唾液外泌体中胰岛素在制备用于内分泌疾病诊断的试剂盒或系统中的用途的制作方法

本发明涉及唾液外泌体中胰岛素在制备用于内分泌疾病诊断的试剂盒或系统中的用途。

背景技术：

内分泌代谢疾病、肿瘤、心血管疾病是三大最常见的慢性病。内分泌疾病他属于内分泌异常性疾病的总称，如果没有特指某种疾病，一般是指糖尿病以及甲状腺疾病。糖尿病是由遗传和环境因素相互作用而引起的常见病，临床以高血糖为主要标志，常见症状有多饮、多尿、多食以及消瘦等。据调查，在中国成年人中，估计内分泌代谢疾病的患病率不低于5％。糖尿病标化患病率为5.89％,葡萄糖耐量低减(igt)标化患病率为5.90％；60岁以上糖尿病和igt患病率分别为19.24％和17.92％。糖尿病(dm)是一种多病因代谢紊乱的慢性疾病，临床表现多种多样。葡萄糖代谢异常是2型糖尿病发病的中心环节，以血糖升高为主要临床特征，常发生于成年人，主要是由于胰岛素抵抗和胰岛素分泌缺陷引起。一般认为与遗传、环境、化学毒素以及微生物等因素有着密切关系。随着人们生活水平的提高，生活方式的改变和年龄的老化，糖尿病患病率正逐渐增长，其中2型糖尿病占糖尿病的大多数(90％～95％)，并且2型糖尿病中90％为中老年患者。在糖尿病诊断中，血糖、胰岛素、和糖化血红蛋白检测已成为常规项目。1型和2型的糖尿病患者初期时胰岛素水平能判断β细胞的功能，以评估胰岛β细胞功能受损情况，为糖尿病预防和合理及时使用胰岛素治疗提供科学依据，让患者能得到及时的治疗和减少并发症的发生。

胰岛素是胰腺β细胞合成和分泌的一种蛋白质，在粗面内质网的核糖、核蛋白体上新合成的胰岛素是102个氨基酸组成的前体，称为前胰岛素原。前胰岛素原穿过内质网膜进入腔内，随即切除前面由16个氨基酸组成的信号肽，生成胰岛素原，并输送到高尔基体贮存，当胰岛素分泌时，在蛋白水解酶的作用下，生成胰岛素和c肽，二者一起分泌入血。

蛋白结合测定是目前最通用的一种激素测定方法，也是命名最混乱的一种测定方法。通常用的免疫测定法，放射免疫测定法，受体结合测定法和血浆蛋白结合测定法，都属于这一类测定方法。

这些检测方法都采用病人血清标本，并且需要多次反复检测，才能确定患者激素水平，判断内分泌功能状态。液体活检技术可以解决这一问题。其中一个技术是外泌体的检测。外泌体是由细胞内多泡体与细胞膜融合后,释放到细胞外基质中的一种直径约30～120nm的膜性囊泡。t细胞、b细胞、血小板、树突细胞、肥大细胞等血细胞及上皮细胞、肿瘤细胞等其他非血源性细胞都会分泌外泌体，被分泌出的外泌体会进入血液、唾液、尿液、及乳汁等体液中，通过循环系统到达其他细胞与组织，产生远程调控作用。这种普遍存在于机体内的被膜结构参与细胞间的物质交换和信息交流，影响细胞的生理状态,并与多种疾病的发生与进程密切相关。

目前内分泌疾病需多次检查激素水平，如糖尿病，检查胰岛功能时，需空腹、进食后0.5小时、1小时、2小时、3小时分别抽血，检测葡萄糖和胰岛素、c肽等激素水平，这些检查不是只检查一次就可以了，需要多次规律进行。这样长时间的禁食加抽血检测，病人耐受性差，负担重。这些检查不但耗时长，还是有创检查，导致病人的依从性低，难以进行规律的预后的监测，病情不能得到稳定控制。

内分泌疾病属于慢性疾病，需要多次检查激素水平，需要规律的监测来及时调整药物剂量及疗程，现有的抽血检查需要通过穿刺手段，且需血量大，不方便反复多次进行。这种有创检查病人接受程度低，依从性差，无法动态观测病人治疗效果，难以稳定控制疾病的发展。

技术实现要素：

为解决现有技术的不足，本发明开发了一种用于内分泌疾病诊断的试剂盒，本发明还提供了一种用于内分泌疾病诊断的液体诊断系统，本发明利用病人体液提取外泌体，并检测其中的胰岛素的表达量，具有稳定性好，重复率高，获取简单，解决了内分泌疾病缺乏一种可连续取样，病人易耐受的胰岛素的液体诊断方法的难题。

为实现上述目的，所采取的技术方案：一种用于内分泌疾病诊断的试剂盒，包括检测唾液外泌体中胰岛素的试剂，以及提取唾液外泌体的试剂。

优选地，所述检测唾液外泌体中胰岛素的试剂包括鲁米诺、胰岛素抗体、辣根过氧化物酶和双氧水。

优选地，所述提取唾液外泌体的试剂包括外泌体沉淀溶液和外泌体悬浮液。

优选地，所述外泌体沉淀溶液包括聚乙二醇6000，所述外泌体悬浮液包括磷酸盐缓冲溶液。

本发明提供了一种用于内分泌疾病诊断的系统，包括上述所述的内分泌疾病诊断试剂盒，以及检测唾液外泌体中胰岛素的仪器。

本发明提供了唾液外泌体中胰岛素在制备内分泌疾病诊断试剂、试剂盒或系统中的用途。

本发明提供了检测唾液外泌体中胰岛素的试剂在制备内分泌疾病诊断试剂盒或系统中的用途。

实施本发明的用于内分泌疾病诊断的试剂盒和系统，通过从体液中提取外泌体，检测其中胰岛素，可以简单、方便且准确地诊断内分泌疾病。

有益效果：

1、目前液体活检正在不断发展中，由此开发的检测唾液外泌体中胰岛素的试剂盒，是一种具有非侵袭性、高敏感性高特异性、适用于普查筛查大样本调查的液体诊断监控试剂盒。

2、通过检测唾液外泌体胰岛素的表达，提供一种能够利用体液等生物样本进行胰岛素的检测，稳定性高、定量精确的试剂盒和系统，并由于其微创，易于检测，便于反复多次取样，有助于实时反映动态检测胰岛素相关内分泌疾病患者的疾病状态，有助于临床医生迅速掌握患者病情，从而及时制定更具有个体化的治疗措施。

附图说明

图1为糖尿病病人唾液中提取的外泌体电镜图；

图2为糖尿病病人唾液中提取的外泌体蛋白质免疫印迹图；

图3为糖尿病病人唾液中提取的外泌体纳米粒子跟踪分析图；

图4为糖尿病病人与正常人(对照组)在摄取了75g葡萄糖前(0h)及之后指定时间点，其唾液外泌体中胰岛素测定情况；

图5为随机选取的12位糖尿病病人唾液外泌体中与血清中胰岛素检测相关性的情况。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。

一、唾液的收集、保存以及运输

1.收集：于早晨8-10点，采用非刺激性滴取法于安静舒适的环境下，对满足下列条件受试者进行全唾液收集：1.空腹，未进行剧烈运动；2.至少刷牙一小时以上；3..近期未进行口腔护理。嘱咐受试者用清水漱口2-3次，每次约30-40ml左右清水，以清除口腔内食物等残渣，吐尽残留液体，头部微下垂，静坐5分钟后待唾液自然流出。收集其非刺激性全唾液于无菌平板培养皿中，以唾液铺满培养皿为宜，约500-700ul，而后迅速分装至无菌1.5mlep管，立即置-80℃保存待用。

2.保存：一般–80℃冰箱可以长期保存唾液，但由于唾液中含有细菌、少量残渣及各种酶，建议3000g/分钟离心15min后，去除沉渣，分离上清于新的ep管中，后置于–80℃冰箱，以减少后续细菌及各种酶对实验的影响。若没有-80℃冰箱，可用封口膜封口，暂存于-20℃，后尽快转移至有条件实验室或尽快进行后续处理。

3.运输：如需短途运输，可置于冰盒内进行运输，如需长途运输，可用干冰运输后再进行处理。短途运输，尽量保证处理与收集的间隔时间不超过1h；长途运输，建议保证干冰的分量足够以维持低温。运输过程保证低温，以免后续实验受唾液中各种微生物或酶的影响。

二、唾液外泌体提取、保存及运输

1.唾液外泌体的提取：

取等体积实验步骤1所得唾液如500ul(所需唾液量至少可为250ul).(未进行离心处理的唾液)，2500-5000g/分钟离心15min。用移液器将离心所得上清移至新的1.5ml的ep管中，约450-470ul澄清上清，加入等量的外泌体沉淀溶液混匀,4℃静置孵育过夜，10000g4℃离心1h后弃上清，收集沉淀，将外泌体白色沉淀物用适量1x外泌体悬浮液重悬得到外泌体重悬液。

图1：图中示出了糖尿病病人唾液中提取的外泌体电镜图，镜下观察到带膜囊泡结构，且大小在100nm左右，说明唾液提取物中确实含有外泌体。

图2：图中示出了糖尿病病人唾液中提取的外泌体蛋白质免疫印迹图，图中显示为外泌体特异性标志物条带，说明唾液提取物中确实含有外泌体。

图3：图中示出了糖尿病病人唾液中提取的外泌体纳米粒子跟踪分析图，图中显示唾液提取物中颗粒大小主要集中在79nm和100nm，符合外泌体大小，说明提取物中含有绝大多数的外泌体。

2.唾液外泌体的保存及运输：

一般外泌体置于–80℃冰箱可以长期保存1-3年，其中含有的rna、dna、蛋白等都能较为稳定的保存。外泌体一般建议采用干冰及干冰替代物进行长途运输。

三、唾液外泌体中胰岛素测定

在上述最后得到的外泌体重悬液中，取20μl加入已包被胰岛素抗体的聚苯乙烯试管中，再加入100μl鲁米诺，37℃反应2h。pbs缓冲液冲洗3次。每次3min，加入0.1mol/lnaoh100μl、30μmol/lhrp(辣根过氧化物酶)100μl，室温静置10min后，加入3％h202100μl立即测定发光强度，从发光仪上读取数值。

上述所述试剂成分如下表示

图4：图中示出了糖尿病病人与正常人(对照组)在摄取了75g葡萄糖前(0h)及之后指定时间点，其唾液外泌体中胰岛素测定情况，结果显示糖尿病人的胰岛素水平比正常人基础水平高，糖尿病人比正常人更难达到胰岛素分泌峰值并且更快降到基础水平，说明唾液中外泌体胰岛素能够反映糖尿病人及正常人的胰岛素水平。

图5：图中示出了随机选取的12位糖尿病病人唾液外泌体中与血清中胰岛素检测相关性的情况，相关系数为0.74(p＝0.0059)，说明糖尿病人唾液外泌体与血清的胰岛素水平有显著相关性。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。