本发明涉及动物病毒抗体检测方法领域，本发明提供了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测方法及其应用。
背景技术：
猪繁殖与呼吸综合征(porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,prrs)是由prrs病毒(prrsv)引起的一种急性传染病，是一种以引起母猪繁殖障碍和各日龄猪呼吸疾病为特征的高度接触性传染病，主要特征表现为怀孕母猪食欲不振、持续性发热、流产、早产、木乃伊胎及弱仔等症状以及哺乳仔猪和育成猪的高死亡率和呼吸系统疾病等，此外，通常还表现为部分发病的愈后母猪屡配不孕、发情不典型等症状。目前该病已成为危害世界养猪业的首要传染病之一。该病不但缺乏治疗的有效药物，而且现有的疫苗也不能有效控制prrsv感染，致使prrs不断暴发流行。
酶联免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,elisa)是一种广泛应用在测定液体样本中的蛋白、抗体或激素的免疫分析技术，具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。适用于量大临床标本的同时检测。elisa是对prrsv疫苗免疫后机体抗体效价评价的主要方法，也是对prrsv感染情况进行监控的最常用的方法之一。目前所建立的elisa检测方法大多采用prrsv全病毒或表达的核衣壳(n)蛋白作为抗原，最常用的为商品化美国idexx试剂盒。但我们在应用idexx试剂盒对临床血清样品检测中发现，个别猪只即使免疫过prrsv弱毒疫苗3周后仍然检测不到抗体，发明人分析出现这种原因有以下2个方面，一个是机体不产生prrsv的抗体，二是现有的检测方法不能检测到，这就导致了检测的准确率大大下降。有抗体检测不到，无法监控其体内的抗体产生情况，容易造成假阴性而在此免疫，造成误判，制定不合理免疫程序，造成疫病发生，从而带来经济损失。因此如何克服现有检测方法存在的上述缺陷成为急需解决的问题。
技术实现要素：
针对现有技术的上述情况，本发明提供了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测方法及其应用，首先将hp-prrsvhun4疫苗毒株的非结构蛋白nsp4克隆入pet-28a(+)原核表达载体中进行低温诱导呈可溶性表达，利用his标签进行纯化，纯化后的蛋白作为包被抗原，优化建立间接elisa方法；并确定临界值为0.406，利用优化建立的elisa方法检测1274份临床猪血清，阳性率为71.59％，同时与美国idexx试剂盒检测结果比较，阳性率符合率达到92％，其中4％的血清(50/1274)用idexx试剂盒检测为阴性而用本发明中的技术则检测为阳性，说明本发明所提供的检测方法准确率高，可用于临床血清样品的常规检测。
发明人针对背景技术中存在的问题，最终决定利用更换包被抗原的方式来尝试解决，发明人应用多个prrsv的病毒蛋白作为包被抗原建立elisa方法，最终经过多次验证后发现，非结构蛋白nsp4作为包被抗原时能检测到现有技术中n蛋白检测不到的prrsv抗体，因此本发明提供的方法弥补了现有的国内外检测方法的不足，将更有利于prrsv抗体检测及prrsv流行的监控。
本发明的具体技术方案是：
1.根据genbank(登陆号：ef635006)收录的hp-prrsvhun4疫苗毒株全基因组核苷酸序列，设计并合成了一对用于扩增hp-prrsvhun4疫苗毒株nsp4基因的引物，引物如下：
f-5’-cccgctagcggtatttcagactca-3，其核苷酸序列如seqidno.1所示；其中引入了nhei酶切位点；
r-5’-ccctcgagttccgttgggtttggc-3’，其核苷酸序列如seqidno.2所示；引入了xhoi酶切位点；
扩增片段经胶回收纯化后，其核苷酸序列如seqidno.3所示，其编码的氨基酸序列如seqidno.4所示；
2.目的蛋白的纯化
将合成的基因片段用限制性内切酶nhei和xhoi双酶切后连接入pet-28a(+)载体，转化至dh5α大肠杆菌感受态细胞，加入1mmiptg，30℃诱导5h，收集菌体，用sds-page检测表达情况，结果发现在该条件下，表达的nsp4蛋白出现在裂解上清中，呈可溶性表达。而可溶性表达更能模拟蛋白自然特性，省去了蛋白复性的繁琐过程。用南京金斯瑞生物科技有限公司的镍柱纯化试剂盒对蛋白进行纯化。
3.elisa条件优化
对elisa过程中的每一步骤进行优化，其优化的结果为：
抗原包被量：200ng，包被缓冲液为ph＝7.2的磷酸盐缓冲液其1l溶液中含0.356gnah2po4，2.772gna2hpo4·12h2o，8.5gnacl，包被过夜；
洗涤：含有体积浓度为0.5‰的吐温-20的ph7.2的磷酸盐缓冲液(pbs’t)，轻微振荡1min后弃去，重复5次；
封闭：用含有体积浓度为2.5％脱脂奶粉的ph为7.2的pbs’t缓冲液的封闭液封闭，37℃孵育1h；
洗涤：含有体积浓度为0.5‰的吐温-20的ph7.2的磷酸盐缓冲液(pbs’t)，轻微振荡1min后弃去，重复5次；
血清样品稀释：用ph为7.2的pbs’t+体积浓度为2.5％脱脂奶粉按1:40稀释，加入100μl；
洗涤：含有体积浓度为0.5‰的吐温-20的ph7.2的磷酸盐缓冲液(pbs’t)，轻微振荡1min后弃去，重复5次；
酶标抗体：辣根过氧化物酶标记的羊抗猪的抗体，用ph7.2的磷酸盐缓冲液(pbs’t)1:2000稀释(购自美国jacksonimmunoresearch公司)，加入100μl，37℃孵育60min；
洗涤：含有体积浓度为0.5‰的吐温-20的ph7.2的磷酸盐缓冲液(pbs’t)，轻微振荡1min后弃去，重复5次；
显色：每孔加入底物tmb100μl，37℃避光显色15min；
终止：每孔加3mol/l的硫酸50μl，终止反应；
读数：酶标仪od450nm读取。
4.临界值的确定
实验室保存的猪的prrsv抗体阳性血清样品70份，这些血清来自hp-prrsvhun4疫苗(购买自哈尔滨维科生物技术公司)免疫过的猪场，用westernblot和idexx试剂盒检测均为阳性；阴性血清样品80份(取自prrsv阴性猪场)，用上述条件进行检测，检测结果用tg-roc软件分析od值其cut-off值为0.406。
采用本发明上述公开的检测方法，具有如下有益效果：
本发明中建立的是以prrsv非结构蛋白nsp4作为包被抗原建立的elisa方法。在低温诱导下获得可溶性的nsp4，更能模拟蛋白自然特性，保存有更多nsp4上的b细胞表位区域，与抗体结合更特异有效，也省去了蛋白复性的繁琐过程。建立的以nsp4为包被抗原的elisa与idexx试剂盒的符合率能达到92％，更为重要的是该方法能检测到idexx试剂盒无法检测到的prrsv抗体阳性血清样品，可弥补经典prrsv抗体检测elisa中的不足和缺陷，可用于临床血清的检测，对prrsv疫苗抗体和感染情况进行监控。
附图说明
图1为prrsvnsp4蛋白的重组蛋白westernblot电泳图，
图中m为1为空载体转化诱导表达重组蛋白，2为纯化的重组蛋白，3未纯化重组蛋白，从图中可以显现出空载体转化大肠杆菌1未诱导蛋白因此没有目的蛋白，诱导纯化蛋白2有较纯的目的蛋白；未纯化重组蛋白3有目的蛋白也有其他细菌蛋白。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。在实施例中涉及的所有培养基和分子生物学等技术手段为本领域技术人员所熟知。
实施例中所用的试剂均采用现有技术中已知的产品。
实施例1nsp4基因获得的获得
a.rna提取：将hp-prrsvhun4疫苗(购买自哈尔滨维科生物技术公司)200μl，加入相同体积的trizol，按照说明书提取prrsvrna，测定rna浓度，放-80℃冰箱备用。
b.反转录：将提取的rna进行反转录，反转录体系为20μl包括：5×反转录酶buffer2μl，10mmdntpmix4μl，rna酶抑制剂1ul，oligo(dt)18primer1μl，amv反转录酶1μl，rnase-freewater1μl，模板rna1μg；反应条件为42℃，60min；70℃，5min。
c.pcr扩增目的片段：以反转录合成的cdna为模板，进行pcr扩增。反应体系为50μl:上下游引物各1μl，takarapremixtaq25μl，cdna2μl，补水至50μl。反应条件:94℃，5min；94℃，30s；62℃，30s；72℃，45s；72℃延伸10min，4℃终止,31个循环。pcr产物经胶回收试剂盒回收、纯化。
其中所采用的引物如下：
f-5’-cccgctagcggtatttcagactca-3，其核苷酸序列如seqidno.1所示；其中引入了nhei酶切位点；
r-5’-ccctcgagttccgttgggtttggc-3’，其核苷酸序列如seqidno.2所示；引入了xhoi酶切位点；
扩增片段经胶回收纯化后，其核苷酸序列如seqidno.3所示，其编码的氨基酸序列如seqidno.4所示；
d.表达载体的克隆：将扩增的片段(seqidno.3)进行胶回收纯化，用限制性内切酶nhei和xhoi双酶切后连接入pet-28a(+)载体，转化至dh5α大肠杆菌感受态细胞中，用卡那霉素抗性筛选重组转化子,挑取单个菌落、提取质粒，并对质粒进行双酶切鉴定，酶切鉴定正确的质粒送至上海生物工程股份有限公司测序。
实施例2nsp4表达纯化
a.nsp4蛋白的表达鉴定：将重组表达质粒pet28a-nsp4转化表达菌trasseta(de3)感受态细胞，利用卡那抗性筛选重组转化子，挑取单菌落于lb培养基中活化过夜，按体积比1％比例转接到新鲜含有卡那抗性的lb培养基中培养至od600约为0.8时加入终浓度为1mm的iptg，225rpm，30℃震荡培养诱导5h。4℃10000g离心10min收集菌体，用pbs重悬，超声破碎，12000rpm4℃离心15min，收集上清和沉淀，进行sds-page鉴定。结果表明目的蛋白获得了高效表达，大小约为26kda，大部分目的蛋白位于裂解上清中。
b.nsp4蛋白的纯化：将转化有pet28a-nsp4的表达菌trasseta(de3)大量培养后，超声波破碎后，离心取上清。用南京金斯瑞生物科技有限公司的镍柱纯化试剂盒在非变性条件下对蛋白进行纯化。
c.纯化蛋白的鉴定：将纯化的nsp4蛋白进行sds-page电泳，转印至pvdf膜上，以his标签鼠抗体为一抗，hrp标记的羊抗鼠igg抗体为二抗，ecl显色进行检测，在26kda处出现了一条特异性的条带。鉴定该蛋白氨基酸序列如seqidno.4所示。
实施例3elisa条件优化
对elisa过程中的每一步骤进行优化，其优化的结果为：
a.抗原包被量：用50-1000ng的纯化nsp4为包被蛋白，发现包被200ng时p/n值最高；
b.包被条件：对不同的包被缓冲液和作用时间检测，发现包被缓冲液为ph＝7.2的磷酸盐缓冲液其1l溶液中含0.356gnah2po4，2.772gna2hpo4·12h2o，8.5gnacl，包被过夜时p/n值最高；
c.封闭条件：用含有2.5％脱脂奶粉的ph为7.2的pbs’t缓冲液的封闭液封闭，37℃孵育1h时p/n值最高；
d.血清样品稀释：用ph为7.2的pbs’t+体积浓度为2.5％脱脂奶粉按1:40稀释，加入100μl时p/n值最高；
e.酶标抗体：辣根过氧化物酶标记的羊抗猪的抗体1:2000倍用ph7.2的磷酸盐缓冲液(pbs’t)稀释(购自美国jacksonimmunoresearch公司)100μl，37℃孵育60min时p/n值最高；
f.洗涤条件：含有体积浓度为0.5‰的吐温-20的ph7.2的磷酸盐缓冲液(pbs’t)，轻微振荡1min后弃去，重复5次时p/n值最高；
g.其他条件：显色：每孔加入底物tmb100μl，37℃避光显色15min；
h.终止：每孔加3mol/l的硫酸50μl，终止反应；
i.读数：酶标仪od450nm读取。
实施例4临界值的确定
为了确定建立的elisa的临界值，用prrsv抗体阳性血清样品70份，这些血清来自hp-prrsvhun4疫苗(购买自哈尔滨维科生物技术公司)免疫猪场，用westernblot和idexx试剂盒检测均为阳性；阴性血清样品80份(取自prrsv阴性猪场)，用上述优化的条件进行检测，检测结果用tg-roc软件分析。经分析在特异性和敏感性均为100％时，确定了cut-off值为0.406。
实施例5建立elisa方法的应用
利用本发明所述的检测方法对来自各地养殖场收集的猪血清1274份进行检测，具体步骤如下：
1.样品处理：将采集的猪的血样放置于1.5ml离心管中，以8000rpm/min的转速，离心5分钟，除去红细胞和杂质，收集上清用于检测；
2.加样：将纯化的nsp4蛋白包被过夜后，封闭。酶标板分别设置2个阴阳对照孔，其余孔为待测样品孔；待测样品先用稀释液(ph为7.2的pbs’t+体积浓度比为2.5％脱脂奶粉)把步骤1中离心后的血清按1:40稀释好，然后把稀释好的混合液逐滴加入包被好的酶标板中；加样时将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，用封板膜封板后置37℃温育1h；
3、洗涤：弃去酶标板中的液体，甩干，每孔加满洗涤液(洗涤液为ph为7.2的pbs+0.5‰吐温-20)，轻微振荡1min后弃去，重复5次，拍干，此步骤的目的是为了洗去板孔中没有与包被的蛋白结合的物质；
4、加酶标抗体：每孔加入辣根过氧化物酶标记的羊抗猪的抗体100μl(1:1000倍稀释)，用封板膜封板后置37℃孵育1h，此步骤中酶标抗体与结合在固相蛋白上的nsp4抗体结合；
5、洗涤：操作同步骤4，此步骤是为了洗去板孔中未结合的酶标抗体；
6、显色：每孔加入显色剂(底物tmb)100μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15min，此步骤中显色剂与辣根过氧化物酶反应显蓝色；
7、终止：每孔加终止液(3mol/l的硫酸)50μl，终止反应(此时蓝色立即变为黄色)；
8、测定：用酶标仪在450nm波长下测量各孔的吸光度(od值)。测定应在加终止液后15min以内进行。
结果判定：根据样品的od值于临界值比较，当试剂盒所测样品的od值大于cut-off为阳性，所测样品的od值小于cut-off值为阴性。
在1274份血清中，nsp4蛋白包被的elisa检测阳性样品为912份，占71.59％；阴性样品362份，占28.41％。idexx试剂盒检测结果的阳性样品为989份，占77.63％；阴性样品285份，占22.37％。对其中检测结果不同的分析发现，50份血清中用idexx试剂盒检测为阴性，但是用我们建立的nsp4包被的elisa全为阳性，经westernblot验证，有49份能与nsp4蛋白结合，本发明中建立的elisa方法可弥补iedxx试剂盒的补足，可用于临床常规检测使用。
<110>山东农业大学
<120>一种猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测方法及其应用
<160>4
<210>1
<211>24
<212>dna
<213>人工序列
<400>1
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<210>2
<211>24
<212>dna
<213>人工序列
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<212>dna
<213>猪繁殖与呼吸综合征病毒prrsv
<400>3
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