一种基于氨基酸的荆条蜜鉴别方法与流程

本发明涉及一种荆条蜜氨基酸特征标记物的鉴别方法，属于食品科学领域。

背景技术：

蜂蜜（honey）是由蜜蜂采集植物花粉和分泌物并与自身的物质相结合，在蜂巢中酿造而成的一种天然甜物质。蜂蜜中含有多种氨基酸、蛋白质、酚酸、黄酮等营养物质。蜂蜜的营养价值和感观都与花源地有密切的关系，因此不同花源蜂蜜的市场价格也有很大的不同。目前，市场上蜂蜜质量良莠不齐，有很多以次充好的情况。因此，确立不同种类蜂蜜的花源标记物对于鉴别蜂蜜种类有重大意义。

荆条（vitex negundo var. heterophylla(Franch.) Rehd）主要分布于我国北方地区，是一种耐贫瘠、耐干旱植物，是我国主要的蜜源植物之一。荆条花为淡紫色，花期为每年6-8月，荆花开放季节，每群蜂可产荆条蜜15到50公斤。荆条蜜呈半透明琥珀状，结晶细腻乳白，口感甜而不腻。富含多种矿物质和蛋白质、氨基酸、维生素、无机酸等，是理想的滋补营养品，可以止咳润肺、健胃通便、防暑清心等功效。多适合气血不足、伤风头痛、目赤、失眠者。

蜂蜜中的氨基酸主要来源于蜜源植物的花粉，因此从氨基酸含量的不同可以判断蜂蜜的花源植物。目前我国对于蜂蜜中游离氨基酸的研究很少，而随着高效液相色谱（HPLC）和氨基酸衍生技术的进步为准确测定蜂蜜中的游离氨基酸提供了可靠的方法。

技术实现要素：

本发明目的是提供一种荆条蜜的氨基酸特征标识物的鉴别方法。该方法使用waters Accq·Tag试剂盒衍生氨基酸，高效液相色谱串联二极管阵列检测器(HPLC−DAD)测定氨基酸含量，从而确定荆条蜜氨基酸特征标识物，为鉴别荆条蜜的真伪提供可靠依据。

本发明的目的通过以下方案实现：

一种荆条蜜氨基酸特征标识物的鉴别方法，包括以下步骤：

（1）选取四种常见的蜂蜜包括枣花蜜，龙眼蜜，洋槐蜜和油菜蜜作为比较；将蜂蜜样品加蒸馏水充分溶解，定容，使用waters Accq·Tag试剂盒衍生氨基酸，配制成供试样品，荆条蜜样品做相同处理；

（2）使用HPLC-DAD对枣花蜜、龙眼蜜、洋槐蜜、油菜蜜和荆条蜜样品的供试溶液进行测定分析，确定荆条蜜样品的特征峰，保留时间为32.225 min的色谱峰，通过与标准品对照该峰为苯丙氨酸；

（3）采集全国不同省份和地区的荆条蜜样品，衍生氨基酸，方法同步骤（1）；

（4）使用HPLC-DAD对全国不同省份和地区的荆条蜜样品的供试溶液进行测定分析，保留时间为32.225的色谱峰强度最大且出现在所有供试荆条蜜样品溶液中；

（5）以18种氨基酸含量为变量，运用化学计量学中的聚类分析方法和判别分析对蜂蜜样品进行分析，荆条蜜可以准确的从其他样品中分离出来。

上述液相色谱条件为：色谱柱：waters Accq·Tag 氨基酸分析柱，150mm × 3.9 mm, 5 µm；流动相：乙腈，超纯水和waters Accq·Tag 缓冲液；流动相流速：1.0 mL/min；洗脱方式：梯度洗脱；检测波长：248nm；柱温：37℃。

本发明的优点与积极效果：(1)本发明中所确定的荆条蜜特征氨基酸标识物苯丙氨酸衍生后在紫外248 nm波长处有极强的吸收，而且其含量远远高于其他品种蜂蜜。(2)对采自中国不同省份和地区的荆条蜜样品进行反复提取分析验证，证明荆条蜜中苯丙氨酸稳定存在，含量不受产地影响。因此，苯丙氨酸可以作为荆条蜜的一种特征标识物。(3)本发明采用化学计量学方法对18种氨基酸含量进行聚类和判别分析，为鉴别荆条蜜提供可靠依据。

附图说明

图1 为枣花蜜衍生氨基酸色谱图；

图2 为洋槐蜜衍生氨基酸色谱图；

图3 为油菜蜜衍生氨基酸色谱图；

图4 为龙眼蜜衍生氨基酸色谱图；

图5 为荆条蜜衍生氨基酸色谱图；

图6 为蜂蜜样品判别分析图；

图7 为蜂蜜样品聚类分析图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例作进一步的说明。

分别称取四种蜂蜜包括枣花蜜、洋槐蜜、油菜蜜和龙眼蜜各3g，定容至25mL。

将waters Accq·Tag 试剂盒中衍生剂稀释液2B lmL加入到衍生粉末2A中，配成衍生剂。吸取10μL 样品溶液于6×50mm 样品管底部，加入70μL AccQ Flour 1涡旋混合，加20μL配制好的衍生剂涡旋混合，室温放置1 min，55℃加热10min，备用。

HPLC−DAD分析中，色谱柱为waters Accq·Tag 氨基酸分析柱(150mm × 3.9 mm, 5 µm)；流动相A为乙腈，B为超纯水和C为waters Accq·Tag 缓冲液；流动相流速为1.0 mL/min；检测波长为248nm；柱温为37℃；进样量为10μL。梯度洗脱程序如下：0min-0.5min C 100%；0.5min-18min A 5%,C 95%；18min-19min A 5%-9%，C 95%-91%；19min-29min A 9%-17%，C 91%-83%；29min-38min A 17%-60% B 0%-40% C 83%-0%；38min-40min A 60%-0%，B 40%-0%，C 0%-100%。

通过HPLC-DAD分析，对枣花蜜、洋槐蜜、油菜蜜、龙眼蜜、和荆条蜜样品色谱图进行比较，得到荆条蜜样品的特征氨基酸(保留时间为32.225min的色谱峰)与标准品对照该峰为苯丙氨酸，参见图1-5。

采集河南、河北、山西、陕西、甘肃五个不同省份的荆条蜜样品，对蜂蜜中的氨基酸进行HPLC-DAD分析，得到20批荆条蜜样品氨基酸的HPLC-DAD色谱图，荆条蜜样品在32.225 min时苯丙氨酸的色谱峰面积均远高于其他蜂蜜样品，参见表1及图1-5。

根据上述方法，确定了荆条蜜中的特征氨基酸。因此，本发明适用于鉴别荆条蜜特征氨基酸并为鉴别荆条蜜真伪提供可靠依据。如图6-7，以18种氨基酸含量为变量，运用化学计量学中的聚类分析方法和判别分析对蜂蜜样品进行分析，荆条蜜可以准确的从其他样品中分离出来。