一种微生物体内超氧阴离子自由基的测定方法与流程

本发明涉及一种微生物体内超氧阴离子自由基的测定方法，属于废水、废气的生物净化处理技术领域。

背景技术：

超氧阴离子自由基(o2^-.)属于活性氧组，具有较强的氧化性。o2^-.在微生物体系中普遍存在，当生物体遭受污染物胁迫时，体内活性氧的产生将大大增加；当其超出生物体的抗氧化防御能力时，生物中脂类、蛋白质、核酸等细胞成分将会在o2^-.作用下发生不可逆损坏，从而干扰细胞代谢或导致细胞死亡，超氧阴离子自由基也因此被认为是污染物致毒的重要途径和机制。另外，也有研究表明，活性氧参与细胞信号转导和生理响应的诱导，是细胞的一类重要的信号分子。

生物体内活性氧寿命极其短暂，如超氧阴离子自由基在水溶液中的存活时间为1s，羟基自由基的寿命仅为10^-6s，加之微生物体内活性氧浓度极低，导致其定性和定量检测极为困难。常见的超氧阴离子自由基测定方法有nbt(氯化硝基四唑氮蓝)法、细胞色素法、邻苯三酚法、肾上腺素法和羟胺氧化法。具有氧化活性的细胞色素c被超氧阴离子自由基还原后，形成了在波长550nm处有强吸收的亚铁细胞色素，可以用于超氧阴离子自由基的测定；但细胞色素c还原法的体系中如果存在着其他还原性物质(如还原性酶)便会对测试结果造成明显干扰。nbt在超氧阴离子自由基作用下，还原生成不溶于水、蓝色的二甲替(diformazan)，其最大吸收波长为560nm；但二甲替不溶于水，长时间放置会出现沉淀现象，难以应用于测定超氧阴离子自由基随时间延长的动态研究过程。传统的羟胺氧化法存在低含量o2^-.检测困难、正丁醇萃取液与反应介质分层不明显、羟胺自氧化影响测试效果等不足。超氧阴离子自由基也可以与1，2-二羟基苯-3，5-二磺酸钠(tiron)快速反应生成一种称之为“tiron半醌自由基”的自旋加合物，可在室温下应用电子顺磁共振波谱仪(epr)进行检测；epr自旋捕捉技术要求的实验条件比较严格，而且需要epr这样昂贵的分析测试仪器，因而限制了该技术的推广和普及。

微生物体内超氧阴离子自由基含量较低，传统的羟胺氧化法需要氧自由基的浓度相对较高；另外，超氧阴离子自由基测试时干扰因素较多，测定结果有时并不稳定。目前，还没出现有效的测定微生物体内超氧阴离子自由基浓度的方法，因此，开发操作较为简便、测试稳定程度高的微生物体内超氧阴离子自由基的测定方法具有重大意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种微生物体内超氧阴离子自由基的测定方法，该方法基于羟胺能与微生物体内的超氧阴离子自由基发生反应，生成粉红色偶氮化合物的原理，测定微生物体内超氧阴离子自由基浓度，本发明方法操作简单，测试稳定。

由于盐酸羟胺自氧化，测试中以加入盐酸羟胺组为空白组，能有效地消除盐酸羟胺自氧化而导致测定结果偏高。其次，以不加盐酸羟胺组为对照组，能有效地消除残余色素及内源no^2-的干扰。因此，在测定过程中，o^2-.实际a530值＝试验组的吸光值-对照组的吸光值－空白组的吸光值。

本发明设置试验组、对照组和空白组，向试验组、对照组和空白组中分别加入碳酸缓冲溶液，并向试验组和空白组中加入盐酸羟胺溶液，对照组加入相同体积的蒸馏水，然后将三组同时置于恒温水浴中，然后向试验组和对照组中加入上清液，空白组中加入相同体积的碳酸缓冲液，并分别摇匀后在水浴中静置，然后再向试验组、对照组和空白组中分别依次加入对基本磺酰胺和n-1-萘基乙二胺，然后在水浴中显色，三组显色后的溶液中加入萃取剂，充分混合均匀后分别进行离心处理，然后分别取上层萃取相，分别在540nm处测定试验组、对照组和空白组的吸光度，将测定的吸光度值求差，将此差值作为y带入标准曲线方程，计算x值，即为540nm处所对应试验组中no2^-浓度，然后按公式核算单位质量生物体内o2^-.含量，即完成微生物体内超氧阴离子自由基的测定。

一种微生物体内超氧阴离子自由基的测定方法，具体操作如下：

(1)将微生物样本中生物量大于800mg/l的活性污泥悬浊液在10000～12000r/min条件下离心8～10min，取离心后底部的微生物样本1～2g，当离心后底部的微生物样本不足1g时，重复取样累计至1～2g，然后向微生物样本中加入ph为9.5～10.5碳酸缓冲溶液，加入量为每1g微生物样本加入3.5～4.5ml，然后将混合溶液置于冰水浴中进行超声破碎，最后离心取上清液，其中超声破碎时间为2～3min，离心取上清液时离心转速为10000～120000r/min；

(2)标准曲线的制定：用nano2配制7组以上浓度为0～30μmol/l的no2^-标准溶液，分别定容至200ml，然后取7支以上的空白试管分别加入ph为9.5～10.5的碳酸缓冲溶液和浓度为50～100mmol/l盐酸羟胺溶液，其中碳酸缓冲溶液的加入量为每1g微生物样本加入0.5～1ml，盐酸羟胺溶液的添加量为每1g微生物样本加入0.1～0.3ml，然后将各组溶液置于25～35℃的恒温水浴中加热10～15min，然后向各组溶液中加入0.5ml浓度不同的no2^-标准溶液，摇匀后在25～35℃的恒温水浴中静置18～22min，再向各组溶液中依次加入对基本磺酰胺溶液和n-1-萘基乙二胺溶液，其中对基本磺酰胺溶液和n-1-萘基乙二胺溶液是将基本磺酰胺固体和n-1-萘基乙二胺固体分别溶于浓度为10～13mol/l的乙酸溶液得到，对基本磺酰胺溶液和n-1-萘基乙二胺溶液浓度分别为55～60mmol/l和5～10mmol/l，添加量为每1g微生物样本加入0.8～1ml对基本磺酰胺溶液和n-1-萘基乙二胺溶液，然后置于水浴中显色20～30min，再向各组溶液中加入萃取剂，充分混合均匀后分别进行离心处理，并分别取上层萃取相，在540nm处测定各组的吸光度，将测定的吸光度值作为y值，将各组的no^2-浓度作为x值，经线性拟合后得到标准曲线方程，其中加入萃取剂的体积为加入前各组溶液体积的0.8～1.2倍，萃取剂为二氯甲烷、三氯甲烷或甲苯；

(3)设置试验组、对照组和空白组，向三组中分别加入碳酸缓冲溶液并摇匀，并向试验组和空白组中加入盐酸羟胺溶液，对照组加入相同体积的蒸馏水，将三组同时置于25～35℃的恒温水浴中加热10～15min，然后向试验组和对照组中加入0.5ml上清液，空白组中加入相同体积的碳酸缓冲液，并分别摇匀后在25～35℃的恒温水浴中静置18～22min，然后再向试验组、对照组和空白组中分别依次加入对基本磺酰胺溶液和n-1-萘基乙二胺溶液，然后在水浴中显色20～30min，其中各溶液的浓度和加入量同步骤(2)；

(4)向步骤(3)的三组显色后的溶液中加入萃取剂，充分混合均匀后分别进行离心处理，然后分别取上层萃取相，并在540nm处测定试验组、对照组和空白组的吸光度，其中所用萃取剂同步骤(2)，其中离心处理的时间为3～5min；

(5)将步骤(4)测定的吸光度值求差，然后带入步骤(1)的标准曲线方程，求得540nm处所对应的试验组中no2^-浓度，然后按公式核算单位质量生物体内o2^-.含量，即完成微生物体内超氧阴离子自由基的测定，其中公式为其中为x值，单位为μmol·l^-1，v1为试验组待测样本的体积，单位为ml，v2为步骤(2)试验组超声破碎后离心取上清液总体积，单位为ml，ρ为试验组待测样本污泥固体物浓度，单位为mg·l^-1，m1为试验组步骤(2)离心后微生物样本的质量，单位为g，m2为试验组步骤(2)超声破碎并离心后沉积物的质量，单位为g。

所述制定标准曲线和检测样品，不同试管相同试剂的添加量一致。

本发明的优点和技术效果：

1、本发明使用ph为9.5～10.5的碳酸缓冲溶液，相较于传统使用的ph为7.8的磷酸缓冲液、ph为7.6tris-hcl缓冲液，待测体系对检测o2^-.的灵敏度提高了近10倍。

2、本发明的萃取剂为甲苯、三氯甲烷或二氯甲烷，采用二氯甲烷为萃取剂时，萃取相处于测试体系液相上层，且与萃余相分层明显，待测体系的吸光度值最高。

3、本发明使用对基本磺酰胺和n-1-萘基乙二胺测定超氧阴离子自由基专一性较好，操作简单、耗时短、易推广。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容。

实施例1：磷化氢驯化后的微生物样本体内超氧阴离子自由基的测定方法，具体操作如下：

取磷化氢驯化后的微生物悬浊20ml，其中生物量大约为5000mg/l，于10000r/min条件下离心8min，取离心管底部微生物样本1g，加入ph为9.5的碳酸缓冲溶液3.5ml，将微生物样本置于冰水浴中超声破碎2min后在10000r/min下离心10min，取上清液用于实验测定；

标准曲线方程的制定：以nano2配制8组浓度为3、6、9、12、15、18、21和24μmol/l的no2^-标准溶液，取8支试管，分别加入0.5mlph为9.5的碳酸缓冲溶液，然后加入0.1ml的浓度为70mmol/l的盐酸羟胺溶液，然后将各组溶液置于30℃的恒温水浴中加热12min，然后向各组溶液中加入0.5ml浓度分别为3、6、9、12、15、18、21和24μmol/l的no2^-标准溶液，摇匀后在30℃的恒温水浴中静置20min，再向各组溶液中依次加入0.8ml浓度为58mmol/l对基本磺酰胺溶液(溶于10mol/l乙酸)和0.8ml浓度为7mmol/l的n-1-萘基乙二胺溶液(溶于10mol/l乙酸)，并置于30℃水浴中显色25min，然后再向各组溶液中加入萃取剂二氯甲烷，所加体积为以上溶液总体积的1倍，充分混合均匀后分别进行离心处理，在10000r/min的条件下高速离心3min，并分别取上层萃取相，在540nm处测定各组的吸光度，将测定的吸光度值作为y值，将各组的no2^-浓度作为x值，经线性拟合后得到标准曲线方程y＝0.0184x+0.1909(r＝0.9994)；

设置试验组、对照组和空白组，向三组中分别加入碳酸缓冲溶液并摇匀，并向试验组和空白组中加入盐酸羟胺溶液，对照组加入相同体积的蒸馏水，将三组同时置于30℃的恒温水浴中加热12min，然后向试验组和对照组中加入0.5ml上清液，空白组中加入相同体积的碳酸缓冲液，并分别摇匀后在30℃的恒温水浴中静置20min，然后再向试验组、对照组和空白组中分别依次加入对基本磺酰胺溶液和n-1-萘基乙二胺溶液，然后在水浴中显色25min，其中所加各溶液的浓度和加入量同步骤(2)，然后向三组溶液中加入色素萃取液二氯甲烷，在10000r/min的条件下高速离心3min，分别取三组的粉红色上层萃取相并于540nm测定吸光度，求得三组a530差为0.258，带入标准曲线方程，求得x，再根据公式计算得到试验组氧自由基浓度为0.311μmol·g^-1。

实施例2：城市污水处理厂的微生物样本体内超氧阴离子自由基的测定方法，具体操作如下：

取城市污水处理厂的微生物悬浊液20ml，其中生物量大约为6800mg/l，于11000r/min条件下离心9min，取离心管底部微生物样本1.5g，加入ph为10.00的碳酸缓冲溶液6ml，将微生物样本置于冰水浴中超声破碎2.5min后在11000r/min下离心10min，取上清液用于实验测定。

标准曲线方程的制定：以nano2配制7组浓度分别为4、8、12、16、20、24、28μmol/l的no2^-标准溶液，取7支试管，分别加入1.5mlph为10.0的碳酸缓冲溶液，然后加入0.45ml的浓度为100mmol/l的盐酸羟胺溶液，然后将各组溶液置于35℃的恒温水浴中加热10min，然后向各组溶液中加入0.5ml浓度分别为4、8、12、16、20、24、28μmol/l的no2^-标准溶液，摇匀后在35℃的恒温水浴中静置18min，再向各组溶液中依次加入1.5ml浓度为55mmol/l对基本磺酰胺溶液(溶于11mol/l乙酸)和1.5ml浓度为5mmol/l的n-1-萘基乙二胺溶液(溶于11mol/l乙酸)，并置于35℃水浴中显色20min，然后再向各组溶液中加入萃取剂甲苯，所加体积为以上溶液总体积的0.8倍，充分混合均匀后分别进行离心处理，并分别取上层萃取相，在540nm处测定各组的吸光度，将测定的吸光度值作为y值，将各组的no2^-浓度作为x值，经线性拟合后得到标准曲线方程y＝0.0115x+0.1622(r＝0.9997)；

设置试验组、对照组和空白组，向三组中分别加入碳酸缓冲溶液并摇匀，并向试验组和空白组中加入盐酸羟胺溶液，对照组加入相同体积的蒸馏水，将三组同时置于35℃的恒温水浴中加热10min，然后向试验组和对照组中加入0.5ml上清液，空白组中加入相同体积的碳酸缓冲液，并分别摇匀后在35℃的恒温水浴中静置18min，然后再向试验组、对照组和空白组中分别依次加入对基本磺酰胺溶液和n-1-萘基乙二胺溶液，然后在35℃水浴中显色20min，其中所加各溶液的浓度和加入量同步骤(2)，然后向三组溶液中加入甲苯，10000r/min条件下高速离心4min，分别取三组的粉红色上层萃取相并于540nm测定吸光度，求得三组a530差为0.209，代入标准曲线求得x再由公式计算得到试验组氧自由基浓度为0.102μmol·g^-1。

实施例3：焦化废水处理厂的微生物样本体内超氧阴离子自由基的测定方法，具体操作如下：

取焦化废水处理厂的微生物悬浊液20ml，其中生物量大约为4500mg/l，于12000r/min条件下离心10min，取离心管底部微生物样本2g，加入ph为10.00的碳酸缓冲溶液8ml，将微生物样本置于冰水浴中超声破碎2.5min后在11000r/min下离心10min，取上清液用于实验测定；

标准曲线方程的制定：以nano2配制浓度为3、6、9、12、15、18、21和24μmol/l的no2^-标准溶液，取8支试管，分别加入1mlph为10.0的碳酸缓冲溶液，然后加入0.3ml的浓度为80mmol/l的盐酸羟胺溶液，然后将各组溶液置于25℃的恒温水浴中加热15min，然后向各组溶液中加入0.5ml浓度分别为3、6、9、12、15、18、21和24μmol/l的no2^-标准溶液，摇匀后在25℃的恒温水浴中静置22min，再向各组溶液中依次加入0.9ml浓度为60mmol/l对基本磺酰胺溶液(溶于13mol/l乙酸)和0.9ml浓度为10mmol/l的n-1-萘基乙二胺溶液(溶于13mol/l乙酸)，并置于25℃水浴中显色30min，然后再向各组溶液中加入萃取剂二氯甲烷，所加体积为以上溶液总体积的1.1倍，充分混合均匀后分别进行离心处理，10000r/min条件下高速离心5min，并分别取上层萃取相，在540nm处测定各组的吸光度，将测定的吸光度值作为y值，将各组的no2^-浓度作为x值，经线性拟合后得到标准曲线方程y＝0.0201x+0.1045(r＝0.9992)；

设置试验组、对照组和空白组，向三组中分别加入碳酸缓冲溶液并摇匀，并向试验组和空白组中加入盐酸羟胺溶液，对照组加入相同体积的蒸馏水，将三组同时置于25℃的恒温水浴中加热15min，然后向试验组和对照组中加入0.5ml上清液，空白组中加入相同体积的碳酸缓冲液，并分别摇匀后在25℃的恒温水浴中静置22min，然后再向试验组、对照组和空白组中分别依次加入对基本磺酰胺溶液和n-1-萘基乙二胺溶液，然后在25℃水浴中显色30min，其中所加各溶液的浓度和加入量同步骤(2)，然后向三组溶液中加入二氯甲烷，10000r/min条件下高速离心5min，分别取三组的粉红色上层萃取相并于540nm测定吸光度，求得三组a530差为0.279，代入标准曲线求得x再由公式计算得到试验组氧自由基浓度为0.478μmol·g^-1。

实施例4：城市污水处理厂的微生物样本体内超氧阴离子自由基的测定方法，具体操作如下：

取城市污水处理厂的微生物悬浊液20ml，其中生物量大约为6300mg/l，于12000r/min条件下离心10min，取离心管底部微生物样本2g，加入ph为10.50的碳酸缓冲溶液9ml，将微生物样本置于冰水浴中超声破碎3min后在12000r/min下离心10min，取上清液用于实验测定；

标准曲线方程的制定：以nano2配制8组浓度为3、6、9、12、15、18、21和24μmol/l的no2^-标准溶液，取8支试管，分别加入2mlph为9.5的碳酸缓冲溶液，然后加入0.6ml的浓度为50mmol/l的盐酸羟胺溶液，然后将各组溶液置于30℃的恒温水浴中加热10min，然后向各组溶液中加入0.5ml浓度分别为3、6、9、12、15、18、21和24μmol/l的no2^-标准溶液，摇匀后在30℃的恒温水浴中静置22min，再向各组溶液中依次加入2ml浓度为58mmol/l对基本磺酰胺溶液(溶于12mol/l乙酸)和2ml浓度为7mmol/l的n-1-萘基乙二胺溶液(溶于12mol/l乙酸)，并置于30℃水浴中显色30min，然后再向各组溶液中加入萃取剂三氯甲烷，所加体积为以上溶液总体积的1倍，充分混合均匀后分别进行离心处理，10000r/min条件下高速离心3.2min，并分别取上层萃取相，在540nm处测定各组的吸光度，将测定的吸光度值作为y值，将各组的no2^-浓度作为x值，经线性拟合后得到标准曲线方程y＝0.0104x+0.1922(r＝0.9997)；

设置试验组、对照组和空白组，向三组中分别加入碳酸缓冲溶液并摇匀，并向试验组和空白组中加入盐酸羟胺溶液，对照组加入相同体积的蒸馏水，将三组同时置于30℃的恒温水浴中加热10min，然后向试验组和对照组中加入0.5ml上清液，空白组中加入相同体积的碳酸缓冲液，并分别摇匀后在30℃的恒温水浴中静置22min，然后再向试验组、对照组和空白组中分别依次加入对基本磺酰胺溶液和n-1-萘基乙二胺溶液，然后在30℃水浴中显色30min，其中所加各溶液的浓度和加入量同步骤(2)，然后向三组溶液中加入三氯甲烷，10000r/min条件下高速离心3.2min，分别取三组的粉红色上层萃取相并于540nm测定吸光度，求得三组a530差为0.301，代入标准曲线求得x再由公式计算得到试验组氧自由基浓度为0.589μmol·g^-1。

实施例5：脱氮滴滤塔中的微生物样本体内超氧阴离子自由基的测定方法，具体操作如下：

取脱氮滴滤塔中的微生物悬浊液20ml，其中生物量大约为8200mg/l，于12000r/min条件下离心10min，取离心管底部微生物样本2g，加入ph为10.00的碳酸缓冲溶8.5ml，将微生物样本置于冰水浴中超声破碎3min后在12000r/min下离心10min，取上清液用于实验测定。

标准曲线方程的制定：以nano2配制8组浓度分别为3、6、9、12、15、18、21和24μmol/l的no2^-标准溶液，取8支试管，分别加入1mlph为10.0的碳酸缓冲溶液，然后加入0.2ml的浓度为90mmol/l的盐酸羟胺溶液，然后将各组溶液置于35℃的恒温水浴中加热10min，然后向各组溶液中加入0.5ml浓度分别为3、6、9、12、15、18、21和24μmol/l的no2^-标准溶液，摇匀后在35℃的恒温水浴中静置18min，再向各组溶液中依次加入2ml浓度为58mmol/l对基本磺酰胺溶液(溶于10mol/l乙酸)和2ml浓度为7mmol/l的n-1-萘基乙二胺溶液(溶于10mol/l乙酸)，并置于35℃水浴中显色24min，然后再向各组溶液中加入萃取剂二氯甲烷，所加体积为以上溶液总体积的1.2倍，充分混合均匀后分别进行离心处理，10000r/min条件下高速离心3min，并分别取上层萃取相，在540nm处测定各组的吸光度，将测定的吸光度值作为y值，将各组的no2^-浓度作为x值，经线性拟合后得到标准曲线方程y＝0.0122x+0.1751(r＝0.9998)；

设置试验组、对照组和空白组，向三组中分别加入碳酸缓冲溶液并摇匀，并向试验组和空白组中加入盐酸羟胺溶液，对照组加入相同体积的蒸馏水，将三组同时置于35℃的恒温水浴中加热10min，然后向试验组和对照组中加入0.5ml上清液，空白组中加入相同体积的碳酸缓冲液，并分别摇匀后在35℃的恒温水浴中静置18min，然后再向试验组、对照组和空白组中分别依次加入对基本磺酰胺溶液和n-1-萘基乙二胺溶液，然后在35℃水浴中显色24min，其中所加各溶液的浓度和加入量同步骤(2)，然后向三组溶液中加入三氯甲烷，10000r/min条件下高速离心3min，分别取三组的粉红色上层萃取相并于540nm测定吸光度，求得三组a530差为0.256，代入标准曲线求得x再由公式计算得到试验组氧自由基浓度为0.325μmol·g^-1。