检测腺癌的蛋白标志/标记的制作方法

本申请是申请号为200880013776.x，申请日为2008年3月25日，发明名称为“检测腺癌的蛋白标志/标记”的中国专利申请的分案申请。

本发明涉及诊断胰腺腺癌的方法和用于其的生物标记和阵列。

背景技术：

在肿瘤学中一个遗留的挑战是关于患者经历肿瘤复发或药物治疗抗性的可能性，或他们存活期望，将他们分级。

胰腺导管腺癌是解剖位置上最致命的恶性肿瘤，单在美国每年有>30,000的新病例和死亡，并且5年的存活是3-5％。这种极高的死亡率是由于缺少有效的早期诊断方法(5)和现存治疗对晚期疾病的不良效果。甚至被诊断有手术可切除肿瘤的患者(10-20％)最终死于复发和转移疾病。因此检测和预测癌症能力的增加对于个体患者的管理是重要的。

抗体微阵列技术(3)具有提供强大的多元分析的潜能(6,7)并且已经建议将其作为技术平台，该平台最终将递送确定的蛋白标志(proteinsignature)，即从正常患者中区分癌症患者的血清蛋白组合。微阵列技术现在已经成熟到已经克服最初的障碍并且可以分析复杂蛋白质组中的微量蛋白(8-12)。但是癌症的基因表达图谱只在少数病例中证明预测存活时间的能力(1,2)，目前没有将血清蛋白组合与任何上述临床参数联系起来。

能预测存活时间的血清样品分析将允许更个体化的癌症治疗。这对于例如其中没有肿瘤特异的标记存在胰腺腺癌得到强调，虽然大多数患者在诊断时将具有升高的ca19-9，但是胰腺腺癌，已经显示单独预测标记是非结论性的(4)。另外，非侵入性的方法，例如计算断层摄影术(computedtomography)，没有足够敏感到能检测小的癌，而例如内窥镜超声图像检查法(endoscopicultrasonography)可以用于观察具有胰腺损伤危险的个体(5)。

与这一背景相反，本发明人现在已经研制了预测性诊断癌症的蛋白质组方法，并鉴定出用于测定胰腺癌和预测存活的第一套血清生物标记。

技术实现要素：

因此，在第一方面，本发明提供一种测定在个体中存在胰腺腺癌的方法，其包括下列步骤：

a)提供需要测试的蛋白样品(例如血清或血浆)；

b)通过测定在测试样品中选自表1中的群组的一个或更多蛋白的存在和/或量而测定测试样品的蛋白标志；

其中在测试样品中的选自表1中的群组的一个或更多蛋白的存在和/或量是胰腺腺癌存在的指征。

“蛋白标志”包括的意思是在具有癌症的个体中存在的血清蛋白存在和/或量的组合，并且其可以区别于存在于未被癌症(例如胰腺腺癌)困扰个体-即正常或健康的个体中的血清蛋白的存在和/或量的组合。

如在随附的实施例中所例证的，存在于测试样品中某些血清蛋白的存在和/或量可以是个体中癌症，例如胰腺腺癌，存在的指征。例如在单一测试样品中某些血清蛋白的相对存在和/或量可以是在个体中癌症，例如胰腺腺癌，存在的指征。

优选地，该个体是人类，但是可以是任何哺乳动物例如家养哺乳动物(优选地是农业或商业上重要的哺乳动物包括马、猪、牛、羊、狗和猫)。

优选地，本发明的第一方面的方法进一步包括下列步骤：

c)提供来自未被胰腺腺癌困扰个体的对照血清或血浆样品；

d)通过测定对照样品中在步骤(b)中测定的一个或更多蛋白的存在和/或量而测定对照样品的蛋白标志；

其中胰腺腺癌的存在是在下面事件中鉴定的：测试样品中在步骤(b)中测定的一个或更多蛋白的存在和/或量与对照样品中步骤(b)中测定的一个或更多蛋白的存在和/或量不同。

优选地，测试样品中在步骤(b)中测定的一个或更多蛋白的存在和/或量与对照样品中在步骤(b)中测定的一个或更多蛋白的存在和/或量显著不同(即统计学上不同)。例如，如在随附的实施例中讨论的，在测试样品和对照样品中特定蛋白的存在和/或量之间的显著不同可以被归类为那些其中p<0.05的差异。

通常，第一方面的方法包括测定在测试样品中在表1中定义的所有蛋白-即在表1中所有19个蛋白的存在和/或量。

或者，第一方面的方法可以包括测定在测试样品中在表1中定义的1或2或3或4或5或6或7或8或9或10或11或12或13或14或15或16或17或18或19个蛋白的存在和/或量。

在优选的具体实施方式中，第一方面的方法包括测定在测试样品中rante和/或嗜酸细胞活化趋化因子(eotaxin)和/或ei和/或tnf-b(1)和/或tnf-b(2)和/或glp-1和/或vegf和/或il-13和/或cd40的存在和/或量。

在第二方面，本发明提供确定被胰腺腺癌困扰个体的存活时间的方法，其包括下列步骤：

i)提供需测试样品的血清或血浆；

ii)通过测定在测试样品中选自表2中的群组的一个或更多蛋白的存在和/或量而测定测试样品的蛋白标志；

其中个体的存活时间是在下列事件中鉴定的：在测试样品中选自表2中的群组的一个或更多蛋白的存在和/或量是存活时间在12个月以下或在12个月以上或在24个月以上的指征。

优选地，根据第二方面，该方法进一步包括下列步骤：

iii)提供来自存活时间在12个月以下的个体的第一对照血清或血浆样品和/或来自存活时间在12个月以上和/或24个月以上的个体的第二对照血清或血浆样品；

iv)通过测定在步骤(ii)中测定的一个或更多蛋白的存在和/或量，测定第一和/或第二对照样品的蛋白标志；

其中个体的存活时间是通过比较下列两者鉴定的：在测试样品中在步骤(ii)中测定的一个或更多蛋白的存在和/或量与在第一和/或第二对照样品中在步骤(iv)中测定的一个或更多蛋白的存在和/或量比较。

通过比较在测试样品和对照样品中选定的一个或更多蛋白的存在和/或量，可能确定被胰腺腺癌困扰个体的存活时间。例如，如果测试样品与来自已知具有存活时间在24个月以上的患者的对照样品具有相同(即同一的)或基本上相似或显著相似的一个或更多选定蛋白的存在和/或量，则测试样品将被确定为来自具有存活时间在24个月以上患者的样品。其它这样的比较将会被诊断领域中的技术人员所理解。

通常，第二方面的方法包括测定在测试样品中在表2中定义的所有蛋白-即在表2中的所有22个蛋白的存在和/或量。

或者，第一方面的方法可以包括测定在测试样品中在表2中定义的1或2或3或4或5或6或7或8或9或10或11或12或13或14或15或16或17或18或19或20或21或22个蛋白的存在和/或量。

在优选的具体实施方式中，第一方面的方法包括测定在测试样品中cd40配体和/或粘液蛋白(mucine)和/或il-16和/或rantes和/或嗜酸细胞活化趋化因子和/或mcp-4和/或il-11和/或tnf-b和/或il-1ra和/或mcp-3和/或il-1a和/或il-3和/或c3和/或ldl(1)和/或ldl(2)和/或lewisy的存在和/或量。

优选地，本发明的第一方面提供一种方法，其中使用能够结合一个或更多蛋白的第一结合试剂完成步骤(b)和/或步骤(d)。优选地，本发明的第二方面提供一种方法，其中使用能够结合一个或更多蛋白的第一结合试剂完成步骤(ii)和/或步骤(iv)。

根据其结合给定基序的能力，如下面讨论的，结合试剂(也称结合分子)可以选自文库。

至少一种结合分子的类型，更通常的是所有结合分子的类型可以是抗体或片段或其变体。

因此，片段可以含有一个或更多可变重(vh)结构域或可变轻(vl)结构域。例如，术语抗体片段包括fab-样分子(better等人(1988)science240,1041)；fv分子(skerra等人(1988)science240,1038)；其中vh和vl伴侣结构域是通过柔韧的寡肽连接的单链fv(scfv)分子(bird等人(1988)science242,423；huston等人(1988)proc.natl.acad.sci.usa85,5879)和包括分离的v结构域的单一结构域抗体(dab)(ward等人(1989)nature341,544)。

术语“抗体变体”包括任何合成抗体、重组抗体或抗体杂合体，例如，但不限于单链抗体分子，该抗体分子是通过噬菌体显示免疫球蛋白轻和/或重链可变和/或恒定区而产生的，或在本领域技术人员已知的免疫分析形式中能够结合抗原的其他免疫相互作用分子。

在winter和milstein(1991)nature349,293-299中可以找到涉及合成保留了其特异性结合位点的抗体片段技术的全面综述。

另外或选择性地，至少一种结合分子，更通常地所有类型的结合分子是适体(aptamer)。

分子文库如抗体文库(clackson等人,1991,nature352,624-628；marks等人,1991,jmolbiol222(3):581-97)，肽文库(smith,1985,science228(4705):1315-7)，表达的cdna文库(santi等人(2000)jmolbiol296(2):497-508)，在不是抗体架构的其他骨架上的文库如affibody(gunneriusson等人,1999,applenvironmicrobiol65(9):4134-40)或基于适体的文库(kenan等人,1999,methodsmolbiol118,217-31)可以用作对特定基序特异的结合分子的来源，该结合分子被选择用于本发明的方法。

分子文库可以在体内在原核(clackson等人,1991,op.cit.；marks等人,1991,op.cit.)或真核细胞(kieke等人,1999,procnatlacadsciusa,96(10):5651-6)中表达；或可以在体外无需细胞参与表达(hanes&pluckthun,1997,procnatlacadsciusa94(10):4937-42；he&taussig,1997,nucleicacidsres25(24):5132-4；nemoto等人,1997,febslett,414(2):405-8)。

当使用基于蛋白的文库的情况下，通常编码潜在结合分子文库的基因被包装在病毒中并且将潜在结合分子显示在病毒的表面(clackson等人,1991,op.cit.；marks等人,1991,op.cit；smith,1985,op.cit.)。

今天最常用的这样的系统是在其表面显示抗体片段的丝状噬菌体，抗体片段作为噬菌体次要外壳蛋白的融合体表达(clackson等人,1991,op.cit.；marks等人,1991,op.cit)。但是还已经使用了利用其它病毒(ep39578)、细菌(gunneriusson等人,1999,op.cit.；daugherty等人,1998,proteineng11(9):825-32；daugherty等人,1999,proteineng12(7):613-21)和酵母(shusta等人,1999,jmolbiol292(5):949-56)的其它用于显示的系统。

另外，最近，已经提出了在称作核糖体显示系统中利用多肽产物到其编码mrna连接的显示系统(hanes&pluckthun,1997,op.cit.；he&taussig,1997,op.cit.；nemoto等人,1997,op.cit.)或选择性地利用多肽产物到编码dna连接的显示系统(见美国专利no.5,856,090和wo98/37186)。

当潜在结合分子从文库中选出时，通常使用具有确定基序的一个或几个选择性多肽。提供结构、减少肽灵活性的氨基酸残基或允许与结合分子相互作用的带电、极性或疏水侧链可以用于设计选择性肽的基序。例如-

(i)当其侧链结合到α碳以及氮的时候，脯氨酸可以稳定肽结构；

(ii)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸具有芳香侧链并且是高度疏水的，而亮氨酸和异亮氨酸具有脂肪族侧链并且也是疏水的；

(iii)赖氨酸、精氨酸和组氨酸有碱性侧链并且在中性ph下带正电荷，而天冬氨酸盐和谷氨酸盐具有酸性侧链并且在中性ph下带负电荷；

(iv)天冬酰胺和谷氨酰胺在中性ph下是中性的，但是含有可以参与氢键的酰胺基团；

(v)丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸侧链含有可以参与氢键的羟基基团。

通常结合分子的选择可以包括使用阵列技术和系统以分析对应于结合分子类型的点的结合。

优选地，第一结合试剂是抗体或其片段；更优选地，是重组抗体或其片段。方便地，抗体或其片段选自scfv、fab、免疫球蛋白分子的结合结构域。

抗体的可变重(vh)和可变轻(vl)结构域涉及抗原识别，抗原识别是最初通过早期蛋白酶消化实验认知的事实。通过“人源化”啮齿动物抗体得到进一步得到确认。啮齿动物来源的可变结构域可以与人源的恒定结构域融合，这样获得的抗体保留了啮齿动物来源抗体的抗原特异性(morrison等人(1984)proc.natl.acad.sci.usa81,6851-6855)。

可变结构域赋予抗原特异性，与恒定结构域是独立的，这从涉及抗体片段的细菌表达的实验是已知的，所述抗体片段都含有一个或更多可变结构域。这些分子包括fab-样分子(better等人(1988)science240,1041)；fv分子(skerra等人(1988)science240,1038)；其中vh和vl伴侣结构域是通过柔性寡肽连接的单链fv(scfv)分子，(bird等人(1988)science242,423；huston等人(1988)proc.natl.acad.sci.usa85,5879)和含有分离的v结构域的单结构域抗体(dab)(ward等人(1989)nature341,544)。在winter&milstein(1991)nature349,293-299中可以找到涉及合成保留了其特异性结合位点的抗体片段技术的全面综述。

“scfv分子”意思是其中vh和vl伴侣结构域是通过柔性寡肽连接的分子。

使用抗体片段而不使用整个抗体的优势是几倍的。片段的较小尺寸可以引起增加的药理学性质，如对固体组织更好的穿透力。整个抗体的效应器功能，如互补结合，被去除。fab、fv、scfv和dab抗体片段可以从大肠杆菌(e.coli)中表达和分泌，因此允许容易地产生大量的所述片段。

整个抗体和f(ab')2片段是“二价的”。“二价的”意思是所述抗体和f(ab')2片段具有两个抗原结合位点。相反，fab、fv、scfv和dab片段是单价的，只有一个抗原结合位点。

抗体可以是单克隆或多克隆的。合适的单克隆抗体可以通过已知技术制备，例如那些在“monoclonalantibodies:amanualoftechniques”,hzola(crcpress,1988)和在“monoclonalhybridomaantibodies:techniquesandapplications”,jgrhurrell(crcpress,1982)中揭示的技术，两者都引入本文作为参考。

在优选的具体实施方式中，本发明提供方法，其中在测试样品中的一个或更多蛋白用可检测部分(moiety)标记。优选地，第一方面提供一种方法，其中在对照样品中的一个或更多蛋白用可检测部分标记。或者，在第二方面，在第一和/或第二对照样品中，一个或更多蛋白用可检测部分标记。

“可检测部分”包括的意思是部分是可以检测的并且部分的相对量和/或位置(例如在阵列上的位置)是可以确定的。

可检测部分在本领域中是熟知的。

可检测部分可以是荧光和/或发光和/或化学发光部分，当暴露于特定的条件下，可以检测它们。例如，荧光部分需要暴露于在特定的波长和强度下的辐射(即光)而造成荧光部分的激发，因此使其可以在特定波长下发射可检测荧光，该波长是可以检测的。

或者，可检测部分可以是酶，该酶能够将底物(优选为不可检测的底物)转化成可以观察和/或检测的可检测产物。关于例如elisa分析，在下面更详细的讨论了合适酶的例子。

或者可检测部分可以是在成像中有用的放射性原子。合适的放射性原子包括用于闪烁法研究的^99mtc和¹²³i。其它容易的可检测部分包括，例如，用于磁共振成像(mri)的自旋标记(spinlabel)，如再次提到¹²³i、¹³¹i、¹¹¹in、¹⁹f、¹³c、¹⁵n、¹⁷o、钆、锰或铁。清楚地，需要检测的试剂(如，例如在测试样品中和/或对照样品中，本文所述的一个或更多蛋白和/或用于检测所选蛋白的抗体分子)必须具有足够适当的原子同位素，以便容易地检测可检测的部分。

放射性或其他标记可以以已知的方式掺入本发明的试剂(即在本发明方法的样品中存在的蛋白和/或本发明的结合试剂)。例如，如果结合部分是多肽，其可以是生物合成的或可以使用包含例如代替氢的氟-19的合适的氨基酸前体通过化学氨基酸合成来合成。标记如^99mtc、¹²³i、¹⁸⁶rh、¹⁸⁸rh和¹¹¹in可以在结合部分通过例如半胱氨酸残基连接。钇-90可以通过赖氨酸残基连接。可以使用iodogen方法(fraker等人(1978)biochem.biophys.res.comm.80,49-57)掺入¹²³i。参考文献(“monoclonalantibodiesinimmunoscintigraphy”,j-fchatal,crcpress,1989)详细描述了其它方法。将其它可检测部分(如酶、荧光、发光、化学发光或放射性部分)连接到蛋白的方法是本领域中熟知的。

随附的实施例提供方法和用于本发明方法中的本发明标记试剂(如，例如，本发明方法样品中的蛋白和/或结合分子)的可检测部分的例子。

优选地，可检测部分选自荧光部分、发光部分、化学发光部分、放射性部分、酶的部分。

优选地，第一方面提供一种方法，其中步骤(b)和/或步骤(d)是使用阵列完成的。方便地，在第二方面，步骤(ii)和/或步骤(iv)是使用阵列完成的。

阵列本身在本领域是熟知的。通常它们由线性的或二维结构构成，所述结构具有空间分离(即不连续的)区(“点”)的，每个区具有有限的区域，在固体支持的表面上形成。阵列还可以是珠结构，其中每个珠可以通过分子代码或颜色代码鉴定或在一个连续流程中鉴定。可以连续地进行分析，其中样品通过一系列点，每个点从溶液中吸收一类分子。固体支持通常是玻璃或聚合物，最常用的聚合物是纤维素，聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。固体支持的形式可以是管、珠、盘、硅片、微量板、聚偏二氟乙烯(pvdf)膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜、其它多孔膜、非多孔膜(例如塑料、聚合体、有机玻璃(perspex)、硅、其它)、多数聚合针(polymericpin)或多数微滴度孔、或适合固定蛋白、多核苷酸和其它合适分子和/或适合进行免疫分析的的任何其它表面。结合过程在本领域中是熟知的，并且通常由下列组成：将蛋白分子、多核苷酸等交联、共价结合或物理性吸附到固体支持上。通过使用熟知技术，如接触或非接触印刷、遮蔽或照相平板印刷术(photolithography)，可以确定每个点的位置。综述见jenkins,r.e.,pennington,s.r.(2001,proteomics,2,13-29)和lal等人(2002,drugdiscovtoday15；7(18suppl):s143-9)。

通常阵列是微阵列。“微阵列”包括的意思指具有至少约100/cm²和优选地至少约1000/cm²不连续区域密度的区域阵列。在微阵列中的该区域具有例如直径，在约10-250μm范围内的典型尺度，并且在阵列中以约相同的距离与其它区域分开。该阵列还可以是巨阵列(macroarray)或毫微阵列(nanoarray)。

一旦已经鉴定和分离合适的结合分子(上述的)，技术人员可以使用在分子生物学领域中熟知的方法制造阵列。

或者，本发明的第一方面提供一种方法，其中步骤(b)和/或步骤(d)是通过使用阵列实现的，该阵列包括能够结合一个或更多蛋白的第二结合试剂，该第二结合试剂具有可检测部分。

通常，在第二方面，步骤(ii)和/或步骤(iv)是使用分析完成的，该分析含有能够结合一个或更多蛋白的第二结合试剂，该第二结合试剂具有可检测部分。

结合试剂在上面详细描述了。

在优选的具体实施方式中，第二结合试剂是抗体或其片段，通常是重组抗体或其片段。方便地，抗体或其片段选自scfv、fab、免疫球蛋白分子的结合结构域。抗体在上面详细描述了。

优选地，当使用分析时，本发明提供一种方法，其中可检测部分选自荧光部分、发光部分、化学发光部分、放射性部分、酶的部分。用于本发明方法中的合适的可检测部分的例子在上面描述了。

检测血清或血浆蛋白的优选的分析包括酶联免疫吸附分析(elisa)、放射性免疫分析(ria)、免疫放射测定分析(irma)和免疫酶分析(iema)，包括使用单克隆和/或多克隆抗体的三明治分析。举例的三明治分析由david等人在美国专利号4,376,110和4,486,530中描述，因此引入作为参考。在片子上的细胞抗体染色可以用于在细胞学实验室诊断测试中熟知的，以及本领域技术人员熟知的方法。

通常，分析是elisa(酶联免疫吸附分析)，通常包括使用经常在固相分析中给出颜色反应产物的酶。酶如辣根过氧化物酶和磷酸酶已经被广泛应用。放大磷酸酶反应的方式是使用nadp作为底物而产生nad，nad现在作为第二酶系统的辅酶起作用。来自大肠杆菌的焦磷酸酶提供良好的偶联，因为该酶在组织中不存在，是稳定的并且给出好的反应颜色。可以使用基于酶的，如荧光素酶的化学发光系统。

用维生素生物素偶联是常用的，因为这可以通过其与酶联抗生物素蛋白(avidin)或抗生物素蛋白链菌素(streptavidin)反应容易地检测到，对于抗生物素蛋白或生物素蛋白链菌素，其结合具有大的特异性和亲和力。

在第三具体实施方式中，本发明提供用于测定在个体中胰腺腺癌存在的阵列，其含有本发明的一个或更多结合试剂。优选地，该一个或更多结合试剂能够结合在表1中定义的所有蛋白。

在第四具体实施方式中，本发明提供用于确定被胰腺腺癌困扰个体的存活时间的阵列，其含有根据本发明的一个或更多结合试剂。优选地，该一个或更多结合试剂能够结合在表2中定义的所有蛋白。

在上面讨论了适于在本发明的方法中使用的阵列。在进一步的具体实施方式中，本发明提供在本发明的第一和/或第二方面方法中阵列的应用。

在第五具体实施方式中，本发明提供选自表1中的群组的一个或更多蛋白的应用，其用作测定个体中胰腺腺癌存在的诊断标记。方便地，表1中定义的所有蛋白用作测定个体中胰腺腺癌存在的诊断标记。

在第六具体实施方式中，本发明提供选自表2的群组的一个或更多蛋白的应用，其用作确定被胰腺腺癌困扰个体的存活时间的诊断标记。优选地，在表2中定义的所有蛋白用作确定被胰腺腺癌困扰个体的存活时间的诊断标记。

在第七具体实施方式中，提供一种用于测定胰腺腺癌存在的试剂盒，包括：

a)本发明所述的一个或更多第一结合试剂或阵列；

b)进行本发明第一方面所述方法的说明书。

在第八方面，本发明提供测定胰腺腺癌存在的试剂盒，包括：

a)如本文定义的一个或更多第二结合试剂；

b)进行如本发明第一方面定义的方法的说明书。

在第九方面，提供确定被胰腺腺癌困扰个体的存活时间的试剂盒，包括：

1)如本文定义的一个或更多第一结合试剂；

2)进行本发明第二方面所述方法的说明书。

在本发明的第十方面，提供确定被胰腺腺癌困扰个体的存活时间的试剂盒，包括：

1)如本文定义的一个或更多第二结合试剂；

2)进行如本发明第二方面定义的方法的说明书。

附图说明

图1a至图1d：使用重组抗体微阵列，通过血清蛋白表达分析检测胰腺腺癌。

图1a：含有1280个数据点的扫描抗体微阵列图像；

图1b：作为基于所有129个抗体片段无监督(unsupervised)的sammon图表表现的多维分析，其中显示癌症患者(红)与健康个体(蓝)完全分开；

图1c：树状图，其中癌症患者(pa)与正常个体(n)完全分开；使用由28个血清样品组成的练习组(trainingset)，双向分级簇(hierarchicalclustering)基于在癌症和正常个体中显著性(p<0.05)差异表达的19个血清生物标记。随后，16个血清样品的测试组(用*标记)被100％正确地分类。柱代表供体，其中蓝色是正常个体(n)，红色是癌症患者(pa)。每排代表血清生物标记，如在右手侧注释的，其中每个像素证明在每个供体中特异生物标记的表达水平(在胰腺癌血清对正常血清中，过表达(红色)，低表达(绿色)或无变化(黑色))；

图1d：还通过elisa分析了几个血清生物标记，如il-4、il-5、il-13和mcp-3，证实了微阵列的结果。显示了对il-13的代表性数据组，证明常规的elisa和抗体微阵列分析产生相似的结果。与通过elisa获得的结果相比，微阵列分析的敏感性是等同的或更好(数据未显示)。

图2a至图2d：区分短(<12个月)和长(>24个月)存活者两个患者群的预测性血清蛋白标记标志的鉴定。

图2a：受试者工作曲线(receiveroperatorcurve(roc))面积作为包括在预测标志中的分析物数量的函数，其清晰地证明：可以使用>29分析物的标志很好地区分两个患者群；

图2b：根据29个抗体鉴定的分析物，预测性血清生物标记标志的roc面积；

图2c：用练习组选择的生物标记标志训练svm。使用svm预测值，然后将由10个随机选择患者(样品用*标记)组成的测试组分类；

图2d：基于预测性标志中的22个非冗余(non-redundant)血清蛋白的热图(heatmap)。柱代表癌症患者，蓝色是长(>24个月)存活者，红色是短(<12个月)存活者。颜色代码见图1a至图1d的图例。

图3a至图3b：重组抗体微阵列技术的原理。

具体实施方式

在本说明书中对在先出版文件的列出或讨论不应必要地被认为是承认该文献是本领域的一部分或是公知常识。

优选地，现在将通过参考下列表和图来描述包含本发明某些方面的非限制性实施例：

表1：区分正常和胰腺癌患者的血清蛋白图谱

表2：在胰腺癌患者中区分短期存活者(<12个月)和长期存活者(>24个月)的血清蛋白标志

表3：用于本发明的微阵列针对于60个血清蛋白的129个重组抗体片段

表3(续)

表4：获得血清样品的患者的患者人口统计学

*pc＝胰腺腺癌

实施例

概述

在肿瘤蛋白质组学后面的驱动力是鉴定与特定恶性肿瘤相关的蛋白标志。基于对来源于胰腺腺癌和正常健康供体的未分部的(unfractionated)人类全血清蛋白质组的重组抗体微阵列分析，我们基于22个非冗余分析物鉴定了区别癌症和健康患者的蛋白标志。预测特异性和敏感性分别是99.7和99.9％。另外，定义了由19个蛋白分析物组成的蛋白标志，具有在癌症患者中预测存活者的潜力。这一新型预测标志区分具有<12个月或>24个月存活时间的患者并提示在个体化医学中新的可能性。

本研究描述基于重组抗体微阵列预测性诊断癌症的亲和蛋白质组方法，其使用阵列适应的重组scfv片段(12,13)。该结果证明对免疫调节蛋白特异的抗体片段阵列可以区分来自癌症患者或健康个体的人类血清蛋白质组。我们提出检测胰腺癌以及用于预测患者存活的第一套血清生物标记。

材料和方法

制备和纯化scfv-抗免疫调节中主要涉及的60个不同蛋白的129个人类重组scfv抗体片段选自n-coder文库(13)并由bioinventinternationalab(lund,瑞典)友好提供。因此，每个抗原由多达四个不同的scfv片段识别。所有的scfv抗体是在100ml大肠杆菌培养物中产生的并且使用亲和色谱在ni-nta琼脂糖上(qiagen,hilden,德国)从表达上清中纯化。结合分子用250mm咪唑洗脱，充分对pbs透析，贮存于4℃直到进一步使用。蛋白浓度通过检测在280nm的吸收测定(平均浓度210μg/ml,在60-1090μg/ml范围内)。纯度用10％sds-page(invitrogen,carlsbad,ca,美国)评估。

血清样品-在这个研究中总共包括由斯德哥尔摩南方总医院(瑞典)和lund大学医院(lund，瑞典)提供的44个血清样品。在诊断时从患有胰腺癌的患者中收集24个血清样品(pa1-pa30)。20个血清样品(n1-n20)(无临床症状)是从健康供体中收集的。患者的人口统计在表4中显示。在标准操作过程后，将所有样品分份并且储存于-80℃。

标记血清样品-使用前面优化的血清蛋白质组标记规程标记血清样品(9,14,15)。使用ez-link硫代-nhs-lc-生物素(sulfo-nhs-lc-biotin)(pierce,rockford,il,美国)将所有血清样品生物素化(biotinylated)。50μl血清等份在4℃16.000xg离心20分钟并且在pbs中以1:45稀释，获得浓度约2mg/ml。然后通过在冰上小心地每20分钟震荡混匀加入硫代-nhs-生物素2小时至最终浓度0.6mm将样品生物素化。使用3.5kdamw透析膜(spectrumlaboratories,ranchodominguez,ca,美国)，通过对pbs透析72小时去除未反应的生物素。将样品分份并且储存于-20℃。

酶联免疫吸附分析-使用商业elisa试剂盒(quantikine,r&dsystems,minneapolis,mn,美国)，在所有样品中测定4个蛋白分析物(mcp-3、il-4、il-5和il-13)血清浓度。测定是根据供应商提供的建议进行的。

制造和加工抗体微阵列-为了产生抗体微阵列，我们使用以前优化和验证的装置(9,12,14,15)。简而言之，使用沉积为约330pl/滴的非接触式打印机(biochiparrayer,perkinelmerlife&analyticalsciences)，使用压力(piezo)技术制造scfv微阵列。在每个位置点2滴而排列scfv抗体，在第二滴分配以前，令第一滴干燥。将抗体点在黑色聚合物maxisorb微阵列片上(nunca/s,roskilde,丹麦)，形成每点平均5fmolscfv(在1.5–25fmol范围内)。每个scfv克隆排列八个重复以保证足够的统计学。每片总共打印160个抗体和对照，每片以两列走向，每列有8x80个抗体。为了帮助在定量中网格的排列，每十排点上含有cy5偶联的抗生物素蛋白链菌素(2μg/ml)的一排。使用疏水笔(dakocytomationpen,dakocytomation,glostrup,丹麦)在阵列的周围画上疏水屏障。阵列用在pbs中的500μl5％(w/v)脱脂奶粉(semperab,sundbyberg,瑞典)封闭过夜。所有孵育在室温在湿盒中进行。然后用在pbs中的400μl0.05％tween-20(pbs-t)洗涤阵列4次，并且用350μl生物素化血清孵育1小时，该生物素化血清在pbs中的1％(w/v)脱脂奶粉和1％tween(pbs-mt)中以1:10稀释(形成总的1:450血清稀释)。接下来，用400μlpbs-t洗涤阵列4次并且用在pbs-mt中稀释的350μl的1μg/mlalexa-647偶联的抗生物素蛋白链菌素孵育1小时。最后，用400μlpbs-t洗涤阵列4次，在氮气流下立即干燥并且用共聚焦微阵列扫描仪(scanarrayexpress,perkinelmerlife&analyticalsciences)以5μm的分辨率，使用六种不同的扫描设置扫描。使用scanarrayexpress软件v2.0(perkinelmerlife&analyticalsciences)使用固定的循环方法，定量每个点的强度。减去局部背景并且补偿可能的局部缺陷，自动地排除两个最高和最低的重复值，每个数据点代表剩余4个重复值的平均值。相关系数分别为：分析内的为>0.99，分析间的为>0.96。

数据标准化-仅使用非饱和点进一步分析数据。进行了数据组的“片至片”的标准化，使用半整体标准化法(semi-globalnormalizationapproach)，其概念上相似于为dna微阵列开发的标准化。因此，最初对每个分析物计算变异系数(cv)并且评级。鉴定了在所有样品中显示最低cv-值的15％分析物，其对应21个分析物，并且用于计算“片至片”的标准化因子。标准化因子ni是通过公式ni＝si/μ计算的，其中si是对每个样品的21个分析物的信号强度的总和，μ是对所有样品平均的21个分析物的信号强度的总和。由一个样品产生的每个数据组用标准化因子ni除。为了强度，在分析中使用了log2值。

数据分析-在所有129个分析物的空间中使用欧几里得距离(euclideandistance)完成sammon图。使用线性核(linearkernel)用支持向量机(supportvectormachine)(svm)完成监控的分类(16-18)。将违反制约的代价(costofconstraintsviolation)(在svm中的参数c)固定至1，其是在r函数svm中的缺省值，并且没有试图调准它。选择参数调准的缺少是为了避免过度拟合并且使分类过程更易于理解。在测试样品上的svm的输出是svm决定值，其是与超平面的标记距离。在图1c和图2c中，分成练习组和测试组是随机进行一次，并且从此保持固定。在图2a中，使用去除其一(leave-one-out)的交叉验证(crossvalidation)过程。对于在1和129之间的每个数值k，进行下列过程。对于练习组，，用wilcoxon测试选择所有样品，除了k最高等级的分析物；用那些k分析物训练svm。然后用这个分类器计算去除样品的svm决定值。作为共同的实践，该过程在去除一个的交叉验证中在所有样品中进行。

使用svm决定值构建受试者工作特征(roc)曲线并且发现曲线下的面积。图2a显示roc作为k的函数。图2b显示对于值k＝29的roc曲线。所有统计学在r(19)中完成。

结果

胰腺导管腺癌是具有不良预后的癌症并且辅助作出临床决定的改良诊断工具将显著有利于患者。改良诊断的一种方法是鉴定可以检测癌症和也能预测临床结果的一套生物标记。因此，为了能够鉴定与胰腺癌关联的，具有高敏感性的蛋白标志，我们设计了基于129个重组抗体片段(12,14,15)的第一个大规模微阵列(图1a)，所述抗体片段针对主要是免疫调节性质的60个血清蛋白(表2)。在这个研究中，来自24个胰腺癌患者和20个健康者的标记的血清在抗体微阵列上孵育，使用共聚焦扫描仪随后将其定量。第一，为了测试我们检测癌症的能力，根据所有抗体，将微阵列数据显示在无监督的sammon图上，并且可以明确地区分两个不同群体(图1b)。这指示关于由微阵列分析的血清分析物，在癌症和正常蛋白质组之间存在明确的不同。我们随后用支持向量机(svm)，进行去除一个的交叉验证，并且对每个样品收集决定值。决定值是预测器的输出，具有在阈值以上(以下)预测值的样品被预测是胰腺腺癌(健康)。阈值将敏感性和特异性之间的交换(trade-off)用参数表示并且阙值通常，但不总是，被设置为零。24个胰腺癌样品获得在0.30至1.93间隔的决定值，健康样品则为-1.84至-0.30的间隔。因此，以零的阈值，或在-0.30和0.30之间的任何其它值，在我们的数据组中敏感性和特异性是100％。但是，为了延伸敏感性和特异性至较大的群体，我们首先证实决定值在正常和癌症组中，分别是约正态分布的并且计算了平均值和变量。通过将分类阈值设置在两个均值间的一半并使用正态分布，我们发现99.9％敏感性和99.3％特异性，其指示甚至在较大群体中优异的分类能力。为了例证在正常和癌症群体之间的明确分离，我们随机选择了由18个癌症和10个正常样品组成的练习组。这个癌症和正常血清蛋白质组的练习组定义了生物标记的较小组合，其由在两个样品之间显著不同(p<0.05)的19个非冗余血清蛋白组成。这些区别表达的蛋白随后用于构建28个练习样品和16个剩余样品的树状图，其被用作测试组。如在图1c中可见的，对于练习组和测试组，癌症样品从正常样品中完全分离(100％敏感性和特异性)。

一个有趣的观察是我们从一个患者中不知情地获得三个血清样品(pa14)，该样品是在间隔几个星期的不同时间，但是在患者被诊断为胰腺癌的11-12个月之前抽取的。当用于测试组时，所有的样品依然被正确地分类为癌症(数据未显示)。重要的是，由练习所定义的和用于测试样品分类的蛋白标志对胰腺腺癌是特异的并且与由我们的微阵列装置在其他癌症，如胃(9)和乳腺癌中发现的血清标志不同(手稿在准备中)。一些微阵列数据还通过分析几个血清蛋白通过常规的酶联免疫吸附分析被证实(图1d)。但是，与传统的酶免疫分析比，基于微阵列测定的分析常常更敏感。因此，只有当elisa敏感性足够时，分析物可以被验证，但是我们的微阵列数据然后可以被证实。

当癌症的早期检测具有其功效时，特别是在胰腺癌中，已经建议血清蛋白图谱作为定义标志的方法，除了将癌症和正常分类，还可以与临床参数相关(16)。能够预测预期存活时间将是高度相关的，因为这可以影响指定给每个患者的治疗体制。因此，为了进一步质疑我们的重组抗体微阵列平台，我们比较了分成短存活(<12个月)和长存活(>24个月)的两群癌症患者。首先，使用wilcoxon测试过滤分析物，接着是支持向量机，计算受试者工作特征(roc)曲线下面积，其作为预测性标志中抗体定义的分析物总数的函数(图2a)。这些计算包括所有129个抗体并且因为我们有1-4个抗体/血清分析物，在预测性标志的生物标记大小中存在某些冗余。从这些计算中，明确的是用>0.80的roc面积(auc)可以区分所述两群。要注意的是该曲线还证明由<26分析物组成的蛋白标志提供更可变和更弱的预测器。因此，我们选择了由29个分析物组成的预测器标志用于进一步分析。29个分析物的roc曲线具有0.86的曲线下面积(图2b)。

再有，为了例证该生物标记标志的预测能力，将含有短和长期存活者的胰腺癌患者(n＝23)随机地分为13个患者的练习组和10个患者的测试组。因为具有不能切除疾病患者的平均存活仍然是5-6个月，群体大小有不可避免的偏差，并且长期存活者群只由5个患者组成。svm用生物标记标志训练，所述生物标记标志是通过练习组选择的，然后可以将测试组分类，如图2c显示。使用<0的svm预测值，将存活<12个月的所有患者正确分类，其被认为是最重要的分类。一个长期存活者被错误地分类。在wilcoxon测试中在所有23个患者中，分开长和短期存活者的29个最重要分析物对应于22个非冗余血清蛋白(29个分析物中的7个是重复的，但是由不同的抗体克隆定义)。由22个非冗余蛋白代表的这个新型预测器标志，和通过短和长存活者显示的不同分析物反应，分别作为热图显示在图2d中。当分析单个蛋白时，在血清蛋白中没有严格的一致形式，虽然明确的是细胞因子如il-1a、il-3、il-8和il-11在短期存活者中是上调的，而rantes、il-16、il-4和嗜酸细胞活化趋化因子在长期存活者中是最上调的(图2d)。该结果的重要性仍然需要证实，但是其可能指示在后一群体中的更活跃的t-细胞区室(compartment)。

讨论

抗体微阵列，作为亲和蛋白质组中的工具，在过去的几年中已经从有前途的工具进化至在肿瘤蛋白质组学中开始产生有希望结果的方法(3,12,20,21)。这些努力的主要焦点是检测出在早期的癌症，预测肿瘤复发和治疗抗性，或为特定治疗体制选择患者(3)。这对具有不良预后的癌症是特别重要的，其还对胰腺癌是内在的因为胰腺癌迅速迁移至，例如淋巴结、肺、腹膜(4,23)，并且在早期是难以诊断的。但是迄今难以获得生物标记标志在不同癌症之间或在癌症和炎症之间区分的能力(综述见参考文献3)(20)。在该研究中观察到的癌症和正常血清蛋白质组之间的区别的原因最可能是取决于微阵列上抗体特异性的范围，其最近还由理性设计的阵列所支持，该文献由sanchez-carbayo等人报道(21)。使用抗差别表达的基因产物产生的抗体，基于患者总的存活时间，这些研究者可以将具有膀胱肿瘤的患者分类。在过去几年中，通过评估和优化关键技术参数(24)，如探针和底物设计(13,25)，阵列/分析设计(9,15)和样品形式(9,14,15)，我们开发了用于复杂蛋白质组分析的高效重组抗体微阵列平台(6,9,11,12,14,15)。使用主要靶向免疫调节蛋白的优化的scfv微阵列，这允许我们完成人类血浆蛋白质组的第一个差异蛋白表达图谱。与在前结果一致，该抗体微阵列显示出pm至fm范围内的敏感性，容易地检测低丰度细胞因子。另外，我们保持了分析的可重复性，具有在0.96–0.99范围内的相关系数，其是多重分析的关键特征并且其可以很好地与在前报告相比(12,16)。另外，抗体微阵列数据可以与elisa相比，并且当敏感性足够时，该常规分析确证我们的结果。

有胰腺癌的患者经常被晚诊断，造成不良的预后。由于低发生率，难以收集大量样品数，特别是对长期，即>24个月的存活者。我们为了这项研究已经接近25个患者，该研究其使用严格统计学评估，还允许我们将癌症和正常蛋白质组分类。这是监督的分类并且，虽然我们用未实验的贝叶斯(naivebayesian)分类器对该数据组获得非常相似的结果，我们应用了支持向量机作为分类器(数据未显示)。通过在所有分析物的空间中找到超平面，svm分开两组，将在超平面一侧的样品分配至一组并且将另一侧的样品分配至另一组。至超平面的距离称作预测或决定值(图2c)。通过使用我们的练习组，发现超平面并因此组的分类。通过随后使用测试组然后估计分类器的表现，其中在练习和测试组之间不允许有重叠。但是，数据组可以随机地被分成不同的练习和测试组，然后将其分别用于练习和测试分类器。该方法的缺点是最终结果依赖分成练习和测试组。因此，我们使用交叉验证作为制造我们数据组几个分割的程序并且使用测试组的平均表现作为数据分类准确性的量度。因此，在进行的去除一个的交叉验证中，测试组含有一个样品，练习组含有其它样品。svm的表现可以通过roc曲线特别是roc曲线下面积测定。正常和胰腺腺癌样品明显地被很好分离，因为svm用两组之间的空隙正确地将所有样品分类。决定值的外推法产生非常高的敏感性(99.9％)和特异性(99.3％)，显示需要用成百的样品才能得到一个错误的分类。

在该研究中，我们不能用具有胰腺炎的患者群比较胰腺癌，其本来可以是一个想要的比较，但是我们改为使用正常血清样品。需注意的是，但是，与现在胰腺癌相关的生物标记标志只有嗜酸细胞活化趋化因子、il-5和il-13，与作为细菌感染的结果而发现的、与另一种胃肠癌相关的14个生物标记相同(12)，这指示胰腺标志与一般炎症不相关。另外，该标志与在系统性红斑狼疮中发现的生物标记不相似，系统性红斑狼疮是有严重炎性成分的自身免疫紊乱(wingren等人，手稿在准备中)。当使用基于单克隆和多克隆抗体的微阵列，绘制胰腺癌血清样品的图谱时，该标志还与orchekowski等人报道的完全不同(26)。它们靶向高丰度血清蛋白，如白蛋白、转铁蛋白和血红蛋白以及更常见的炎症标记，如c-反应蛋白(crp)、血清淀粉状蛋白a和免疫球蛋白，而只分析了八个细胞因子。在另一方面，我们现在的癌症标志含有许多过表达th2细胞因子(il-4、-5、-10和-13)，而经典的th1细胞因子(il-12和tnf-b)被下调，这还与belone等人的研究一致，belone等人显示tgf-b和il-10在胰腺癌血清中被上调(27)。这些作者还显示来自胰腺癌患者的血液来源的单核细胞主要进行th2样反应而不是th1样反应，具有增加的il-4表达和降低的il-12表达。

最后，我们研究了鉴定除了能够将癌症和正常样品分类，还可以用于预测患者存活的标志的可能性。开始，使用所有的分析物，svm可以以0.81的roc面积将短和长存活者分类(结果未显示)，其是非常有前景的。然后通过选择最重要的分析物，对生物标记的每个数制作分类器，其随后被用于在练习组中区分两个样品组。如图2a中所见，分类器的表现在26个分析物以上是稳定的，并且我们可以证明29个生物标记(22个非冗余分析物)标志产生0.86的roc。但是具有18个以上短存活者和5个以上长存活者的研究需要坚实地建立存活者分类蛋白图谱，但是该研究确实建立了这种图谱的可能性。

总之，使用抗免疫调节蛋白的重组抗体微阵列，我们已经能够特异地检测胰腺腺癌并完全区分癌症和正常血清蛋白质组。更重要的是，提出了定义能够预测癌症患者存活的标志的第一个尝试，指示用于作出临床决定的亲和肿瘤蛋白质组的功效。

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