一种测定赛柠檬石榴皮中五种类黄酮的方法与流程

本发明主要涉及植物有效成份的提取、纯化和含量测定的技术领域，具体地说，本发明涉及一种赛柠檬石榴皮中类黄酮检测的技术领域。

背景技术：

石榴是新疆特色水果之一，石榴果实具有极高的营养价值和药用价值，含有丰富的碳水化合物、粗纤维、灰分元素，其中vc含量高达11mg/100g，远远高于苹果和梨，同时石榴具有良好的抗氧化、调节血脂、消食化积、预防动脉粥样硬化、预防癌症、抗衰老、降血脂、延缓食品发生氧化、增强食欲和益寿延年等功效。石榴的这些药用价值主要功效因子是黄酮类化合物，黄酮类化合物对人体有多种生理功能且不良反应少，是一类安全可靠、成本低、来源广的营养物质，有较大的开发和应用前景。但石榴可食部分只占鲜石榴的40％，而赛柠檬石榴皮占石榴总重超过30％，所以将石榴副产物赛柠檬石榴皮开发再利用，具有重大的现实意义。

类黄酮又称黄酮类化合物，是植物中提取出可食用小分子量多酚物质的一类总称，结构以c6-c3-c6为母体，广泛存在于水果、蔬菜、坚果、种子和茎皮中，是植物体内最重要的次生代谢产物之一，也是人类膳食不可缺少的组成部分，研究表明，类黄酮具有抑制癌细胞、抑制肿瘤、抗氧化、抗炎、预防动脉粥样硬化、抗病毒、抗菌等多种生理活性，是目前植物化学研究的热点成分之一。

石榴新品种赛柠檬，是由新疆农科院园艺所与和田地区策勒县林业站于1999年对策勒县石榴资源调查优选而成，于2002年12月通过新疆维吾尔自治区农作物品种登记委员会审定命名。该品种的主要特点是高产、优质、抗逆性强，结果早，综合园艺形状好，适应范围较广，适宜于塔里木盆地南疆的生态条件，可在和田和喀什地区栽培，由于该品种品质好的特点，极具开发价值。

虽然石榴中的类黄酮研究开展较早，但已往对类黄酮研究主要集中在定性和总量测定方面，且都大量集中在石榴汁、石榴花、石榴叶方面。目前的类黄酮检测方法对赛柠檬石榴皮中单种类黄酮的检测受类黄酮纯度影响较大、检测准确度和精确度较低，检测时间较长，利用高效液相色谱法测定赛柠檬石榴皮中芦丁、槲皮素、槲皮苷、山奈酚和异鼠李素这5种类黄酮含量的研究尚未见相关报道。

技术实现要素：

针对目前类黄酮检测方法对赛柠檬石榴皮中单种类黄酮的检测受类黄酮纯度影响较大、检测准确度和精确度较低，检测时间较长，利用高效液相色谱法测定赛柠檬石榴皮中芦丁、槲皮素、槲皮苷、山奈酚和异鼠李素这5种类黄酮含量的研究尚未见相关报道的技术问题，本发明旨在于提供一种测定赛柠檬石榴皮中五种类黄酮的方法，提取过程确保了赛柠檬石榴皮提取的类黄酮得率，有效保证赛柠檬石榴皮提取的类黄酮纯度，经纯化和利用高效液相色谱法测定赛柠檬石榴皮中芦丁、槲皮素、槲皮苷、山奈酚和异鼠李素这5种类黄酮含量，与标准品保留时间对比，得出一致色谱图，通过计算分离度r>>1.5，杂质无干扰，分离效果好，检测时间短，在21min内出峰完全，且方法可行性高，在相应的线性范围内，各类线性关系好，决定系数均达0.999以上，相对标准差(rsd)分别为1.239％，1.428％，1.937％，1.677％，1.461％，回收率分别为95.7％，104.6％，101.1％，101.5％，127.9％，精密度rsd均小于3％，重复性和稳定性rsd均小于2％，可行性高，对赛柠檬石榴副产物的进一步开发提供有效的检测手段，在植物深加工领域具有广泛的实用性和开发价值。

本发明通过以下技术方案实现的:

本发明具体提供一种测定赛柠檬石榴皮中5种类黄酮物质的方法，具体采用以下技术步骤：

(1)黄酮类化合物的提取：将赛柠檬石榴皮洗净，50℃-60℃下用鼓风干燥箱干燥至含水量小于8％，粉碎，过60目-100目筛；称取1.000g赛柠檬石榴皮粉末置于250ml锥形瓶中，加24ml87％乙醇，56℃-62℃超声30min-45min，超声功率120w-150w，抽滤，溶解滤饼，再用24ml87％乙醇溶解超声30min-45min，合并两次滤液，减压回收溶剂至干，加30％乙醇溶解，用石油醚萃取除去脂溶性色素，弃去醚层，用石油醚萃取2次，再用30％乙醇定容至50ml容量瓶，作为提取液备用。

(2)纯化：将提取液与d101大孔吸附树脂以1：1-1：10的料液比g/ml、纯化温度为20℃-50℃，上柱ph值为1.0-5.0的条件下纯化，用蒸馏水洗脱除杂后，用甲醇洗脱出黄酮类化合物，收集洗脱液，置于4℃冰箱保存备用。

(3)hplc色谱条件测定：

标准曲线的绘制：准确秤取芦丁1.5mg、槲皮苷0.6mg、槲皮素4mg、山奈酚1.6mg、异鼠李素3mg；分别加入3ml、1.2ml、8ml、3.2ml、6ml甲醇溶解得到浓度为0.5mg/ml的标准混合液，准确吸取标准溶液，配制成不同质量浓度的溶液，其中芦丁标准溶液的浓度梯度为0.001mg/ml、0.002mg/ml、0.0025mg/ml、0.006mg/ml、0.015mg/ml、0.02mg/ml，槲皮苷标准溶液的浓度梯度为0.001mg/ml、0.002mg/ml、0.003mg/ml、0.004mg/ml、0.008mg/ml、0.012mg/ml、0.016mg/ml，槲皮素标准溶液的浓度梯度为0.001mg/ml、0.005mg/ml、0.01mg/ml、0.015mg/ml、0.02mg/ml、0.025mg/ml、0.03mg/ml，山奈酚标准溶液的浓度梯度为0.001mg/ml、0.002mg/ml、0.003mg/ml、0.004mg/ml、0.008mg/ml、0.012mg/ml、0.016mg/ml，异鼠李素标准溶液的浓度梯度为0.001mg/ml、0.002mg/ml、0.003mg/ml、0.004mg/ml、0.008mg/ml、0.012mg/ml、0.016mg/ml，每次吸样量为20μl，经过高效液相色谱检测，以峰面积为横坐标，质量浓度为纵坐标，绘制标准曲线。

黄酮类化合物含量的测定：将步骤(2)纯化后提取液过0.22μm有机膜，进样量20μl，用高效液相色谱仪检测，色谱柱采用c18柱，流动相为甲醇和甲酸，其比例范围为40：60-60：40，甲醇的浓度为98％-100％，甲酸的浓度为0.2％-2％；流动相经0.45μm滤膜过滤，并经超声波脱气，流速：0.5ml/min-1.0ml/min，进样量20μl，柱温30℃-40℃，运行5min，紫外检测器检测波长采用280mm或320mm或360mm，将色谱图积分后记录峰面积，利用各自标准曲线方程计算芦丁、槲皮苷、槲皮素、山奈酚、异鼠李素的质量浓度。

优选的，本发明提供的纯化步骤中料液比g/ml为1：2-1：10。

优选的，本发明提供的纯化步骤中上柱ph值为2.0-4.0。

优选的，本发明提供的纯化步骤中纯化温度为25℃-45℃。

优选的，本发明提供的纯化步骤中料液比g/ml为1：5，上柱ph值为4.0，纯化温度为30℃。

优选的，本发明提供的黄酮类化合物的提取步骤中超声温度为59℃，超声时间37.5min，超声功率135w。

通过实施本发明的技术方案，可以达到以下有益效果:

本发明提供的一种测定赛柠檬石榴皮中五种类黄酮的方法，提取过程确保了赛柠檬石榴皮提取的类黄酮得率，有效保证赛柠檬石榴皮提取的类黄酮纯度，经纯化和利用高效液相色谱法测定赛柠檬石榴皮中芦丁、槲皮素、槲皮苷、山奈酚和异鼠李素这5种类黄酮含量，与标准品保留时间对比，得出一致色谱图，通过计算分离度r>>1.5，杂质无干扰，分离效果好，检测时间短，在21min内出峰完全，且方法可行性高，在相应的线性范围内，各类线性关系好，决定系数均达0.999以上，相对标准差(rsd)分别为1.239％，1.428％，1.937％，1.677％，1.461％，回收率分别为95.7％，104.6％，101.1％，101.5％，127.9％，精密度rsd均小于3％，重复性和稳定性rsd均小于2％，可行性高，对赛柠檬石榴副产物的进一步开发提供有效的检测手段，在植物深加工领域具有广泛的实用性和开发价值。

附图说明

图1显示为本发明提供的5种类黄酮标准品hplc色谱图。

图2显示为本发明提供的芦丁标准曲线方程。

图3显示为本发明提供的槲皮素标准曲线方程。

图4显示为本发明提供的槲皮苷标准曲线方程。

图5显示为本发明提供的山奈酚标准曲线方程。

图6显示为本发明提供的异鼠李素标准曲线方程。

图7显示为本发明提供的5种类黄酮样品hplc色谱图。

图8显示为本发明提供的柱液的ph值对树脂静态吸附量的影响图。

图9显示为本发明提供的料液比对d-101大孔吸附树脂吸附能力的影响图。

图10显示为本发明提供的温度树脂静态吸附量的影响图。

具体实施方式

下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例，本发明中，未经说明的％为体积百分比。

本发明采用的赛柠檬石榴采集于新疆喀什市，采集时间为2015年10月，将样品洗净后取皮，剔除褐变及腐烂部分果皮，置于40℃恒温干燥箱内烘干，用研磨机粉碎，过100目筛，置于干燥器中避光保存备用。芦丁、槲皮素、槲皮苷、山奈酚、异鼠李素(纯度≥98％)，所有标准品为hplc级，购买自北京世纪奥科生物技术有限公司。d101大孔吸附树脂，甲醇(色谱纯)；甲酸(色谱纯)，购买自sigma公司。

本发明采用的设备有高效液相色谱仪：agilent1260，包括在线脱气机，四元泵，自动进样器，柱温箱，紫外检测器，色谱工作站：色谱柱agilentporoshell120ec-c18柱(250mm×4.6mm，4μm)、旋转蒸发仪(re1100-pro，scilogex)、恒温电热油浴锅(df-101s,金坛市医疗仪器厂)、磁力搅拌机(rctbasic,ika)、超声波清洗机(sk7200h，上海科导超声仪器有限公司)、研磨粉碎机(a11basic，ika)、均质机(t10，ika)、万分之一电子分析天平(ml204,mettlertdedo)、离心机(lxt-ⅱb,上海安亭科学仪器厂)、干燥箱(dzf-6050，上海一恒科学仪器有限公司)、搅拌机(hr1724，philips)、循环水式多用真空泵(shb-ⅲ，郑州长城科工贸有限公司)、纯水仪(akhl-ⅲ-24a，艾柯实验室超纯水仪)。

本发明中选用的所有材料、试剂和仪器都为本领域熟知的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。

实施例一：测定赛柠檬石榴皮中5种类黄酮物质的方法

本发明具体提供一种测定赛柠檬石榴皮中5种类黄酮物质的方法，具体采用以下技术步骤：

(1)黄酮类化合物的提取：将赛柠檬石榴皮洗净，50℃-60℃下用鼓风干燥箱干燥至含水量小于8％，粉碎，过60目-100目筛；称取1.000g赛柠檬石榴皮粉末置于250ml锥形瓶中，加24ml87％乙醇，56℃-62℃超声30min-45min，超声功率120w-150w，抽滤，溶解滤饼，再用24ml87％乙醇溶解超声30min-45min，合并两次滤液，减压回收溶剂至干，加30％乙醇溶解，用石油醚萃取除去脂溶性色素，弃去醚层，用石油醚萃取2次，再用30％乙醇定容至50ml容量瓶，作为提取液备用。

(2)纯化：将提取液与d101大孔吸附树脂以1：1-1：10的料液比g/ml、纯化温度为20℃-50℃，上柱ph值为1.0-5.0的条件下纯化，用蒸馏水洗脱除杂后，用甲醇洗脱出黄酮类化合物，收集洗脱液，置于4℃冰箱保存备用。

(3)hplc色谱条件测定：

标准曲线的绘制：准确秤取芦丁1.5mg、槲皮苷0.6mg、槲皮素4mg、山奈酚1.6mg、异鼠李素3mg；分别加入3ml、1.2ml、8ml、3.2ml、6ml甲醇溶解得到浓度为0.5mg/ml的标准混合液，准确吸取标准溶液，配制成不同质量浓度的溶液，其中芦丁标准溶液的浓度梯度为0.001mg/ml、0.002mg/ml、0.0025mg/ml、0.006mg/ml、0.015mg/ml、0.02mg/ml，槲皮苷标准溶液的浓度梯度为0.001mg/ml、0.002mg/ml、0.003mg/ml、0.004mg/ml、0.008mg/ml、0.012mg/ml、0.016mg/ml，槲皮素标准溶液的浓度梯度为0.001mg/ml、0.005mg/ml、0.01mg/ml、0.015mg/ml、0.02mg/ml、0.025mg/ml、0.03mg/ml，山奈酚标准溶液的浓度梯度为0.001mg/ml、0.002mg/ml、0.003mg/ml、0.004mg/ml、0.008mg/ml、0.012mg/ml、0.016mg/ml，异鼠李素标准溶液的浓度梯度为0.001mg/ml、0.002mg/ml、0.003mg/ml、0.004mg/ml、0.008mg/ml、0.012mg/ml、0.016mg/ml，每次吸样量为20μl，经过高效液相色谱检测，以峰面积为横坐标，质量浓度为纵坐标，绘制标准曲线。

黄酮类化合物含量的测定：将步骤(2)纯化后提取液过0.22μm有机膜，进样量20μl，用高效液相色谱仪检测，色谱柱采用c18柱，流动相为甲醇和甲酸，其比例范围为40：60-60：40，甲醇的浓度为98％-100％，甲酸的浓度为0.2％-2％；流动相经0.45μm滤膜过滤，并经超声波脱气，流速：0.5ml/min-1.0ml/min，进样量20μl，柱温30℃-40℃，运行5min，紫外检测器检测波长采用280mm或320mm或360mm，将色谱图积分后记录峰面积，利用各自标准曲线方程计算芦丁、槲皮苷、槲皮素、山奈酚、异鼠李素的质量浓度。

实施例二：测定赛柠檬石榴皮中5种类黄酮物质的方法

将赛柠檬石榴皮洗净，50℃下用鼓风干燥箱干燥至含水量小于8％，粉碎，过60目筛；称取1.000g赛柠檬石榴皮粉末置于250ml锥形瓶中，加24ml87％乙醇，56℃超声30min，超声功率120w,抽滤，溶解滤饼，再用24ml87％乙醇溶解超声30min，合并两次滤液，减压回收溶剂至干，加30％乙醇溶解，用石油醚萃取除去脂溶性色素，弃去醚层，用石油醚萃取2次，再用30％乙醇定容至50ml容量瓶，作为提取液；将提取液与d101大孔吸附树脂以1：1的料液比g/ml、纯化温度为20℃，上柱ph值为1.0的条件下纯化，用蒸馏水洗脱除杂后，用甲醇洗脱出黄酮类化合物，收集洗脱液，置于4℃冰箱保存备用，按照实施例一提供的方法绘制5种类黄酮标准曲线，将纯化后提取液过0.22μm有机膜，进样量20μl，用高效液相色谱仪检测，色谱柱采用c18柱，流动相为甲醇和甲酸，其比例范围为40：60，甲醇的浓度为98％，甲酸的浓度为0.2％；流动相经0.45μm滤膜过滤，并经超声波脱气，流速：0.5ml/min，进样量20μl，柱温30℃，运行5min，紫外检测器检测波长采用280mm，将色谱图积分后记录峰面积，利用各自标准曲线方程计算芦丁、槲皮苷、槲皮素、山奈酚、异鼠李素的质量浓度。

实施例三：测定赛柠檬石榴皮中5种类黄酮物质的方法

将赛柠檬石榴皮洗净，60℃下用鼓风干燥箱干燥至含水量小于8％，粉碎，过100目筛；称取1.000g赛柠檬石榴皮粉末置于250ml锥形瓶中，加24ml87％乙醇，62℃超声45min，超声功率150w，抽滤，溶解滤饼，再用24ml87％乙醇溶解超声45min，合并两次滤液，减压回收溶剂至干，加30％乙醇溶解，用石油醚萃取除去脂溶性色素，弃去醚层，用石油醚萃取2次，再用30％乙醇定容至50ml容量瓶，作为提取液；将提取液与d101大孔吸附树脂以1：10的料液比g/ml、纯化温度为50℃，上柱ph值为5.0的条件下纯化，用蒸馏水洗脱除杂后，用甲醇洗脱出黄酮类化合物，收集洗脱液，置于4℃冰箱保存备用，按照实施例一提供的方法绘制5种类黄酮标准曲线，将纯化后提取液过0.22μm有机膜，进样量20μl，用高效液相色谱仪检测，色谱柱采用c18柱，流动相为甲醇和甲酸，其比例范围为60：40，甲醇的浓度为100％，甲酸的浓度为2％；流动相经0.45μm滤膜过滤，并经超声波脱气，流速：1.0ml/min，进样量20μl，柱温40℃，运行5min，紫外检测器检测波长采用360mm，将色谱图积分后记录峰面积，利用各自标准曲线方程计算芦丁、槲皮苷、槲皮素、山奈酚、异鼠李素的质量浓度。

实施例四：测定赛柠檬石榴皮中5种类黄酮物质的方法

将赛柠檬石榴皮洗净，58℃下用鼓风干燥箱干燥至含水量小于8％，粉碎，过90目筛；称取1.000g赛柠檬石榴皮粉末置于250ml锥形瓶中，加24ml87％乙醇，57℃超声35min，超声功率130w，抽滤，溶解滤饼，再用24ml87％乙醇溶解超声41min，合并两次滤液，减压回收溶剂至干，加30％乙醇溶解，用石油醚萃取除去脂溶性色素，弃去醚层，用石油醚萃取2次，再用30％乙醇定容至50ml容量瓶，作为提取液；将提取液与d101大孔吸附树脂以1：2的料液比g/ml、纯化温度为25℃，上柱ph值为2.0的条件下纯化，用蒸馏水洗脱除杂后，用甲醇洗脱出黄酮类化合物，收集洗脱液，置于4℃冰箱保存备用，按照实施例一提供的方法绘制5种类黄酮标准曲线，将纯化后提取液过0.22μm有机膜，进样量20μl，用高效液相色谱仪检测，色谱柱采用c18柱，流动相为甲醇和甲酸，其比例范围为50：60，甲醇的浓度为100％，甲酸的浓度为1.8％；流动相经0.45μm滤膜过滤，并经超声波脱气，流速：0.7ml/min，进样量20μl，柱温35℃，运行5min，紫外检测器检测波长采用320mm，将色谱图积分后记录峰面积，利用各自标准曲线方程计算芦丁、槲皮苷、槲皮素、山奈酚、异鼠李素的质量浓度。

实施例五：测定赛柠檬石榴皮中5种类黄酮物质的方法

将赛柠檬石榴皮洗净，55℃下用鼓风干燥箱干燥至含水量小于8％，粉碎，过80目筛；称取1.000g赛柠檬石榴皮粉末置于250ml锥形瓶中，加24ml87％乙醇，61℃超声42min，超声功率140w，抽滤，溶解滤饼，再用24ml87％乙醇溶解超声32min，合并两次滤液，减压回收溶剂至干，加30％乙醇溶解，用石油醚萃取除去脂溶性色素，弃去醚层，用石油醚萃取2次，再用30％乙醇定容至50ml容量瓶，作为提取液；将提取液与d101大孔吸附树脂以1：5的料液比g/ml、纯化温度为45℃，上柱ph值为4.0的条件下纯化，用蒸馏水洗脱除杂后，用甲醇洗脱出黄酮类化合物，收集洗脱液，置于4℃冰箱保存备用，按照实施例一提供的方法绘制5种类黄酮标准曲线，将纯化后提取液过0.22μm有机膜，进样量20μl，用高效液相色谱仪检测，色谱柱采用c18柱，流动相为甲醇和甲酸，其比例范围为70：60，甲醇的浓度为98％，甲酸的浓度为1.2％；流动相经0.45μm滤膜过滤，并经超声波脱气，流速：0.9ml/min，进样量20μl，柱温32℃，运行5min，紫外检测器检测波长采用360mm，将色谱图积分后记录峰面积，利用各自标准曲线方程计算芦丁、槲皮苷、槲皮素、山奈酚、异鼠李素的质量浓度。

实施例六：测定赛柠檬石榴皮中5种类黄酮物质的方法

将赛柠檬石榴皮洗净，52℃下用鼓风干燥箱干燥至含水量小于8％，粉碎，过70目筛；称取1.000g赛柠檬石榴皮粉末置于250ml锥形瓶中，加24ml87％乙醇，59℃超声40min，超声功率135w，抽滤，溶解滤饼，再用24ml87％乙醇溶解超声37min，合并两次滤液，减压回收溶剂至干，加30％乙醇溶解，用石油醚萃取除去脂溶性色素，弃去醚层，用石油醚萃取2次，再用30％乙醇定容至50ml容量瓶，作为提取液；将提取液与d101大孔吸附树脂以1：7的料液比g/ml、纯化温度为35℃，上柱ph值为3.0的条件下纯化，用蒸馏水洗脱除杂后，用甲醇洗脱出黄酮类化合物，收集洗脱液，置于4℃冰箱保存备用，按照实施例一提供的方法绘制5种类黄酮标准曲线，将纯化后提取液过0.22μm有机膜，进样量20μl，用高效液相色谱仪检测，色谱柱采用c18柱，流动相为甲醇和甲酸，其比例范围为50：40，甲醇的浓度为98％，甲酸的浓度为0.8％；流动相经0.45μm滤膜过滤，并经超声波脱气，流速：0.6ml/min，进样量20μl，柱温38℃，运行5min，紫外检测器检测波长采用280mm，将色谱图积分后记录峰面积，利用各自标准曲线方程计算芦丁、槲皮苷、槲皮素、山奈酚、异鼠李素的质量浓度。

实施例七：5种类黄酮物质标准曲线绘制

附图1为5种类黄酮标准品hplc色谱图。准确秤取芦丁1.5mg、槲皮苷0.6mg、槲皮素4mg、山奈酚1.6mg、异鼠李素3mg；分别加入3ml、1.2ml、8ml、3.2ml、6ml甲醇溶解得到浓度为0.5mg/ml的标准混合液。准确吸取标准溶液，配制成不同质量浓度的溶液(0.05mg/ml、0.04mg/ml、0.03mg/ml、0.02mg/ml、0.01mg/ml)每次吸样量为20μl，按照上述色谱条件进行测定。以峰面积为横坐标，质量浓度为纵坐标，绘制标准曲线，分别依次参见附图2、3、4、5、6。

由附图2得到芦丁标准曲线为：y＝2.83870*10-9x-0.000151643相关系数0.9990。

由附图3得到槲皮苷标准曲线为：y＝3.313960*10-9x-0.000141678相关系数0.9991。

由附图4得到槲皮素标准曲线为：y＝2.127470*10-9x+0.000352118相关系数0.9991。

由附图5得到山奈酚标准曲线为：y＝1.310520*10-9x+0.000220729相关系数0.9994。

由附图6得到异鼠李素标准曲线为：y＝2.404460*10-9x+0.000121731相关系数0.9997。

表明对芦丁、槲皮苷、槲皮素、山奈酚、异鼠李素在一定浓度范围内，色谱峰面积与样品量成线性关系。附图7为5种类黄酮样品hplc色谱图。采用样品加标回收，准确称取5种类黄酮含量已知的赛柠檬石榴皮粉末、6份，分别向其中定量添加混合标准溶液，按色谱条件进样20μl，根据测定结果中5种单体黄酮的含量计算相应的回收率，结果为未加标样品浓度分别为：0.0032mg/ml，0.0294mg/ml，0.0004mg/ml，0.0002mg/ml，0.0001mg/ml；加标量浓度为：0.0075mg/ml，0.0025mg/ml，0.004mg/ml，0.004mg/ml，0.004mg/ml；加标后样品浓度分别为：0.0096mg/ml，0.1065mg/ml，0.0046mg/ml，0.0034mg/ml，0.0.37mg/ml。使用以下公式对加标回收率进行计算：加标回收率＝(加标试样测定值-试样测定值)÷加标量×100％；加标回收率为：95.7％，104.6％，101.1％，101.5％，127.9％，分离度r>>1.5(r＝2(tr2-tr1)/(y1+y2)，其中，tr表示保留时间，y表示峰宽)，精密度对应rsd为1.25％，1.19％，1.80％，0.82％，0.19％，重复性对应rsd为0.99％，1.20％，0.87％，1.86％，1.32％，稳定性对应rsd为0.45％，0.63％，1.23％，1.02％，1.34％。

实施例八：测定赛柠檬石榴皮中5种类黄酮物质的方法的优化

分别采用如下不同的方案测定赛柠檬石榴皮中5种类黄酮物质：

方案1：超声温度56℃，超声时间30min，超声功率120w，料液比1:1，g/ml，纯化温度20℃，上柱ph值1.0。

方案2：超声温度62℃，超声时间45min，超声功率150w，料液比1:10，g/ml，纯化温度50℃，上柱ph值5.0。

方案3：超声温度57℃，超声时间35min，超声功率130w，料液比1:2，g/ml，纯化温度25℃，上柱ph值2.0。

方案4：超声温度61℃，超声时间42min，超声功率140w，料液比1:5，g/ml，纯化温度45℃，上柱ph值4.0。

方案5：超声温度59℃，超声时间40min，超声功率135w，料液比1:7，g/ml，纯化温度35℃，上柱ph值3.0。

将上述提供的五个不同方案分别按照实施例一提供的方法测定赛柠檬石榴皮中5种类黄酮物质：

1.正交优化赛柠檬石榴皮中5种类黄酮物质测定方法

设计单因素实验，分别探究a：超声温度、b：超声时间和c：超声功率对赛柠檬石榴皮中黄酮类化合物提取率的影响。在单因素实验的基础上进行三因素三水平正交实验，正交试验因素与水平见表1。

表1：正交试验因素与水平表

正交优化赛柠檬石榴皮中5种类黄酮物质测定方法试验结果及分析见表2。

表2：正交试验结果及分析

通过比较各指标的极差，各影响因素主次顺序为，即为赛柠檬石榴皮中5种类黄酮物质测定方法主要影响因素是超声温度，其次是超声时间和超声功率，根据表2中各指标的k1、k2和k3值及趋势图的结果，确定各因素最佳水平组合为，即赛柠檬石榴皮中5种类黄酮物质测定方法为：超声温度56℃-62℃，超声时间30min-45min,超声功率120w-150w；优选的，超声温度59℃，超声时间37.5min,超声功率135w。

2.提取物纯化的影响因素优选：

1)柱液的ph值对树脂静态吸附量的影响

分别取100ml浓度为2g/l的黄酮溶液，调节不同ph值，加入5g预处理好的湿树脂，静态吸附10h，测定树脂静态吸附量，考察不同ph值对类黄酮溶液的影响，参考说明书附图8，结果表明ph值为4.0最佳。

2)料液比对d-101大孔吸附树脂吸附能力的影响

定量称取处理过的干树脂2.00g，装入6只100ml具塞锥形瓶中，按吸附料液比为1:2，1:5，1:10，1:15，1:20，1:25(黄酮类物质溶液：大孔吸附树脂，mg/l)依次加入黄酮类物质(ph值为实验验证最佳值)，恒温振荡(30℃，转速为150r/min)24h，过滤去滤液，测出滤液中黄酮类物质的含量，计算吸附率，参考说明书附图9，比较得到最佳料液比为1：5最佳。

3)温度对树脂静态吸附量的影响

取2g/l的黄酮标准溶液各100ml，加入5g已预处理好的湿树脂，控制温度为25℃，30℃，35℃，40℃，45℃，50℃，静态吸附(摇床振荡)10h，测定树脂静态吸附量，考察温度对类黄酮溶液的影响，参考说明书附图10，结果表明温度为30℃最佳。

综上所述本发明提供的一种测定赛柠檬石榴皮中五种类黄酮的方法，提取过程确保了赛柠檬石榴皮提取的类黄酮得率，有效保证赛柠檬石榴皮提取的类黄酮纯度，经纯化和利用高效液相色谱法测定赛柠檬石榴皮中芦丁、槲皮素、槲皮苷、山奈酚和异鼠李素这5种类黄酮含量，与标准品保留时间对比，得出一致色谱图，通过计算分离度r>>1.5，杂质无干扰，分离效果好，检测时间短，在21min内出峰完全，且方法可行性高，在相应的线性范围内，各类线性关系好，决定系数均达0.999以上，相对标准差(rsd)分别为1.239％，1.428％，1.937％，1.677％，1.461％，回收率分别为95.7％，104.6％，101.1％，101.5％，127.9％，精密度rsd均小于3％，重复性和稳定性rsd均小于2％，可行性高，对赛柠檬石榴副产物的进一步开发提供有效的检测手段，在植物深加工领域具有广泛的实用性和开发价值。

如上所述，即可较好地实现本发明,上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。