本发明属于生物医药领域，具体而言涉及一种尿微量白蛋白测定试剂盒及其制备方法。
背景技术：
微量白蛋白尿是指在尿中出现微量白蛋白。白蛋白是一种血液中的正常蛋白质，人体代谢正常情况下，尿中的白蛋白极少，具体到每升尿白蛋白不超过20mg(<20mg/l)，所以叫微量白蛋白。如果在体检后发现尿中的微量白蛋白在20mg/l-200mg/l范围内，就属于微量白蛋白尿，如果患者能够经过规范的修复肾单位，逆转纤维化治疗，尚可彻底修复肾小球，消除蛋白尿，尿常规尿蛋白的显示为阴性(-)或(+-)。而当尿中微量白蛋白超过200mg/l时，就应该引起注意了，此时证明肾病患者已有大量白蛋白漏出，可能出现低蛋白血症，肾病发展离不可逆期只有一步之遥，尿常规测试尿蛋白阳性(+)～(+++)，如果不及时进行医治，就会进入尿毒症期。
微量白蛋白尿也是整个血管系统改变的征象，并可认为是动脉病变的“窗口”，因为它是肾脏和心血管系统改变的早期指征。临床中，通常应用尿微量蛋白指标来监测肾病的发生。尿微量蛋白的检测是早期发现肾病最敏感、最可靠的诊断指标。通过尿微量白蛋白的数值，结合发病情况、症状以及病史陈述就可以较为准确的诊断病情。判断病情进入了纤维化那个阶段。
因此，尿微量白蛋白测定是一种灵敏、简便、快速的测定方法，易于在常规实验室中广泛应用，对早期肾损害的诊断远远优于常规定性或半定量试验。
目前国内常用的尿malb的检测方法有：免疫扩散法、免疫电泳法、免疫比浊法、放射免疫法、酶联免疫吸附法、胶体金法等，现在较多采用的方法是免疫比浊法。其中免疫扩散法、免疫电泳法、、酶联免疫吸附法主要靠手工操作，步骤繁琐且准确度和批间差大，检测时间长，不适合医院检验科使用，放射免疫法准度度较高，但价格昂贵，操作繁琐。胶体金法需采用单克隆抗体，价格昂贵，且检测范围较窄。所以现在多采用免疫比浊法测定。
目前，已有一些专利对尿微量白蛋白进行了定量的研究，如专利cn101504417b涉及使用胶体硒试纸的半定量检测尿微量白蛋白方法，本方法需要用到单克隆抗体，成本较高，且无法进行定量检测。专利cn104849473a采用胶乳增强免疫比浊法测量尿液中的尿微量白蛋白，此试剂盒采用双试剂，需要使用edc及nhs活化并将羊抗人malb抗体进行偶联，此方法的检测范围上限为200mg/l,长期稳定性为7个月，此试剂盒对高于200mg/l的样本无法进行检测，且稳定性较短。专利cn106053368a采用免疫比浊法对尿微量白蛋白进行测定，此方法采用多抗，且并未用胶乳增强方法，价格低廉，但此方法只对试剂盒的精密度进行考察，并未考察其线性范围和稳定性指标，也未进行临床样本测定。
技术实现要素：
本发明针对当前技术存在缺点和不足，本发明提供了一种尿微量白蛋白测定是一种灵敏、简便、快速的测定方法，易于在常规实验室中广泛应用，对早期肾损害的诊断远远优于常规定性或半定量试验。
本发明提供的尿微量白蛋白测定试剂盒包括试剂i和试剂ii；
其中，所述试剂i包括tween-20、tritonx-100、海藻糖、nacl、乙二胺四乙酸二钠和peg6000；
其中，所述试剂ii包括山羊抗人malb抗血清、吐温-20、tritonx-100、甘油。
优选的，所述tween-20、tritonx-100、海藻糖、nacl、乙二胺四乙酸二钠和peg6000的质量比为0.5-5：1-5：2-5：5-20：0.6-3:10-50，尤其是质量比为3：1：4：10：1.5:15。这几种物质的添加比例的选择,会产生较好的协同作用,可以在保证反应速度不降低前提下,增加试剂体系的稳定性和抗干扰能力.有效防止试剂在储存过程中产生沉淀现象.
优选的，所述吐温-20、tritonx-100和甘油的质量比为2-5：1-5：2-10，特别是2：2：8。
这几种非离子型表面活性剂添加比例的选择,会产生较好的协同保护作用,可以防止抗体在体系中的变性,增加抗体的稳定性,有效防止试剂在储存过程中产生沉淀现象.使体系处于长期稳定状态.
优选的，所述试剂ii中所述山羊抗人malb抗血清的终浓度为35±5mg/ml。在此浓度下,抗体能有效避免hook效应,同时可使线性范围达到400mg/l。
上述尿微量白蛋白测定试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
1)制备试剂i：称取下列原料，用纯化水定容至1l，然后用1mol/l的hcl溶液调节ph至7.8±0.2备用：
优选的原料配比为：
2)制备试剂ii：称取下列原料，用纯化水定容至1l，然后使用1mol/l的naoh溶液调节ph至7.4±0.2制得试剂ii缓冲液：
优选的原料配比为：
将试剂ii缓冲液与山羊抗人malb血清混合，使山羊抗人malb血清的终浓度为30-40mg/ml。
配制系列浓度的校准品410mg/l、200mg/l、100mg/l、50mg/l、25mg/l、5mg/l、0mg/l。在本公司自研的全自动特定蛋白分析仪上按照如下参数进行定标
本发明的有益效果：
1)试剂i中加入tween-20、tritonx-100、海藻糖能够改善试剂i的体系稳定性，增加储存有效期，加入nacl可以增加盐离子的浓度，防止试剂i出现结晶发生，乙二胺四乙酸二钠的加入则可以络合尿液样本中的多种重金属离子，防止测试过程中重金属离子的干扰，同时通过多次单因素试验，获得较为理想的peg6000反应促进剂，对加速试剂ii中抗malb抗体与样本的反应有理想的促进作用。
2)试剂ii山羊抗人malb抗血清属于多抗，除含有抗malb抗体外，还含有多种杂抗，加入吐温-20、tritonx-100、甘油等可有效抑制杂抗对反应过程的影响，同时可以起到稳定体系和加速反应速度的作用。同时对反应体系进行优化，使试剂盒的线性范围达到400mg/l，重复性cv≤10％，最低检测限达到3mg/l,稳定性达到12个月，临床样本比对相关性的r值≥0.98。这大大提高了临床诊断的准确度和检测范围。
附图说明
图1朗道试剂与实施例2制得的试剂临床比对相关性
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步说明：
1、制备试剂盒(实施例1、实施例2和实施例3)
试剂i的配制
按照如下配方配制实施例1、实施例2和实施例3的试剂i
定容完毕后，使用1n的hcl溶液调节ph至7.8,备用。
试剂ii的配制
按照如下配方配制实施例1、实施例2和实施例3的试剂ii缓冲液
定容完毕后，使用1n的naoh溶液调节ph至7.4备用。
实施例1将山羊抗人malb血清与试剂ii缓冲液混合，使山羊抗人malb血清的终浓度为30mg/ml。
实施例2将山羊抗人malb血清与试剂ii缓冲液混合，使山羊抗人malb血清的终浓度为35mg/ml。
实施例3将山羊抗人malb血清与试剂ii缓冲液混合，使山羊抗人malb血清的终浓度为40mg/ml。
以上试剂ii2-8℃保存。
2、用制得的实施例1、实施例2和实施例3进行标定标准曲线
配制系列浓度的校准品410mg/l、200mg/l、100mg/l、50mg/l、25mg/l、5mg/l、0mg/l。用本公司自研的全自动特定蛋白分析仪上按照如下参数进行定标：
标定数据如下所示：
3、(1)线性范围测定结果
实施例1测定结果如下：
实施例2测定结果如下：
实施例3测定结果如下：
(2)试剂盒批内重复性测试
上述数据表明，本公司研发的尿微量白蛋白测定试剂盒其重复性≤10％，特别是实施例2，其重复性≤2％。这就提高了试剂盒检测的精密度。
4、试剂盒的准确度测试
将国际约定校准品erm-da470k/ifcc稀释至靶值分别为215mg/l和25mg/l，发现测试值与靶值的相对偏差在10％以内，特别是实施例2的测试值与靶值的相对偏差在3％以内这就大大提高了试剂盒测试的准确度，为样本检测的准确性提供保障。
5、最低检测限
代入定标曲线后，实施例1代入曲线测得，最低检测限的结果值为1.72mg/l；最低检测限≤2mg/l。
实施例2最低检测限的测试结果为0.588mg/l；最低检测限≤1mg/l。
实施例3代入曲线测得，最低检测限的结果值为1.72mg/l；最低检测限≤2mg/l。
6、长期稳定性检测
考察方案：将实施例2的三批试剂置于正常贮存条件下(2-8℃)，在第3个月、6个月、9个月、12个月、14个月进行测试，中途若出现不合格，则可终止稳定性考察。
考察结果如下：
从上述考察结果可知，试剂盒在2-8℃储存，其稳定性可达到12个月.
7、临床样本比对结果
朗道试剂与自研试剂临床比对相关性结果见图1所示。
临床比对相关性可达到r＝0.998，临床样本相关性良好。
以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。