一种基于光激活的单分子荧光共振能量转移的方法与流程

技术领域：

本发明属于生物大分子成像领域，更具体地，涉及一种突破现有全内反射荧光显微技术中的荧光浓度屏障的新型成像技术和方法。

背景技术：
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单分子荧光技术可以在复杂体系内实时观测生物分子的动态过程，并揭示隐藏在传统系综平均测量中的重要信息，包括生物分子之间的差异性以及反应过程中的瞬时中间态等。单分子荧光手段的以上优点使得它近年得到了广泛的关注和应用，其快速发展使得很多传统的生物学问题得以用新实验技术来解决(sasmald.k.etal.,nanoscale,2016,8,19928-19944)。

运用最为广泛的单分子技术之一是基于全内反射荧光显微镜的单分子荧光共振能量转移技术(fret)：单个荧光供体和受体形成的fret对被激光激活并检测其发出的荧光强度，供体和受体之间的荧光共振能量转移(fret)效率的变化可以表征fret配对标记位点之间相对距离的变化，从而反映分子构型的实时动态变化(royr.etal.,naturemethods,2008,5,507-516)。单分子fret已经被广泛应用于研究生物大分子的自身构型变化和分子间相互作用等动态过程。

然而，基于全内反射荧光显微镜的单分子fret技术仍然存在着缺陷和不足(juettem.f.etal.,currentopinioninchemicalbiology,2014,20,103-111)。全内反射荧光显微镜中最高可使用的荧光标记样品浓度——既荧光浓度屏障——在50nm左右，这远远低于许多生化反应的结合常数，也远低于许多生物分子在生理条件下的浓度(μm量级)。因此，很多利用单分子fret开展的研究是在远低于生理浓度的条件下进行的，其结论是否能真实反应生理条件还有待验证。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是突破全内反射荧光显微技术中的荧光浓度屏障(50nm)，实现在接近生理条件的μm以上浓度下进行单分子荧光共振能量转移的测量。

为了实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：

一种基于光激活的单分子荧光共振能量转移的方法，其特征在于该方法按如下步骤进行：

1)将光激活的荧光染料和非光激活荧光染料分别溶解在有机溶剂中，染料终浓度为1-50mm；

2)生物样品的摩尔浓度为10-200μm，生物样品浓度和荧光染料浓度的比例为1：1-10；生物样品和荧光染料在4-37℃下反应0.5-24小时,所述的生物样品为核酸或者蛋白；

3)将步骤2)反应后的溶液加入脱盐柱中，用缓冲液洗脱得到标记的荧光染料的样品，从而去除多余的没有标记的生物样品的染料；

4)用光激活荧光染料标记生物样品为供体，用非光激活荧光染料标记生物样品作为受体；将非光激活染料标记的生物样品固定在玻片上，之后加入浓度为纳摩尔到微摩尔量级的光激活染料标记的生物样品，在全内反射荧光显微镜下进行成像；打开激活光源(6)，用波长为200-450纳米的激光激活供体，使玻片表面附近的荧光染料都转变为可发射荧光的激活态；

5)关闭激活光源，打开另一波长为450-1200纳米的激发光源(7)，与表面的生物样品结合的激活态荧光标记分子会被激发产生荧光；

6)当光激活染料标记的供体与非光激活的荧光染料标记的受体的距离在1-10nm之间时，通过激活和激发光源的交替照明，不断的激活在实验观测过程中结合到表面的荧光染料，供体的能量就会转移给受体，受体就会发出相应的荧光，即荧光共振能量转移。

上述技术方案中，所述的生物样品为核酸或者蛋白；步骤4)中所述纳摩尔到微摩尔量级的光激活荧光染料标记的样品浓度在1nm～100μm之间。

优选地，步骤1)中所述的有机溶剂采用二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、甲醇或乙醇。

优选地，所述的光激活染料包括cage500、cage552、cage590或cage635；非光激活染料包括cyanine2、cyanine3、cyanine5、cyanine7、alexa488、alexa647或atto488。

本发明具有以下优点及突出性的技术效果：本发明利用光激活的荧光染料代替非光激活的荧光染料对生物样品进行标记，从而突破全内反射荧光显微技术中的荧光浓度屏障，将标记生物样品的最高浓度限值提高2-3个数量级，突破了荧光共振能量转移技术中的荧光样品浓度的障碍(50nm左右)，实现了在生理条件的μm以上浓度进行单分子荧光共振能量转移的测量，从而反应更为真实的生理过程，进而揭示更多未知的生物学过程。

附图说明

图1为本发明提供的一种基于光激活的单分子荧光共振能量转移方法的原理示意图。

图2为本发明方法实验过程中所使用的系统结构示意图。

图中：1-显微镜成像玻片；2-生物样品；3-非光激活染料标记的生物样品(受体)；4-未被激活的光激活染料标记的生物样品；5-已被激活的光激活染料标记的生物分子(供体)；6-激活光源；7-激发光源；8-反射镜；9-二向色镜；10-凸透镜。

具体实施方式：

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明。

图1为本发明提供的一种基于光激活的单分子荧光共振能量转移方法的原理示意图，该方法包括如下步骤：

1)将光激活的荧光染料和非光激活荧光染料分别溶解在有机溶剂中，染料终浓度为1-50mm；有机溶剂一般可采用二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、甲醇或乙醇等。光激活染料可采用cage500，cage552，cage590，cage635，cmnb-cagedcarboxyfluorescein，se等；非光激活染料可采用cyanine2，cyanine3，cyanine5，cyanine7，alexa488，alexa647，atto488等；

2)生物样品的摩尔浓度为10-200μm，生物样品浓度和荧光染料浓度的比例为1：1-10；生物样品和荧光染料在4-37℃下反应0.5-24小时,所述的生物样品为核酸或者蛋白；

3)将步骤2)反应后的溶液加入脱盐柱中，用缓冲液洗脱得到标记的荧光染料的样品，从而去除多余的没有标记的生物样品的染料；

4)用光激活荧光染料标记生物样品作为供体，用非光激活荧光染料标记生物样品作为受体；将非光激活染料标记的生物样品固定在显微镜成像玻片1上，之后加入浓度为纳摩尔到微摩尔量级的光激活染料标记的生物样品2，一般在1nm～100μm之间，在全内反射荧光显微镜下进行成像；打开波长为200-450纳米的激活光源6，使玻片表面附近的荧光染料都转变为可发射荧光的激活态；

5)关闭激活光源，打开另一波长为450-1200纳米的激发光源7，与表面的生物样品结合的激活态荧光染料标记的生物样品会被激发产生荧光；

6)当光激活染料标记的供体与非光激活的荧光染料标记的受体的距离在1-10nm之间时，通过激活和激发光源的交替照明，不断的激活在实验观测过程中结合到表面的荧光染料，供体的能量就会转移给受体，受体就会发出相应的荧光，即荧光共振能量转移。

图2为本发明方法实验过程中所使用的系统结构示意图，图1中的技术方案是通过图2中的硬件来实施并采集数据。激活光源6和激发光源7通过反射镜8和二向色镜9合并在同一光路上，通过两个共焦点的凸透镜10扩束后进入商业化的荧光显微镜(nikonti-e或类似产品)，在全内反射角进行照明。显微镜上的成像玻片固定有标记的生物分子。通过电脑控制，实现激活光源和激发光源的可控的交替激发，实现图1中的技术路线，获得基于光激活的单分子荧光共振能量转移信号。相应的单分子荧光信号被显微镜收集，被分光镜基于荧光的波长投射到检测器的不同区域，单分子荧光信号最终被电脑采集并重构出基于光激活的单分子荧光共振能量转移信号随时间的变化。

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1，基于cage552光激活染料的单分子荧光共振能量转移。

以cage552光激活染料标记的核酸分子为模型，实现样品浓度在微摩尔量级下的单分子荧光共振能量转移的观测。

具体实验如下：

从abberior公司购买1mgn-羟基琥珀酰亚胺酯(nhsester)活化的cage552光激活染料，溶于181μl的二甲基亚砜中，使得染料的终浓度为10mm。cage552染料可以被405nm的激光激活，532nm的激光激发。从lumiprobe公司购买1mgn-羟基琥珀酰亚胺酯(nhsester)活化的cyanine5非光激活染料，溶于162μl的二甲基亚砜中，使得染料的终浓度为10mm。生物样品为核酸(dna)，一条固相合成在中间某特定碱基上引入氨基(nh2)修饰的100μl50μm的dna单链分子(供体)与5微升cage552染料在23℃下反应5小时。另一条100μl50μm的dna单链分子(受体)与5μl10mmcyanine5染料在23℃反应2小时。反应后的溶液加入脱盐柱中，用缓冲液洗脱得到标记荧光染料的样品。将生物素化的dna单链分子和受体以10μm的浓度1:1混合，在55度下反应15分钟，并缓慢降温到室温。结合图1，生物素化的dna单链分子和受体3固定到显微镜成像玻片1上，后加入10μm的供体4,交替激发405nm和532nm的激光，可以看到cyanine5发出的荧光信号，即发生荧光共振能量转移。

实施例2，基于cagefam光激活染料的单分子荧光共振能量转移。

以cagefam光激活染料标记的核酸分子为模型，实现样品浓度在微摩尔量级下的单分子荧光共振能量转移的观测。

具体实验如下：

从invitroge公司购买1mgn-羟基琥珀酰亚胺酯(nhsester)活化的cagefam(cmnb-cagedcarboxyfluorescein，se)光激活染料，溶于103μl的二甲基亚砜中，使得染料的终浓度为10mm。cagefam染料可以被405nm的激光激活，488nm的激光激发。从lumiprobe公司购买1mgn-羟基琥珀酰亚胺酯(nhsester)活化的cyanine5非光激活染料，溶于162μl的二甲基亚砜中，使得染料的终浓度为10mm。生物样品为核酸(dna)，一条固相合成在中间某特定碱基上引入氨基(nh2)修饰的100μl50μm的dna单链分子(供体)与5μl10mmcagefam染料在23℃下反应5小时。另一条100μl50μm的dna单链分子(受体)与5μl10mmcyanine5染料在23℃下反应2小时。反应后的溶液加入脱盐柱中，用缓冲液洗脱得到标记荧光染料的样品。将生物素化的dna单链分子和受体以10μm的浓度1:1混合，在55℃下反应15分钟，并缓慢降温到室温。结合图1，生物素化的dna单链分子和受体固定到玻片上，后加入10μm的供体,交替激发405nm和488nm的激光，可以看到cyanine5发出的荧光信号，即发生荧光共振能量转移。