溶剂萃取法(ase)制备供试品方法：样品经粉碎机粉碎，过四号筛，约1g，精密称定，与1g硅藻土混合均匀，待用，移入到预先放好过滤膜的ase10ml萃取池中再加入适量硅藻土，轻轻振摇使之与池口在同一水平线上，拧紧萃取池上盖。萃取结束后，把萃取液转移至蒸发皿中蒸干后用甲醇溶解并定容至10ml容量瓶，溶液过0.22微米滤膜后进入hplc测定。2.3ase萃取条件压力为1500psi，温度为110℃，时间为5min，次数为3次，冲洗体积为60％，吹扫时间为60％。2.4色谱条件与系统适用性试验a)仪器：agilent1290高效液相色谱仪；b)色谱柱：thermosyncronisdim.(mm)aq，1.7μm，50×2.1mm；c)柱温：40℃；d)流速：0.3ml/min；e)流动相：：甲醇-醋酸-水(35:4:65)；f)检测波长：283nm；以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；理论板数按毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰计算应不低于3000。2.5测定法照高效液相色谱法(通则0512)测定分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。2.6标准限值要求本品按干燥品计算，含毛蕊异黄酮葡萄糖苷(c22h22o10)不得少于0.020％。2.7计算(外标法)式中cr—对照品溶液浓度，单位为微克每升(mg/l)；ax—供试品的峰面积；ar—对照品峰面积。注意：使用前萃取池底部应拆卸清理干净，否则容易引起压力不稳；萃取池底部的滤纸应在密封圈内，否则引起渗漏；萃取池装样时松紧适中，太松容易导致提取液过多；开机前检查气瓶气压是否达到1mpa；使用结束后清理干净，萃取池要及时晾干(容易生锈)。3、结果3.1线性关系取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品溶液(0.06358mg/ml),分别精密吸取该溶液0.1μl、0.3μl、0.5μl、1.0μl、1.2μl进入lc测定，并依照上述方法测定。以浓度(ng)-峰面积进行线性回归，求得回归方程：y＝11.334x+22.62、r2＝0.9914,毛蕊异黄酮葡萄糖苷在6.358～76.296ng范围内呈良好的线性关系。表1毛蕊异黄酮葡萄糖苷的线性实验结果3.2重复性试验取相同批号的样品(批号：1511100)1.0g，共5份，精密称定，按ase提取方法提取供试品溶液，进样量为1μl，以上述的色谱条件平行试验，测得样品结果见表1，rsd为1.9％。表2重复性实验结果批号重复性1重复性2重复性3重复性4重复性5rsd％15111000.02850.02890.02770.02850.02911.9％3.3精密度和稳定性试验取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品溶液(0.06358mg/ml)，连续进样6次，记录峰面积，峰面积rsd为2.3％，表明仪器精密度良好。取同一供试品溶液，室温下放置，分别于0，2，4，8，12h依法测定。结果黄芪甲苷峰面积的rsd为2.7％，表明供试品溶液在12h内稳定。3.4样品不同仪器提取结果及与药典方法结果比较(3批)表3表44、讨论：4.1ase提取溶剂的选择：在实验中曾对快速溶剂萃取使用的溶剂进行考察，有论文提到使用50％乙醇提取毛蕊异黄酮葡萄糖苷相对含量较高，杂质较少，故对使用甲醇和50％乙醇进行了溶剂考察，结果显示甲醇与50％乙醇提取毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量一致，且杂质峰基本相同，故采用与药典一致的提取溶剂。4.2ase提取条件的优化在上述实验基础上，我们采用3因素3水平正交实验方案l9(33)安排实验，考察了3个因素对加速溶剂萃取黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷过程的影响。本实验确定萃取温度、静态萃取时间、循环次数为考察因素(见表5)。确定l从黄芪中提取毛蕊异黄酮葡萄糖苷的最佳快速溶剂萃取工艺，结果见表6。表5因素水平表6正交实验极差分析结果由极差分析可以看出，提取温度对毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量影响最大，其次是提取次数和提取时间。最终确定最佳提取工艺组合为提取温度110℃，提取时间5min，提取次数3次。以上所述的仅为本发明的较佳实施例，凡在本发明的精神和原则范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围内。当前第1页12