本发明属于生物学检测技术领域，特别是涉及一种非诊断目的的大肠埃希氏菌o157:h7的快速检测方法。
背景技术：
大肠埃希氏菌o157:h7(escherichiacolio157:h7，e.colio157:h7)，是一种重要的食源性致病菌，属于主要食源性致病菌的前五位之一。e.colio157:h7主要通过污染牛肉、奶、鸡肉及其制品，蔬菜等食物进行传播。当人感染了e.colio157:h7后，会出现胃肠道疾病，更有严重者甚至发展为血小板减少性紫癜(ttp)[8-10]。目前对e.colio157:h7检测方法主要有国标法(增菌培养法)和各种pcr法等，各有优缺点。因此，建立一种更好的e.colio157:h7定性定量的新型快速检测技术，具有较大现实意义。
近年来，具有高比表面积、高导电性、催化性、低毒性等诸多优点的金铂纳米微球(au-ptnps)和具有高比表面积、化学性质稳定、生物相容性好等优点的二氧化硅纳米粒子(sinps)作为纳米材料领域的研究热点，已被应用于生物分析、化学检测、食品检测等研究领域。au-ptnps被证实具有优异的生物相容性，能够与蛋白质中的氨基和半胱氨酸残基相互作用稳定而迅速地吸附蛋白质且保持其活性，可用其结合抗体等生物大分子。然而，单独的au-ptnps常因为不稳定较易发生团聚而影响蛋白标记物的活性。近期有研究发现，将sinps进行氨基化或者巯基化修饰，可结合au、ag、pt和pb等金属，复合形成sinps/au、sinps/ag，sinps/pt，结合之后不仅可以有效提高各自的分散性，降低聚集作用，还能同时拥有两种纳米材料的优点。目前，将金铂硅纳米微球(apsnps)同时标记抗体和酶制备出信号转导探针ab2/apsnps/invertase，应用于食源性致病菌及其他待测物检测的研究都还未见报道。
综上，本发明针对现有大肠埃希氏菌o157:h7检测技术的缺陷，开发出一种大肠埃希氏菌o157:h7的快速检测方法。本发明的快速检测方法以apsnps为载体通过结合抗体和酶形成信号转导探针(ab2/apsnps/invertase)；用免疫磁性探针(mnps-igg)的超顺磁性对样品中目标物进行富集和分离，将被检测的目的菌大肠埃希氏菌o157:h7的信号转换为葡萄糖分子的信号，用便携式血糖仪(personalglucosemeter，pgm)读出。本研究的创新点在于基于血糖仪和两种纳米复合物mnps-igg与ab2/apsnps/invertase分别作为捕获探针和信号转导探针，构建一种新型的经济、简便、快速、灵敏的检测食品中的大肠埃希氏菌o157:h7的新方法。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种非诊断目的的大肠埃希氏菌o157:h7的快速检测方法。本发明以基于血糖仪和两种纳米复合物mnps-igg与ab2/apsnps/invertase分别作为捕获探针和信号转导探针，实现了对食品中的大肠埃希氏菌o157:h7定性定量的快速检测，该检测方法经济、简便、快速，具有良好的灵敏度、特异性、稳定性和准确性。
为了达到上述的目的，本发明采取以下技术方案：
一种非诊断目的的大肠埃希氏菌o157:h7的快速检测方法，包括以下步骤：
(1)用鼠抗大肠埃希氏菌o157:h7抗体对fe3o4/sio2核壳结构的磁性纳米颗粒表面进行修饰，得到免疫磁性探针，备用；
(2)将au-pt纳米微球修饰到二氧化硅纳米颗粒(sinps)表面，得到au-pt-sio2复合纳米微球(apsnps)；
(3)以步骤(2)制备得到的au-pt-sio2复合纳米微球(apsnps)为载体结合大肠埃希氏菌o157:h7抗体和蔗糖酶，得到信号转导探针，备用；
(4)取待测样品，用血糖仪检测待测样品中的葡萄糖初始浓度，然后将步骤(1)制备得到的免疫磁性探针加入到待测样品的菌悬液中于37℃孵育一定时间，经洗涤、磁性分离，将磁性复合物a分离出来；
(5)在步骤(4)分离得到的磁性物质a中加入步骤(3)制备得到的信号转导探针并于37℃孵育一定时间，经洗涤、磁性分离，将磁性复合物b分离出来；
(6)在步骤(5)得到的磁性复合物b中加入蔗糖溶液，在55℃下静置反应一定时间后用血糖仪检测体系的葡萄糖浓度c2；根据葡萄糖浓度的变化差值δc为纵坐标，大肠埃希氏菌o157:h7浓度的对数值为横坐标的标准曲线，能够计算出样品中大肠埃希氏菌o157:h7的含量，其中，δc＝c2-c1。
在上述方法中，所述的步骤(1)中的磁性纳米颗粒通过如下方法制备而得：
(1)将聚(4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸)钠盐(pssma)溶于乙二醇中，磁力搅拌得到均匀的橙色溶液；再加入六水合三氯化铁和无水醋酸钠；接着，将得到的红棕色均一液体倒入到水热反应釜中，200℃反应10h；待冷却到室温后，将所得黑色fe3o4沉淀物在外磁场作用下用超纯水洗涤至少三次；
(2)取fe3o4溶液置于锥形瓶中，向其中加入乙醇，去离子水和氨水，混合搅拌后，再加入正硅酸四乙酯(teos)，在室温下搅拌反应18h；然后在外磁场作用下依次用乙醇和蒸馏水洗涤多次，最后分离得到的沉淀物即为磁性纳米颗粒。
在上述方法中，所述步骤(1)中免疫磁性探针的具体制备步骤如下：首先取磁性纳米颗粒并用无水乙醇洗涤，将洗涤后的磁性纳米颗粒重悬于乙醇中，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)，室温下搅拌反应12h后，磁性分离并分别使用乙醇和磷酸盐缓冲液洗涤多次，得到氨基修饰的磁性纳米颗粒；同时，将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)加入到用磷酸盐缓冲液稀释的鼠抗大肠埃希氏菌o157:h7单克隆捕获抗体中，4℃过夜孵育；再加入溶于磷酸盐缓冲液的氨基修饰的磁性纳米颗粒，室温震荡反应4h，磁性分离并用磷酸盐缓冲液洗涤多次，得到表面修饰有鼠抗大肠埃希氏菌o157:h7抗体的磁性纳米颗粒。
在上述方法中，所述步骤(2)中的二氧化硅纳米颗粒通过如下方法制备而得：
将正硅酸四乙酯加入到乙醇中得到a液，将氨水和乙醇加入到水中得到b液，再将a液迅速地加入到b液中，室温条件下反应5h；结束后，离心分离，用无水乙醇和蒸馏水分别洗涤多次。
在上述方法中，所述步骤(2)中的au-pt-sio2复合纳米微球通过如下方法制备而得：
(1)将氯金酸溶液加入到超纯水中，油浴加热至煮沸，再快速加入柠檬酸钠溶液，经过几分钟后，溶液变红，表明已经生成了胶体金；接着，加入氯铂酸溶液，再迅速加入抗坏血酸溶液，不断搅拌，反应20min后冷却到室温，得到au-pt纳米微球；
(2)取二氧化硅纳米颗粒经超声后分散到无水乙醇，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，在室温下搅拌反应过夜，反应结束后离心分离，分别用乙醇和超纯水洗涤，获得氨基化的二氧化硅纳米颗粒；将氨基化的二氧化硅纳米颗粒分散到au-pt纳米微球的水溶液里，超声后加入聚(4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸)钠盐溶液，室温搅拌反应12h，结束后用超纯水和磷酸盐缓冲液分别离心洗涤3次，得到暗红色的沉淀物，即为au-pt-sio2复合纳米微球。
在上述方法中，所述步骤(3)中信号转导探针的具体制备步骤如下：将大肠埃希氏菌o157:h7标记抗体加入到au-pt-sio2复合纳米微球溶液中，在4℃环境下轻柔搅拌4h，加入用磷酸盐缓冲液稀释的蔗糖酶溶液，继续轻柔搅拌12h，反应结束后，离心，洗涤，得到信号转导探针。
在上述方法中，所述步骤(4)中免疫磁性探针的浓度为10mg/ml，体积为50μl，孵育时间为45min。
在上述方法中，所述步骤(5)中信号转导探针浓度为5mg/ml，体积为100μl，孵育时间优选为30min。
在上述方法中，所述步骤(6)中蔗糖溶液通过蔗糖溶于hac-naac缓冲液制备得到，蔗糖溶液的浓度优选为0.5m。
所述步骤(6)中标准曲线的线性方程为y＝5.0724x-6.6421，x是样品中大肠埃希氏菌的o157:h7浓度以10为底的对数值，单位为cfu/ml，y是葡萄糖浓度的变化差值δc，单位为mmol/l。
本发明具有以下技术特点：
1)本发明采用柠檬酸钠和抗坏血酸作为还原剂还原氯金酸和氯铂酸制备au-pt纳米微球，再通过静电吸附和pt-nh键作用结合到氨基修饰的二氧化硅纳米颗粒表面，不仅简单方便易制备，且合成过程安全无毒，更重要的是au-pt-sio2复合纳米微球在固定抗体和酶时避免了戊二醛法复杂的试剂和步骤，也避免了修饰过程中因交联而造成的酶和抗体活性损失的影响，提高了修饰效率。
2)本发明以免疫磁性探针作为捕获探针，从样品中富集和分离目标菌，提高检测的灵敏度，以信号转导探针与目标菌及免疫磁性探针形成夹心结构，由于夹心复合物上带有蔗糖酶，当有蔗糖存在时，它能催化水解生成葡萄糖使葡萄糖从无到有，浓度增加，然后使用血糖仪测量葡萄糖的浓度，这样可以将大肠埃希氏菌o157:h7浓度与葡萄糖浓度联系起来，达到定性定量检测大肠埃希氏菌o157:h7的目的；如果样品中没有目的菌，就没有酶催化产生葡萄糖。
3)本发明开发的大肠埃希氏菌o157:h7的快速检测方法，能够对食品中的大肠埃希氏菌o157:h7进行定性定量检测，检测过程经济、简便、快速，且能在4℃下储存90d而不失活，具有良好的稳定性，以及良好的灵敏度、特异性和准确性。
附图说明
图1实施例1制备得到的fe3o4纳米粒子的透射电镜图；
图2实施例1制备得到的fe3o4/sio2核壳结构的磁性纳米颗粒的投射电镜图；
图3实施例1制备得到的二氧化硅纳米颗粒的透射电镜图；
图4实施例1制备得到的au-pt纳米粒子的透射电镜图；
图5实施例1制备得到的au-pt-sio2复合纳米微球的透射电镜图；
图6信号转导探针集合免疫磁性探针快速检测大肠埃希氏菌o157:h7方法原理示意图；
图7实施例2葡萄糖浓度变化(δc)与捕获探针的量的关系图；
图8实施例2葡萄糖浓度变化(δc)与蔗糖酶和e.colio157:h7标记抗体的比例的关系图；
图9实施例2葡萄糖浓度变化(δc)与信号转导探针的浓度的关系图；
图10实施例3葡萄糖浓度变化(δc)与e.colio157:h7浓度对数的关系图。
图11实施例4特异性试验：葡萄糖浓度变化(δc)与细菌种类的关系图(从左到右依次为克罗诺阪崎肠杆菌(c.sakazakii)，肠炎沙门氏菌(s.enteritidis)，金黄色葡萄球菌(s.aureus)，副溶血性弧菌(v.parahaemolyticus)，费式柠檬乳酸菌(c.freundii)，鸡白痢鸡伤寒沙门氏菌(s.pullorumands.gallinarum)，pbs，大肠埃希氏菌o157:h7(e.colio157:h7)；所有菌浓度为108cfu/ml)；
图12实施例5稳定性实验：葡萄糖浓度变化(δc)与储存时间关系图。
具体实施方式
以下具体实施例是对本发明提供的方法与技术方案的进一步说明，但不应理解成对本发明的限制。
实施例1：
(一)fe3o4/sio2核壳结构的磁性纳米颗粒的合成
用溶剂热法合成fe3o4纳米粒子。具体合成过程如下：将0.5g聚(4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸)钠盐pssma溶于20ml乙二醇，磁力搅拌得到均匀的橙色溶液。再加入0.54g六水合三氯化铁和1.5g无水醋酸钠。接着，将得到的红棕色均一液体倒入到100ml水热反应釜中，200℃反应10h。待冷却到室温后，将所得黑色沉淀物在外磁场作用下用超纯水洗涤至少三次并定容至6ml超纯水中，待用。
取1ml上述制备的fe3o4溶液置于锥形瓶中，向其中加入60ml乙醇，10ml去离子水和9ml氨水，混合搅拌10min后，再加入1ml正硅酸四乙酯teos，在室温下搅拌反应18h。然后在外磁场作用下依次用乙醇和蒸馏水洗涤多次，最后分离得到的沉淀物即为磁性纳米颗粒(magneticnanoparticles，mnps)，定容到1ml待用。
如图1所示，fe3o4纳米粒子具有较好的单分散性，且所有颗粒均为典型的球状实心结构，通过nanozs激光粒度仪和对比参考标尺测定纳米颗粒的平均直径约为350nm。如图2所示，利用
(二)免疫磁性探针的合成
首先取150μl上述所制备的磁性纳米颗粒(mnps)并用无水乙醇洗涤2次，将mnps重悬于20ml乙醇中，加入200μl3-氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)，室温下搅拌反应12h后，磁性分离并分别使用乙醇和磷酸盐缓冲溶液(pbs)(ph7.4)洗涤多次，得到mnps-nh2。同时，将48.3mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和60.4mgn-羟基琥珀酰亚胺(nhs)加入到1.2ml用pbs稀释的鼠抗e.colio157:h7单克隆捕获抗体(145μg/ml)中，4℃过夜孵育。再加入溶于120μlpbs的2.4mgmnps-nh2，室温震荡反应4h，磁性分离并用pbs洗涤多次，最后定容于200μlpbs中，得到表面修饰有鼠抗e.colio157:h7抗体的fe3o4/sio2核壳结构的磁性纳米颗粒，即免疫磁性探针。在4℃下保存待用。
(三)二氧化硅纳米颗粒的合成
利用
由图3可得，合成的纳米粒子大小均匀，粒粒分开，分散性好，且形貌均为典型而光滑的球状。通过nanozs激光粒度仪测得的水合粒径为200nm。
(四)au-pt-sio2复合纳米微球的合成
首先将0.5ml1wt％氯金酸溶液加入到50ml超纯水中，油浴加热至煮沸。再快速加入0.75ml1wt％柠檬酸钠溶液，经过几分钟后，溶液变红，表明已经生成了胶体金。接着，加入0.625ml1wt％氯铂酸溶液，再迅速加入1ml0.1m抗坏血酸溶液，不断搅拌。反应20min后停止加热。待冷却到室温后，定容，得到au-ptnps溶液，在4℃下保存待用。
取上述0.05gsinps经超声后分散到20ml的无水乙醇，加入200μlaptes，在室温下搅拌反应过夜，水解反应后氨基被引入到sinps表面上。在10000rpm条件下离心分离并分别用乙醇和超纯水洗涤3次，获得氨基化的sinps。将4mg氨基化的sinps分散到1ml水和4mlau-ptnps溶液里，超声后加入1ml3％pssma溶液(w/v)。室温搅拌反应12h，结束后用超纯水和0.01mph7.2pb缓冲液分别离心洗涤3次，得到暗红色的沉淀物，即为au-pt-sio2复合纳米微球，最后定容于5mlpbs中。
如图4所示，合成的au-pt纳米粒子形貌酷似“海胆状”，pt粒子均匀地包覆在au粒子表面，且大小均匀，分散性好，所有的粒子都呈现大致的球形。通过nanozs激光粒度仪测得的水合粒径约为30nm。
如图5所示合成的au-pt-sio2复合纳米微球分散性好，且均匀的sinps表面分布了很多au-ptnps，结合率较高。通过nanozs激光粒度仪测得的水合粒径约为250nm。
(五)信号转导探针的合成
将100μle.colio157:h7标记抗体(80μg/ml)加入到上述5mlau-pt-sio2复合纳米微球溶液中，在4℃环境下轻柔搅拌4h，加入500μl用pbs稀释的蔗糖酶溶液(12mg/ml)，继续轻柔搅拌12h。在该过程中，抗体和酶会通过蛋白和金铂之间的pt-s/pt-nh键结合到apsnps表面。反应结束后，在4℃环境下离心以10000r/min离心5min，用pb缓冲液洗3遍以上。得到ab2/apsnps/invertase。最后保存于含有0.5wt％bsa的ph7.2pb缓冲液中。在4℃冰箱下保存待用。
(六)血糖仪结合免疫磁性探针对大肠埃希氏菌o157:h7的检测方法
用血糖仪结合信号转导探针ab2/apsnps/invertase快速检测e.colio157:h7的原理如图6所示。具体检测步骤如下：50μl免疫磁性探针(mnps-igg)(10mg/ml)加入到1mle.colio157:h7菌悬液当中于37℃孵育45min后，用pbs洗涤3次除去未结合的e.colio157:h7和其他物质，得到磁性复合物a(mnps-igg/e.colio157:h7免疫复合物)。磁性分离后再加入100μl5mg/ml信号转导探针ab2/apsnps/invertase于37℃孵育30min，再用pbs彻底洗涤除去未结合的ab2/apsnps/invertase，得到磁性复合物b(mnps-igg/e.colio157:h7/ab2/apsnps/invertase夹心“三明治”结构的免疫复合物)。磁性分离后，再向体系中加入50μl0.5m蔗糖溶液(用ph4.5hac-naac缓冲液溶解)，55℃下静置反应90min后用血糖仪检测葡萄糖的浓度。
实施例2：信号转导探针结合免疫磁性探针免疫夹心法快速检测大肠埃希氏菌o157:h7方法的建立
(一)免疫磁性探针使用量的优化
改变免疫磁性探针用量分别为30μl、35μl、40μl、50μl和55μl，其它实验条件与实施例1相同。如图7所示，蔗糖酶水解产生的葡萄糖的浓度随着捕获探针的量的增加而不断变大，信号不断增强，直到加入的量达到50μl时，葡萄糖浓度达到最大，pgm的信号也最强。随着量继续增加，葡萄糖浓度反而降低。因此，选择加入的捕获探针的量为50μl。
(二)蔗糖酶和e.colio157:h7标记抗体修饰在au-pt-sio2复合纳米微球的比例的优化
改变蔗糖酶与抗体的比例分别为3:1，2:1，1:1，1:2，1:3，其它实验条件与实施例1相同。如图8所示，随着比例的减少，蔗糖被蔗糖酶水解产生的葡萄糖的浓度先增加，说明抗体结合的越来越多，形成的夹心结构越牢固，产生的信号值也就越大，当比例为2:1时信号最大。随着酶与抗体的比例继续减少，水解产生的葡萄糖的浓度开始下降，这说明信号转导探针上结合的酶越来越少，故而产生的葡萄糖变少，信号值变低，进而降低了反应的灵敏度。因此，选择酶和抗体的比例为2:1。
(三)信号转导探针的浓度的优化
在保持其他因素一致的条件下，分别设置了40μl，60μl，80μl，100μl，120μl的量来检测108cfu/mle.colio157:h7。结果如图9所示，随着加入的量的增多，水解产生的葡萄糖越来越多，直到加入的量为100μl时，pgm信号值达到最大。当加入的量为120μl时，产生的信号值与之前的差不多，说明加入的信号转导探针已经使夹心复合物达到饱和状态。因此，为节约成本和降低空白值，选择加入的信号转导探针的量为100μl。
实施例3：灵敏度检测
在实施例1的检测条件下，研究了该检测方法对3.5×101到3.5×108cfu/ml范围内e.colio157:h7的检测结果。pgm信号值与e.colio157:h7的浓度关系如图10所示，当e.colio157:h7的浓度在3.5×102cfu/ml到3.5×106cfu/ml变化时，葡萄糖浓度变化差值与e.colio157:h7的浓度的对数值呈现良好的线性关系。线性方程为y＝5.0724x-6.6421，变异系数r2＝0.9863，且方法对目标菌e.colio157:h7的检出限为1.83×102cfu/ml，该检测限比传统的elisa法(1.0×105cfu/ml)要低很多。样品中的e.colio157:h7浓度可以通过线性回归方程定量得到。
实施例4：特异性实验
选用e.colio157:h7作为目标菌，克罗诺阪崎肠杆菌(c.sakazakii)，肠炎沙门氏菌(s.enteritidis)，金黄色葡萄球菌(s.aureus)，副溶血性弧菌(v.parahaemolyticus)，费式柠檬乳酸菌(c.freundii)，鸡白痢鸡伤寒沙门氏菌(s.pullorumands.gallinarum)几种常见的食源性致病菌作为对照菌进行特异性实验，pbs作为空白对照。实验结果如图11所示，e.colio157:h7组水解产生的葡萄糖远远大于其他食源性致病菌组和pbs组产生的葡萄糖。这些结果证明该方法能有效区分e.colio157:h7与其他食源性致病菌和pbs，对e.colio157:h7的检测具有良好的特异性。
实施例5：稳定性实验
将捕获探针mnp-igg和信号转导探针ab2/apsnps/invertase分别于4℃冰箱内分别保存1,7,30,60,90d后，再利用这两种探针检测108cfu/mle.colio157:h7。如图12所示，在三个月的试验期间，虽然酶催化水解产生的葡萄糖量有所下降，但还是保持较稳定状态且产生的葡萄糖量较多。表明mnp-igg和ab2/apsnps/invertase两种纳米探针在4℃下存储90d后仍能保持良好的反应活性。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求保护范围内。