THBS2蛋白检测物在制备肝细胞癌预后评估试剂盒中的应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种thbs2蛋白检测物在制备肝细胞癌预后评估试剂盒中的应用。

背景技术：

肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,hcc)是常见的恶性肿瘤之一，有较高的发病率和死亡率，每年约650000人死于hcc。目前肝切除术等外科手术仍是肝细胞癌的主要治疗方法，但术后复发转移率高，5年生存率较差，个体差异大。

肝细胞癌的预后是指预测肝细胞癌患者的可能病程和结局，例如康复的可能性，经过治疗后复发的可能性，肝癌诊断后患者生存的可能性等等。这与肝细胞癌肿瘤的恶性程度、诊断和治疗时间、治疗方案、病人身体状况等有关，如肿瘤直径小于3厘米的肝细胞癌患者有较好预后。对肝细胞癌预后的评估可有效的指导治疗，如对评估为良好预后的患者，可避免过度的化疗、放疗等有严重副作用的方法。而对评估为不良预后的患者，则应更积极的采用多种治疗手段以延迟其生存期。所以，寻找肝细胞癌预后评估的生物标记物，进而指导临床对于肝细胞癌患者非常重要。

thrombospondin-2(thbs2)是一种介导细胞-细胞和细胞-基质间相互作用的糖蛋白。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供检测待测肝细胞癌患者thbs2蛋白含量的物质的用途。

本发明提供的检测待测肝细胞癌患者thbs2蛋白含量的物质在制备预测或辅助预测所述待测肝细胞癌患者预后效果或预后生存时间产品中的应用；

或本发明提供的检测待测肝细胞癌患者血清或血浆中thbs2蛋白含量的物质在制备评估或辅助评估所述待测肝细胞癌患者预后效果或预后生存时间产品中的应用。

上述应用中，所述预后效果通过预后生存时间体现。

上述应用中，所述检测待测肝细胞癌患者thbs2蛋白含量的物质为检测待测肝细胞癌患者血清或血浆中thbs2蛋白含量的物质。

上述应用中，所述物质包括thbs2蛋白elisa检测试剂盒；

或所述试剂盒具体包括thbs2蛋白抗体和thbs2蛋白抗原。

上述应用中，所述待测肝细胞癌患者为群体或个体；

或所述预后生存时间为无病生存时间和/或总生存时间；

或所述预后生存时间为治疗后132个月以内的生存时间。

预后生存时间为治疗后预后生存时间，具体指手术后预后生存时间。

本发明另一个目的是提供一种预测或辅助预测待测肝细胞癌患者群体预后生存时间长短的产品。

本发明提供的产品，包括检测待测肝细胞癌患者群体中各个患者thbs2蛋白含量的物质和记载如下标准的可读载体；

所述标准为高thbs2蛋白含量的待测肝细胞癌患者的预后生存时间短于或显著短于低thbs2蛋白含量的待测肝细胞癌患者。

本发明第3个目的是提供一种预测或辅助预测待测肝细胞癌患者群体预后效果的产品。

本发明提供的产品，包括检测待测肝细胞癌患者群体中各个患者thbs2蛋白含量的物质和可读存储介质，该可读存储介质被处理器执行时实现以下步骤：高thbs2蛋白含量的待测肝细胞癌患者的复发和/或死亡的风险或比例高于或显著高于低thbs2蛋白含量的待测肝细胞癌患者(高thbs2蛋白含量的待测肝细胞癌患者的复发和/或死亡的风险高于或显著高于低thbs2蛋白含量的待测肝细胞癌患者；或高thbs2蛋白含量的待测肝细胞癌患者的复发和/或死亡的比例高于或显著高于低thbs2蛋白含量的待测肝细胞癌患者)。

上述产品中，所述检测待测肝细胞癌患者群体中各个患者thbs2蛋白含量的物质为检测待测肝细胞癌患者群体中各个患者血清或血浆中thbs2蛋白含量的物质；

或所述检测待测肝细胞癌患者群体中各个患者血清或血浆中thbs2蛋白含量的物质具体包括thbs2蛋白elisa检测试剂盒；

或，所述thbs2蛋白elisa检测试剂盒具体包括thbs2蛋白抗体；

或，所述血清或血浆中高thbs2蛋白含量为高于待测肝细胞癌患者群体血清或血浆中thbs2蛋白含量的中位值或平均值；

或，所述血清或血浆中低thbs2蛋白含量为不高于待测肝细胞癌患者群体血清或血浆中thbs2蛋白含量的中位值或平均值；

或，所述预后效果通过预后生存时间体现。

检测待测肝细胞癌患者群体中各个患者thbs2蛋白含量的物质和上述可读载体在如下1)或2)中的应用也是本发明保护的范围：

1)制备预测或辅助预测所述待测肝细胞癌患者预后生存时间或预后效果产品；

2)制备评估或辅助评估所述待测肝细胞癌患者预后生存时间或预后效果产品；

所述检测待测肝细胞癌患者群体中各个患者thbs2蛋白含量的物质为检测待测肝细胞癌患者群体中各个患者血清或血浆中thbs2蛋白含量的物质。

人血清或血浆中thbs2蛋白作为肝细胞癌预后生存时间检测标记物中的应用也是本发明保护的范围。

所述thbs2蛋白为人thbs2蛋白。

本发明的实验证明，本发明发现肝癌患者中，thbs2血清高表达组在无病生存(disease-freesurvival，dfs)和总生存(overallsurvival，os)曲线中预后显著差于thbs2血清低表达组(dfspvalue＝0.0001；ospvalue＝0.0011)，表明thbs2蛋白血清中的含量可以作为肝细胞癌预后生存时间的检测标记物。

附图说明

图1为血清thbs2在肝癌患者中无病生存期的kaplan–meier曲线。

图2为血清thbs2在肝癌患者中总生存期的kaplan–meier曲线。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的患者的血清均来自于全血，使用前-80℃冷冻保存。

实施例1、酶联免疫吸附实验测定血清中thbs2蛋白丰度

一、实验材料

血清样本是有hbv慢性感染背景、临床确诊的46例肝细胞癌(hcc)患者的术前血清，由北京肿瘤医院提供。

二、实验方法

对血清样本中的thbs2蛋白水平进行elisa检测，所用试剂盒为r&dsystems公司thbs2elisa检测试剂盒(货号：dy1635)，具体方法如下：

1、用pbs稀释捕获抗体(试剂盒配备)至4μg/ml，向96孔酶标板中每孔加入100μl捕获抗体，室温孵育过夜，得到thbs2捕获抗体包被的酶标板a；

2、用pbst(pbs中包含0.05％20)洗3次，每次1min；

3、酶标板a中每孔加入300μl1％bsa，室温孵育2小时；

4、用pbst洗3次，每次1min；

5、用1％bsa稀释待测血清样本(1：40)，thbs2蛋白标准品(试剂盒自带)稀释梯度10000pg/ml、5000pg/ml、2500pg/ml、1250pg/ml、625pg/ml、313pg/ml、156pg/ml、0pg/ml，稀释后的血清样本和标准品各100ul加入到封闭后的酶标板a，室温孵育2小时；

6、用pbst洗3次，每次1min；

7、用1％bsa稀释thbs2检测抗体(试剂盒配备)至200ng/ml，向结合有抗原的酶标板a中每孔加100μl检测抗体，室温孵育2小时；

8、用pbst洗3次，每次1min；

9、用1％bsa水溶液1:200稀释加辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，hrp)标记的链霉素(streptavidin-hrp，试剂盒配备)，每孔加入100μl，室温避光孵育20分钟；

10、用pbst洗3次，每次1min；

11、向链霉素反应后的酶标板a中每孔加入100μltmb底物(试剂盒配备)，室温避光反应20分钟，反应结束后，向酶标板的每孔中加入50μl终止液(试剂盒配备)，得到显色后的酶标板，在450nm波长读数。

通过thbs2标准蛋白浓度和其对应的od值绘制标准曲线(四参数logistic曲线拟合方程：y＝(3.44684-0.02660)/[1+(x/5453.48934)^-1.12448]+0.02660)。通过各孔血清样本所测得的od值，利用elisacalc软件对thbs2的标准曲线进行四参数拟合，计算各血清样本中thbs2蛋白的含量，结果如表1所示。结果显示，肝癌患者中thbs2蛋白的浓度平均值±标准差为45.24±31.36ng/ml。

46例肝细胞癌患者手术治疗后的随访情况如表1所示，列出了132个月以内的无病生存时间(dfs)和总生存时间(os)，中位数无病生存时间为18.5个月，中位数总生存时间为37个月。

表1肝癌患者血清中thbs2蛋白浓度(ng/ml)及预后信息

对肝癌患者预后进行分析，以肝癌患者血清thbs2表达值中位数(36.9ng/ml)卡值分为thbs2高表达组和thbs2低表达组，用graphpadprism6软件进行无病生存(dfs)和总生存(os)的kaplan–meier曲线分析，log-rank检验计算p值(如图1和图2所示)。结果表明肝癌患者血清thbs2高表达组无病生存时间(dfs)显著短于thbs2低表达组(中位无病生存时间为9个月vs.50个月，p＝0.0001)，thbs2高表达组一年复发率为70％、低表达组仅为26％；血清thbs2高表达组总生存时间(os)显著短于thbs2低表达组(中位总生存时间为20个月vs.89个月，p＝0.0011)，thbs2高表达组一年死亡率为39％、低表达组仅为9％。对无病生存时间(dfs)进行cox多因素回归分析，发现thbs2是肝癌无病生存的独立预测因子。

表2cox回归分析临床指标与肝癌无病生存时间的关系

上述结果表明，通过检测待测肝细胞癌患者群体血清中thbs2蛋白含量评估或预测肝细胞癌患者预后生存状态，血清中高thbs2蛋白含量的待测肝细胞癌患者的预后生存时间短于或显著短于血清中低thbs2蛋白含量的待测肝细胞癌患者。

待测肝细胞癌患者群体由血清中高thbs2蛋白含量的待测肝细胞癌患者和血清中低thbs2蛋白含量的待测肝细胞癌患者组成；

血清中高thbs2蛋白含量为高于待测肝细胞癌患者群体血清中thbs2蛋白含量的中位值；

血清中低thbs2蛋白含量为不高于待测肝细胞癌患者群体血清中thbs2蛋白含量的中位值。

在本实施例的群体中，46例待测肝细胞癌患者群体血清中thbs2蛋白含量的中位值为36.9ng/ml。

上述实施例对本发明进行具体描述，并不用于限制本发明。在不脱离本发明原理的前提下，对本发明的修饰、改动均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>北京蛋白质组研究中心

<120>thbs2蛋白检测物在制备肝细胞癌预后评估试剂盒中的应用

<160>1

<170>patentinversion3.5

<210>1

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