唾液外泌体中生长激素在制备用于内分泌疾病诊断的试剂盒或系统中的用途的制作方法

本发明涉及唾液外泌体中生长激素在制备用于内分泌疾病诊断的试剂盒或系统中的用途。

背景技术：

内分泌代谢疾病、肿瘤、心血管疾病是三大最常见的慢性病。内分泌代谢疾病是内分泌异常性疾病的总称，包括激素来源异常、激素受体异常和由于激素或物质代谢失常引起的生理紊乱所发生的症候群。常见的疾病包括糖尿病、甲状腺疾病、胰岛素瘤以及泌乳素瘤、垂体功能减退症等。这些疾病的诊断通常要通过多次检测激素水平，其中不乏各种肽类激素(peptidehormones)，主要包括：1、人体生长激素(gh)2、胰岛素3、红细胞生成素(epo)4、促性腺素，这些激素都需要多次检测确定内分泌状态。如垂体功能减退症，检测垂体功能时，需要检测gh，prl,acth,tsh,lh,fsh等激素水平，而且都是多次进行的，就检测gh水平而言，就有4个试验需要穿刺抽血检测，第一个试验需要在-30,0，30,60,120分钟抽血测血糖和gh，第二个试验需要在0,15,30,45,60,120分钟抽血检测gh，第三个试验需要在0,30,60,120分钟抽血测gh，最后一个试验需要在0,30,60,120分钟抽血测gh。如此多的试验都是不能交叉进行的，必须分开分批进行，所需时间长，穿刺抽血次数多，抽血量大，病人负担重。这些检查均为有创检查，导致病人的依从性低，难以进行规律的预后的监测，病情不能得到稳定控制。

目前，蛋白结合测定是最通用的一种激素测定方法，也是命名最混乱的一种测定方法。通常用的免疫测定法，放射免疫测定法，受体结合测定法和血浆蛋白结合测定法，都属于这一类测定方法。

这些检测方法都采用病人血清标本，并且需要多次反复检测，才能确定患者激素水平，判断内分泌功能状态。患者对多次抽血产生的抵触心理与激素水平检测所需要的多次检测要求就产生了矛盾，而液体活检技术可以解决这一问题。液体活检中，其中一个技术是外泌体的检测。外泌体是由细胞内多泡体与细胞膜融合后,释放到细胞外基质中的一种直径约30～120nm的膜性囊泡。t细胞、b细胞、血小板、树突细胞、肥大细胞等血细胞及上皮细胞、肿瘤细胞等其他非血源性细胞都会分泌外泌体，被分泌出的外泌体会进入血液、唾液、尿液、及乳汁等体液中。外泌体的最重要的生物学功能是它们可能用作临床诊断中的生物标志物。和常规标本如血清或尿中鉴定的肽类激素相比，外泌体因为有它们优异的稳定性，故可以提供最高的灵敏度和特异性。

目前内分泌疾病需多次检查激素水平，如垂体功能减退症，检测垂体功能时，需要检gh，prl,acth,tsh,lh,fsh等激素水平，而且都是多次进行的，就检测gh水平而言，就有4个试验需要穿刺抽血检测，第一个试验需要在-30,0，30,60,120分钟抽血测血糖和gh，第二个试验需要在0,15,30,45,60,120分钟抽血检测gh，第三个试验需要在0,30,60,120分钟抽血测gh，最后一个试验需要在0,30,60,120分钟抽血测gh。如此多的试验都是不能交叉进行的，必须分开分批进行，所需时间长，穿刺抽血次数多，抽血量大，病人负担重。这些检查均为有创检查，导致病人的依从性低，难以进行规律的预后的监测，病情不能得到稳定控制。

内分泌疾病属于慢性疾病，需要多次检查激素水平，需要规律的监测来及时调整药物剂量及疗程，现有的抽血检查需要通过穿刺手段，且需血量大，不方便反复多次进行。这种有创检查病人接受程度低，依从性差，无法动态观测病人治疗效果，难以稳定控制疾病的发展。

技术实现要素：

为解决现有技术的不足，本发明开发了一种用于内分泌疾病诊断的试剂盒，本发明还提供了一种用于内分泌疾病诊断的液体诊断系统，利用病人体液提取外泌体，并检测其中的生长激素的表达量，具有稳定性好，重复率高，获取简单，解决了内分泌疾病缺乏一种可连续取样，病人易耐受的生长激素的液体诊断方法的难题。

为实现上述目的，所采取的技术方案：一种用于内分泌疾病诊断的试剂盒，包括检测唾液外泌体中生长激素的试剂，以及提取唾液外泌体的试剂。

优选地，所述提取唾液外泌体的试剂包括外泌体沉淀溶液和外泌体悬浮液。

优选地，所述外泌体沉淀溶液包括聚乙二醇6000，所述外泌体悬浮液包括磷酸盐缓冲溶液。

本发明提供了一种用于内分泌疾病诊断的系统，包括上述所述的内分泌疾病诊断试剂盒，以及检测唾液外泌体中生长激素的仪器。

本发明提供了唾液外泌体中生长激素在制备用于内分泌疾病诊断的试剂盒或系统中的用途。

本发明提供了检测唾液外泌体中生长激素的试剂在制备用于内分泌疾病诊断的试剂盒或系统中的用途。

实施本发明的用于内分泌疾病诊断的试剂盒和系统，通过从体液中提取外泌体，检测其中生长激素，可以简单、方便且准确地诊断内分泌疾病。

有益效果：

1、目前液体活检正在不断发展中，由此开发的检测唾液外泌体中生长激素的试剂盒，是一种具有非侵袭性、高敏感性高特异性、适用于普查筛查大样本调查的液体诊断监控试剂盒。

2、通过检测唾液外泌体生长激素的表达，提供一种能够利用体液等生物样本进行生长激素的检测，稳定性高、定量精确的试剂盒和系统，并由于其微创，易于检测，便于反复多次取样，有助于实时反映动态检测内分泌疾病患者的疾病状态，有助于临床医生迅速掌握患者病情，从而及时制定更具有个体化的治疗措施。

3、采用本发明所述试剂盒和系统可以避免多次穿刺抽血，减轻病人负担，指导临床用药，利于动态观察病人治疗情况。

附图说明

图1为矮小症儿童唾液中提取的外泌体电镜图，

图2为矮小症儿童唾液中提取的外泌体蛋白质免疫印迹图；

图3为矮小症儿童唾液中提取的外泌体纳米粒子跟踪分析图；

图4为矮小症儿童唾液外泌体中生长素测定情况；

图5为随机选择的12位矮小症儿童唾液外泌体中与血清中生长素检测相关性的情况。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。

一、唾液的收集、保存以及运输

1.收集：于早晨8-10点，采用非刺激性滴取法于安静舒适的环境下，对满足下列条件受试者进行全唾液收集：1.空腹，未进行剧烈运动；2.至少刷牙一小时以上；3..近期未进行口腔护理。嘱咐受试者用清水漱口2-3次，每次约30-40ml左右清水，以清除口腔内食物等残渣，吐尽残留液体，头部微下垂，静坐5分钟后待唾液自然流出。收集其非刺激性全唾液于无菌平板培养皿中，以唾液铺满培养皿为宜，约500-700ul，而后迅速分装至无菌1.5mlep管，立即置-80℃保存待用。

2.保存：一般–80℃冰箱可以长期保存唾液，但由于唾液中含有细菌、少量残渣及各种酶，建议3000g/分钟离心15min后，去除沉渣，分离上清于新的ep管中，后置于–80℃冰箱，以减少后续细菌及各种酶对实验的影响。若没有-80℃冰箱，可用封口膜封口，暂存于-20℃，后尽快转移至有条件实验室或尽快进行后续处理。

3.运输：如需短途运输，可置于冰盒内进行运输，如需长途运输，可用干冰运输后再进行处理。短途运输，尽量保证处理与收集的间隔时间不超过1h；长途运输，建议保证干冰的分量足够以维持低温。运输过程保证低温，以免后续实验受唾液中各种微生物或酶的影响。

二、唾液外泌体提取、保存及运输

1.唾液外泌体的提取：

取等体积上述所得唾液如500ul(所需唾液量至少可为250ul).(未进行离心处理的唾液)，2500-5000g/分钟离心15min。用移液器将离心所得上清移至新的1.5ml的ep管中，约450-470ul澄清上清，加入等量的外泌体沉淀溶液混匀,4℃静置孵育过夜，10000g4℃离心1h后弃上清，收集沉淀，将外泌体白色沉淀物用适量1x外泌体悬浮液重悬得到外泌体重悬液。

图1：图中示出了矮小症儿童唾液中提取的外泌体电镜图，镜下观察到明显的带膜囊泡结构以及颗粒大小在100nm左右，符合外泌体特征，说明在唾液中成功提取到外泌体。

图2：图中示出了矮小症儿童唾液中提取的外泌体蛋白质免疫印迹图，为外泌体特异性标志物条带，说明在唾液中确实成功提取物到外泌体。

图3：图中示出了矮小症儿童唾液中提取的外泌体纳米粒子跟踪分析图，图中显示唾液提取物中颗粒大小主要集中在79nm和100nm，符合外泌体特征，说明在唾液提取物中为绝大多数的外泌体。

2.唾液外泌体的保存及运输：

一般外泌体置于–80℃冰箱可以长期保存1-3年，其中含有的rna、dna、蛋白等都能较为稳定的保存。外泌体一般建议采用干冰及干冰替代物进行长途运输。

三、唾液外泌体中生长激素测定

取上述最后得到的外泌体重悬液，使用美国贝克曼－库尔特医学诊断公司生产的化学发光法检测仪器与配套试剂(r1a、r1b、r1c)检测生长激素。

上述所述试剂成分如下表示

图4：图中示出了矮小症儿童唾液外泌体中生长素测定情况。受试者在跑台上,速度为1.5m/s,以提高坡度的方式增加负荷量,每1～6min增加2％,以后每min增加1％,持续15～20min,受试者心率在170次/min以上。在受试前(0h)及受试后指定时间点，受试者的生长激素水平呈现上升后又下降到原基础水平的变化。说明唾液外泌体中生长激素能够反映矮小症儿童接受运动刺激后的生长激素水平变化。

图5：图中示出了随机选择的12位矮小症儿童唾液外泌体中与血清中生长素检测相关性的情况，相关系数为0.88(p<0.0001)，说明矮小症儿童唾液外泌体与血清的生长激素水平有显著相关性。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。