一种PHBA对映异构体杂质检测方法与流程

本发明涉及药物分析检测技术领域，尤其涉及一种phba对映异构体杂质检测方法。

背景技术：

phba，即(s)-α-羟基-γ-n-邻苯二甲酰亚氨基丁酸，是作为合成药物阿米卡星的重要中间体。阿米卡星俗称丁胺卡那霉素、阿米卡霉素，是第三代半合成氨基糖苷类抗生素，对大肠埃希菌、克雷伯菌属、肠杆菌属、变形杆菌属、志贺菌属、沙门菌属、铜绿假单胞菌及其他假单胞菌、不动杆菌属、产碱杆菌属等具有较强的药理作用；对脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、流感嗜血杆菌、耶尔森菌属、胎儿弯曲菌、结核杆菌及某些非结核分枝杆菌属等据有较强的药理作用。阿米卡星又具有低耳毒性、低肾毒性等优势，在氨基糖苷类抗生素中所占的份额已由1999年5％上升到现在的12％，无论是非典型肺炎的治疗还是禽流感的预防，阿米卡星都起到了重要作用，是我国临床广泛应用的抗生素之一。

phba的结构式如下：

由于phba具有一个手性碳原子，而该手性碳原子的取代基在空间中的

不同取向使其具有s构型和r构型两种化合物，互为对映异构体；其对映

异构体杂即(r)-α-羟基-γ-n-邻苯二甲酰亚氨基丁酸，其结构式如下：

其中，s构型才能用于合成阿米卡星，r构型则为其杂质。由于对映异构体具有相同的物理性质(如熔点、沸点、溶解度、密度等)和化学性质，仅在特殊手性环境下才能体现出差异。因此，一般普通的反相液相色谱法无法分离，需要一种新的方法对这个r构型的杂质进行质量监控。

从目前公开的技术文献来看，phba多数采用旋光仪来测定其比旋度，由此来判定其是否具有较高光学纯度。但比旋度法容易受配样溶剂、配样温度、配样浓度以及仪器稳定等多方面影响；而且需要高光学纯度单一对映体作为对照物，所以现有的这种比旋度法存在准确性、稳定性较差，对仪器、操作人员和对照品的要求高等缺点。

另外，《中国药典》规定，杂质与主要成分之间，以及杂质与杂质之间分离度(r)应大于1.5。分离度(r)为相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值，也叫分辨率，表示相邻两峰的分离程度。分离度计算公式：r＝2(tr2-tr1)/(w1+w2)。r值越大，表明相邻两组分分离越好。一般说当r＜1时，两峰有部分重叠；当r＝1.0时，分离度可达98％；当r＝1.5时，分离度可达99.7％。通常用r＝1.5作为相邻两组分已完全分离的标志。当r＝1时，称为4σ分离，两峰基本分离，裸露峰面积为95.4％，内侧峰基重叠约2％。r＝1.5时，称为6σ分离，裸露峰面积为99.7％。r≥1.5称为完全分离。

技术实现要素：

本发明的目的就在于提供一种phba对映异构体杂质检测方法，以解决上述问题。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是这样的：一种phba对映异构体杂质检测方法，采用正相高效液相色谱法，其中色谱条件如下：

色谱柱：ad-h或as-h

流动相组成：正己烷：异丙醇＝85:15-80:20(v/v)

流动相流速：0.8-1.2ml/min

检测波长：220-280nm

柱温：20-40℃

检测器：紫外线检测器或二级管阵列检测器。

作为优选的技术方案：所述流动相中还含有三氟乙酸。

作为优选的技术方案：所述流动相流速为1.0ml/min。

作为优选的技术方案：所述检测波长为280nm。

作为优选的技术方案：所述柱温为30℃。

作为优选的技术方案：溶解供试品的溶剂为乙醇。

作为优选的技术方案：供试品溶液浓度为0.2-1mg/ml，进一步优选为0.2mg/ml。

作为优选的技术方案：单针进样量为5-40μl，进一步优选为20μl。

通过实验证明，ad-h(5μmx4.6mmx25cm)手性柱能实现phba与其对映异构体很好的分离效果。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明采用手性色谱法的对映体过剩值(即ee值)测定，实现了phba与其对映异构体的分离，具有较高的灵敏度和专属性，具有快速、灵敏、操作简便和准确、不需要高纯度单一对映体作为对照物等优点，分离度符合药典规定，即分离度大于1.50，可用于phba的质量控制，本方法特别适合就高ee值对映体产物纯度的准确测定。

附图说明

图1是实施例2中液相色谱图；

图2是实施例3中液相色谱图；

图3是实施例4中液相色谱图；

图4是实施例5中液相色谱图；

图5是实施例6中液相色谱图；

图6是实施例7中液相色谱图；

图7是实施例8中液相色谱图；

图8是实施例9中液相色谱图；

图9是实施例10中液相色谱图；

图10是实施例11中液相色谱图；

图11是实施例13中s-phba的线性回归图；

图12是实施例13中r-phba的线性回归图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明作进一步说明。

实施例1

溶剂的选择及溶液浓度的选择

正相色谱一般采用正己烷或乙醇溶解样品，选择取决于样品的溶解性。phba在乙醇中溶解性较好，而在正己烷中溶解性较差，为了避免样品溶出的情况，使用乙醇溶解样品。

实施例2

仪器与检测条件

美国agilent1200高效液相色谱仪，手动进样器；daicelad-h柱(4.6×250mm,5μm)；流动相：正己烷：异丙醇＝80:20(v/v)；进样量为20μl；检测波长为220nm；流速为1.0ml/min；柱温为30℃。

实验步骤

取phba消旋体适量，用乙醇溶解并稀释制成每1ml含有phba消旋体1mg的溶液，摇匀，作为供试品溶液按上述条件进样测定，记录色谱图，结果见图1。

图1表明消旋体有分离，但分离度和峰形均达不到要求。

实施例3

仪器与检测条件

美国agilent1200高效液相色谱仪，手动进样器；daicelad-h柱(4.6×250mm,5μm)；流动相：正己烷：异丙醇＝85:15(v/v)；进样量为20μl；检测波长为220nm；流速为1.0ml/min；柱温为30℃。

实验步骤

取phba消旋体适量，用乙醇溶解并稀释制成每1ml含有phba消旋体1mg的溶液，摇匀，作为供试品溶液按上述条件进样测定，记录色谱图，结果见图2。

图2表明消旋体有分离，但分离度和峰形均达不到要求。

实施例4

仪器与检测条件

美国agilent1200高效液相色谱仪，手动进样器；daicelas-h柱(4.6×250mm,5μm)；流动相：正己烷：异丙醇＝80:20(v/v)；进样量为20μl；检测波长为220nm；流速为1.0ml/min；柱温为30℃。

实验步骤

取phba消旋体适量，用乙醇溶解并稀释制成每1ml含有phba消旋体1mg的溶液，摇匀，作为供试品溶液按上述条件进样测定，记录色谱图，结果见图3。

图3表明消旋体有分离，但分离度和峰形均达不到要求。

实施例5

仪器与检测条件

美国agilent1200高效液相色谱仪，手动进样器；daicelod-h柱(4.6×250mm,5μm)；流动相：正己烷：异丙醇＝80:20(v/v)；进样量为20μl；检测波长为220nm；流速为1.0ml/min；柱温为30℃。

实验步骤

取phba消旋体适量，用乙醇溶解并稀释制成每1ml含有phba消旋体1mg的溶液，摇匀，作为供试品溶液按上述条件进样测定，记录色谱图，结果见图4。

图4表明消旋体未能达到分离。

实施例6

仪器与检测条件

美国agilent1200高效液相色谱仪，手动进样器；daicelad-h柱(4.6×250mm,5μm)；流动相：正己烷：异丙醇：三氟醋酸＝80:20:0.1(v/v)；进样量为20μl；检测波长为220nm；流速为1.0ml/min；柱温为30℃。

实验步骤

取phba消旋体适量，用乙醇溶解并稀释制成每1ml含有phba消旋体1mg的溶液，摇匀，作为供试品溶液按上述条件进样测定，记录色谱图，结果见图5。

图5表明消旋体有分离，但分离度小于1.5。

实施例7

仪器与检测条件

美国agilent1200高效液相色谱仪，手动进样器；daicelad-h柱(4.6×250mm,5μm)；流动相：正己烷：异丙醇：三氟醋酸＝80:20:0.1(v/v)；进样量为20μl；检测波长为280nm；流速为1.0ml/min；柱温为40℃。

实验步骤

取phba消旋体适量，用乙醇溶解并稀释制成每1ml含有phba消旋体1mg的溶液，摇匀，作为供试品溶液按上述条件进样测定，记录色谱图，结果见图6。

图6表明消旋体有分离，但分离度小于1.5，并且吸收较弱。

实施例8

仪器与检测条件

美国agilent1200高效液相色谱仪，手动进样器；daicelad-h柱(4.6×250mm,5μm)；流动相：正己烷：异丙醇：三氟醋酸＝85:15:0.1(v/v)；进样量为20μl；检测波长为220nm；流速为0.8ml/min；柱温为30℃。

实验步骤

取phba消旋体适量，用乙醇溶解并稀释制成每1ml含有phba消旋体1mg的溶液，摇匀，作为供试品溶液按上述条件进样测定，记录色谱图，结果见图7。

图7表明消旋体有分离，但分离度小于1.5。

实施例9

仪器与检测条件

美国agilent1200高效液相色谱仪，手动进样器；daicelad-h柱(4.6×250mm,5μm)；流动相：正己烷：异丙醇：三氟醋酸＝85:15:0.1(v/v)；进样量为20μl；检测波长为220nm；流速为1.2ml/min；柱温为30℃。

实验步骤

取phba消旋体适量，用乙醇溶解并稀释制成每1ml含有phba消旋体1mg的溶液，摇匀，作为供试品溶液按上述条件进样测定，记录色谱图，结果见图8。

图8表明消旋体有分离，但分离度小于1.5。

实施例10

仪器与检测条件

美国agilent1200高效液相色谱仪，手动进样器；daicelad-h柱(4.6×250mm,5μm)；流动相：正己烷：异丙醇：三氟醋酸＝85:15:0.1(v/v)；进样量为20μl；检测波长为220nm；流速为1.2ml/min；柱温为30℃。

实验步骤

取phba消旋体适量，用乙醇溶解并稀释制成每1ml含有phba消旋体0.5mg的溶液，摇匀，作为供试品溶液按上述条件进样测定，记录色谱图，结果见图9。

图9表明消旋体有分离，但分离度小于1.5。

实施例11

仪器与检测条件

美国agilent1200高效液相色谱仪，手动进样器；daicelad-h柱(4.6×250mm,5μm)；流动相：正己烷：异丙醇：三氟醋酸＝85:15:0.1(v/v)；进样量为20μl；检测波长为220nm；流速为1.0ml/min；柱温为30℃。

实验步骤

取phba消旋体适量，用乙醇溶解并稀释制成每1ml含有phba消旋体0.2mg的溶液，摇匀，作为供试品溶液按上述条件进样测定，记录色谱图，结果见图10。

图10表明消旋体的分离度符合药典规定。

实施例12

系统适用性试验

根据实施例11条件进行系统适用性试验：

称取phba消旋体20mg于100ml容量瓶中，用乙醇稀释至刻度，摇匀作为系统适用性溶液。

试验方法：将系统适用性溶液连续进6针，记录色谱图。结果见表1。

表1系统适用性试验结果

实施例13

线性与范围

根据实施例11条件进行线性与范围试验：

称取s-phba40mg、r-phba40mg于100ml容量瓶中，用乙醇稀释至刻度，摇匀，配制成每1ml含有s-phba0.4mg、r-phba0.4mg的线性贮备液。精密量取1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml线性贮备液，置于10ml容量瓶中，用乙醇稀释至刻度，摇匀，作为线性供试液。

试验方法：将6个供试液分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图。分别以s-phba和r-phba浓度作为横坐标(mg/ml),峰面积作为纵坐标进行线性回归，得线性回归方程，s-phba：y＝55424x+29.439，结果见图11。由图11可知，趋势线的相关系数r²＝0.9992，可见在该色谱条件下，s-phba在0.04-0.24mg/ml的浓度范围线性关系良好。r-phba：y＝55386x+43.445，结果见图12。由图12可知，趋势线的相关系数r²＝0.9994，可见在该色谱条件下，r-phba在0.04-0.2mg/ml的浓度范围线性关系良好。

实施例14

准确度

根据实施例11条件进行准确度(回收率)试验：

回收率计算：

上式中：

ee1为供试品ee值的测定量，％；

ee2为供试品ee值的理论量，％；

按表2方案取样品到100ml容量瓶中，用乙醇稀释到刻度，作为准确度供试液。

试验方法：将5个供试液分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图。结果见表2。

表2准确度试验结果

试验结果显示，本发明检测方法，平均回收率均大于99％，说明本发明的方法准确度好。

综上所述，本发明通过选定特定高效液相色谱检测条件，达到了精确检测phba光学纯度的效果。并且，本法重复性好，准确度高，可用于phba生产过程及最终产品的光学纯度控制，进一步保证了下游药物安全性。