一种快速检测粮食中手性三唑醇的方法与流程

本发明涉及检测技术领域，具体地说是一种利用超高效合相色谱串接三重四级杆质谱仪同时快速检测粮食中手性三唑醇的方法，属于粮食农药残留分析技术领域。

背景技术：

三唑醇为高效、低毒、低残留的内吸性杀菌剂，主要用于防治禾谷类作物的白粉病和黑粉病，如防治小麦散黑穗病、网腥黑穗病、根腐病、大麦散黑穗病、锈病、叶条纹病、网斑病等。三哇酮在植物体内代谢为L-三唑醇。当前关于L-三唑醇和D-三唑醇的检测方法多数只对其中的一种农药进行检测，而且检测步骤较多，检测时干扰较大。玉米以及高粮主要干扰物为釉脂、色素。使用现有的气质联用仪检测，这些高沸点的物质沉积在进样口和柱头中，占据活性位点，从而导致色谱分离能力降低，同时产生基质增强效应。而有效去除油脂、色素的干扰、保证三种化合物的回收率具有一定的难度。

目前的进出口标准采用气相色谱质谱联用法检测。其中，气相-质谱联用法不稳定，操作费时、步骤多，且使用的试剂有毒且易挥发，不利于人体健康。有文献报道使用正相溶剂测试三唑醇，但是由于三唑醇的性质，使用MRM质谱定量，手性三唑醇使用正相溶剂将面临正相溶剂质谱兼容性差的问题，目前使用溶剂分析手性化合物，还面临不能走梯度、分析时间长、分离度不佳、方法重现性差等问题，且分析成本高，分析用试剂有毒且易挥发，不利于人体健康。

技术实现要素：

本发明旨在提供一种快速检测粮食中手性三唑醇的方法，采用超高效合相色谱仪串接三重四级杆质谱仪同时快速检测粮食中手性三唑醇(L-三唑醇、D-三唑醇)，本发明方法可以为粮食中三唑醇检测的准确判定、快速检测提供科学依据。

本发明通过超高效合相色谱仪串接质谱检测器检测(UPC²-MSMS)，本发明测试方法的灵敏度满足酒类样品低限量检测要求，同时该检测器使用方便，即插即用，能够快速的检测粮食中两种手性三唑醇的异构体。

本发明测试方法所用仪器为：超高效合相色谱仪(配有三重四级杆质谱仪)；Daicel Chiralpak IC-3 4.6x150mm；涡旋仪；超声仪；移液枪。

本发明快速检测粮食中手性三唑醇的方法，包括如下步骤：

步骤1：前处理

准确量取1.0g待测样品于10ml塑料离心管中，加入9ml 80％乙腈溶液，涡旋1min，使用超声仪超声10min，10000转/分钟离心5min，0.22um滤膜针头过滤器过滤，待进样；

步骤2：测试参数的设定

2a、超高效合相色谱仪的测试参数

色谱柱：Daicel Chiralpak IC-3 4.6x150mm；柱温：30～45℃；

样品室温度：10～20℃

流动相：二氧化碳(A相)+甲醇(B相)；流速：2～3mL/min；洗脱方式：梯度洗脱；进样模式：直接进样(Loop环进样)；时间：2min；ABPR压力：2000psi；

所述梯度洗脱的参数为：初始梯度甲醇的浓度为5vt％；1min时甲醇的浓度升至20vt％；1.5min时甲醇的浓度降至5vt％并保持至2min，即完成一个梯度的洗脱。

2b、ACQUITY TQD质谱检测器的测试参数

离子化方式：ESI+；

监测方式：多反应监测模式(MRM)；

锥空电压：35V

毛细管电压：3.00kV

脱溶剂气温度：500℃

脱溶剂气流量：1000L/h

锥空气流量：50L/h

喷雾电压：1.3kV；

离子源温度：150℃

定性与定量离子对：296〉70

表1 选择离子监测方式的质谱参数表

步骤3：两种三唑醇的标准曲线的绘制

分别取L-三唑醇、D-三唑醇配制混合标准工作溶液，混合系列标准工作溶液中L-三唑醇、D-三唑醇的浓度分别为10～500ng/mL，然后按照步骤2所设定的仪器参数取1.5mL各混合标准工作溶液进样检测(至少五组)，以待测物的峰面积与其所对应的质量浓度进行线性回归，获得两种三唑醇的线性回归方程，各线性回归方程所对应的曲线，即为相应三唑醇的标准曲线；

两种三唑醇对应的线性回归方程及相关系数r²见表2：

表2 两种三唑醇的线性回归方程、相关系数、检出限、定量限

步骤4：待测样品的测试

取经步骤1前处理的待测样品1.5mL，按步骤2的条件作UPC²分离，通过使用三重四级杆质谱仪检测，获得待测样品的色谱图。根据保留时间对待测样品进行定性分析，然后根据三唑醇的标准曲线对待测样品进行定量分析，即获得待测样品中所含有的三唑醇及相应含量。

对本发明方法作如下灵敏度测试：灵敏度测试包括仪器的灵敏度与方法的灵敏度，仪器的灵敏度用仪器的检出限表示，取信噪比≥3的三唑醇的混合标准溶液的最小浓度为仪器检出限；方法的灵敏度用方法的定量限表示，取信噪比≥9的三唑醇混合标准溶液的最小浓度为方法定量限。所得的相关数据见表2。

对本发明方法作如下准确性及重现性实验：选用同一个粮食样品经前处理后作为空白样品，分为3份，分别加入混合标准工作溶液进行加标回收实验，计算回收率；选取1个粮食样品按照同一前处理方法处理6个，分别进行实验，通过计算其相对标准偏差(RSD)的范围来判断分析方法的重现性。所述的准确性用回收率来表示，见表3，方法的重现性用相对标准偏差(RSD)来表示，见表4。可以看出回收率在80～120％，RSD<10％。

表3 两种三唑醇的加标回收率实验

表4 两种三唑醇的重现性实验

本发明的有益效果体现在：

1、本发明建立了一种利用超高效合相色谱串接三重四级杆质谱检测器同时快速检测粮食中手性三唑醇的方法，能够准确地对粮食中的三唑醇进行定性、定量分析，为粮食中三唑醇的准确判定、快速检测提供科学依据。

2、本发明超高效合相色谱串接三重四级杆质谱仪操作简单快捷、准确可靠、重复性好。

3、本发明Daicel Chiralpak IC-3 4.6x150mm手性柱子与CO2和甲醇流动相的选择对粮食中手性三唑醇达到了优异的分离效果。

4、本发明的前处理操作步骤少，重现性和加标回收较好，从而降低了实验误差并提高了数据的准确性。

5、本发明的检测方法是一项环保的“绿色”技术。分析中采用的主要流动相二氧化碳来自于其它工业释放的回收二氧化碳，实验中的使用二氧化碳不会再产生新的温室气体。使用此方法时，每次进样所消耗的改性剂(甲醇)仅为0.5mL，与同类检测方法相比，降低了90％的有机溶剂使用量。

6、本发明通过减少实验室消耗品的使用可以节约成本。

7、本次实验进样方式为直接进样，通过手性柱分离后，直接进入质谱检测器，可以大大提高方法的灵敏度，大大降低方法的检出限和定量限。

附图说明

图1为手性三唑醇标准溶液液相色谱图。

图2为L-三唑醇绘制的标准曲线。

图3为D-三唑醇绘制的标准曲线。

具体实施方式

为阐明对本发明的理解，下面结合具体的实施例对本发明的技术方案作进一步分析说明。

本发明实施例按如下步骤对某粮食中手性三唑醇进行测定，所用仪器为：超高效合相色谱仪(配有三重四级杆质谱仪TQD)；Daicel Chiralpak IC-3 4.6x150mm手性色谱柱；超声仪，涡旋仪；移液枪。

具体步骤为：

1、前处理

准确量取1.0g待测样品于10ml塑料离心管中，加入9ml 80％乙腈溶液，涡旋1min，使用超声仪超声10min，10000转/分钟离心5min，0.22um滤膜针头过滤器过滤，待进样；

2、测试参数的设定

2a、超高效合相色谱仪的测试参数

色谱柱：Daicel Chiralpak IC-3 4.6x150mm；柱温：30～45℃；

样品室温度：10～20℃

流动相：二氧化碳(A相)+甲醇(B相)；流速：2～3mL/min；洗脱方式：梯度洗脱；进样模式：直接进样(Loop环进样)；时间：2min；ABPR压力：2000psi；

初始流动相比例为95:5(A:B体积比)，到1.0min时流动相比例降至80:20，到1.5min时流动相比例升至95:5，95:5的比例保持至2.0min即完成一次梯度洗脱；进样量为2μL；

2b、ACQUITY TQD质谱检测器的测试参数

离子化方式：ESI+；

监测方式：多反应监测模式(MRM)；

锥空电压：35V

毛细管电压：3.00kV

脱溶剂气温度：500℃

脱溶剂气流量：1000L/h

锥空气流量：50L/h

喷雾电压：1.3kV；

离子源温度：150℃

定性与定量离子对：296〉70

3、两种三唑醇的标准曲线的绘制

分别取L-三唑醇、D-三唑醇配制混合标准工作溶液，混合标准工作溶液中L-三唑醇、D-三唑醇的浓度分别为10～500ng/mL，然后按照步骤2所设定的仪器参数取1.5mL各混合标准工作溶液进样检测，以待测物的峰面积与其所对应的质量浓度进行线性回归，获得两种三唑醇的线性回归方程，各线性回归方程所对应的曲线，即为相应三唑醇的标准曲线(如图2和图3所示)；

取L-三唑醇和D-三唑醇，配制1mg/L的储备液，然后分别将其稀释5个不同的混合系列标准工作溶液。

4、待测粮食的检测

取经步骤1前处理的待测样品1.5mL，按步骤2的条件作UPC²分离，通过使用质谱仪TQD检测器检测，获得待测样品的色谱图。根据保留时间对待测样品进行定性分析，然后根据三唑醇的标准曲线对待测样品进行定量分析，即获得待测样品中所含有的三唑醇及相应含量。本方法的检测数据与现有的方法检测数据对比数据见下表5。

表5 本方法的检测数据与现有的方法检测数据对比数据

从表5中数据可以看出，同种样品使用现有的方法与本方法相比，本方法的检出限较低，使用本方法能够检测到现有方法检测不到的含量，在两种方法检出限以上的含量，使用两种方法都能够检测到，两种方法检测的数据在合理的误差范围内，通过检测数据可以充分说明本方法优于现有的方法，能够准确的对手性三唑醇进行定量。