一种用液相色谱法分离测定利伐沙班及其有关物质的方法与流程

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种用液相色谱法分离测定利伐沙班及其有关物质的方法。

背景技术：

利伐沙班，英文名为Rivaroxban，是由拜耳和强生公司联合开发的一种高选择性直接抑制因子Xa的口服抗凝药，在临床上用于择期髋关节或膝关节置换手术成年患者，以预防静脉血栓形成。该药具有安全性高、可口服、无交叉耐药性、不良反应小等优点。利伐沙班化学名为：5-氯-氮-({(5S)-2-氧-3-[-4-(3-氧-4-吗啉基)苯基]-1,3-唑烷-5-基}甲基)-2-噻吩-羧酰胺(5-Chloro-thiophene-2-carboxylicacid{2-oxo-3-[4-(3-oxo-morpholin-4-yl)-phenyl]-oxazolidin-5-yl-methyl}-amide)，分子式为C19H18ClN3O5S。利伐沙班结构式为：

利伐沙班的生产工艺过程中，有些重要的中间体可能会去除不完全，从而影响药物纯度和质量；而在药物的贮藏和运输过程中，药物也可能经光照、高温、高湿等特殊条件降解产生降解杂质；上述有关物质皆无治疗作用，还可能影响药物的稳定性和疗效，甚至危害人体健康。对于利伐沙班主要控制的有机杂质主要为合成用起始原料、副产物、中间体及降解产生的杂质。分别是苯氨基吗啉酮(起始原料1)、环氧代邻苯二甲酰亚胺(起始原料2)、1,1’-羰基二咪唑(起始原料3)、5-氯噻吩-2-羧酸(起始原料4)、羟基氨基邻苯二甲酰亚胺、2-((2R)-2-羟基-3-{[4-(3-氧吗啉-4-基)苯基]氨基}丙基)-1H-异吲哚-1,3(2H)-二酮(中间体1)、氧代邻苯二甲酰亚胺(中间体2)、4-{4-[(5S)-5-(氨基甲基)-2-氧代-1,3-噁唑烷-3-基]苯基}吗啉-3-酮盐酸盐(中间体3)、乙酰草酰胺((S)-N-((2-氧代-3-(4-(3-氧吗啉基)苯基)恶唑-5-基)甲基)乙酰胺)、二草酰胺-脲(1,3-双(((S)-2-氧代-3-(4-(3-氧吗啉基)苯基)恶唑-5-基)甲基)脲)、脱氯化合物((S)-N-((2-氧代-3-(4-(3-氧吗啉基)苯基)恶唑-5-基)甲基)噻吩-2-甲酰胺)、4,5-二氯化合物((S)-4,5-二氯-N-((2-氧代-3-(4-(3-氧吗啉基)苯基)恶唑-5-基)甲基)噻吩-2-甲酰胺)、二胺((S)-5-氯-N-(4-(5-((5-氯噻吩-2-甲酰胺)甲基)-2-氧代恶唑烷-3-基)苯基)-N-(2-(2-(甲氨基)-2-氧代乙氧基)乙基)噻吩-2-甲酰胺)、三胺(5-氯-N-(4-((S)-5-((5-氯噻吩-2-甲酰胺)甲基)-2-氧代恶唑烷-3-基)苯基)-N-(2-(2-氧代-2-(((S)-2-氧代-3-(4-(3-氧吗啉基)苯基)恶唑-5-基)甲基氨基)乙氧基)乙基噻吩-2-甲酰胺)。

(1)乙酰草酰胺：(S)-N-((2-氧代-3-(4-(3-氧吗啉基)苯基)恶唑-5-基)甲基)乙酰胺

(2)二-草酰胺-脲：1,3-双(((S)-2-氧代-3-(4-(3-氧吗啉基)苯基)恶唑-5-基)甲基)脲

(3)脱氯化合物：(S)-N-((2-氧代-3-(4-(3-氧吗啉基)苯基)恶唑-5-基)甲基)噻吩-2-甲酰胺

(4)4,5-二氯化合物：(S)-4,5-二氯-N-((2-氧代-3-(4-(3-氧吗啉基)苯基)恶唑-5-基)甲基)噻吩-2-甲酰胺

(5)二胺：(S)-5-氯-N-(4-(5-((5-氯噻吩-2-甲酰胺)甲基)-2-氧代恶唑烷-3-基)苯基)-N-(2-(2-(甲氨基)-2-氧代乙氧基)乙基)噻吩-2-甲酰胺

(6)三胺：5-氯-N-(4-((S)-5-((5-氯噻吩-2-甲酰胺)甲基)-2-氧代恶唑烷-3-基)苯基)-N-(2-(2-氧代-2-(((S)-2-氧代-3-(4-(3-氧吗啉基)苯基)恶唑-5-基)甲基氨基)乙氧基)乙基噻吩-2-甲酰胺

(7)氧代邻苯二甲酰亚胺：(S)-2-(2-氧代-3-(4-(3-氧吗啉基)苯基)恶唑-5-基)甲基)异吲哚-1,3-二酮(中间体2)

(8)苯氨基吗啉酮：

(9)环氧代邻苯二甲酰亚胺：

(10)1,1’-羰基二咪唑：

(11)5-氯噻吩-2-羧酸：

(12)羟基氨基邻苯二甲酰亚胺：2-((2R)-2-羟基-3-{[4-(3-氧吗啉-4-基)苯基]氨基}丙基)-1H-异吲哚-1,3(2H)-二酮(中间体1)：

(13)4-{4-[(5S)-5-(氨基甲基)-2-氧代-1,3-噁唑烷-3-基]苯基}吗啉-3-酮盐酸盐(中间体3)：

利伐沙班中的杂质去除不完全，将会引入原料药终产品，从而影响药物纯度和质量。因此，实现利伐沙班及其有关物质的分离和定量测定，在利伐沙班的生产及其质量控制方面具有重要的现实意义。

技术实现要素：

基于现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种用液相色谱法分离测定利伐沙班及其有关物质的方法，以实现利伐沙班与杂质以及杂质与杂质之间的有效分离。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种用液相色谱法分离测定利伐沙班及其有关物质的方法，包括以下步骤：

(1)样品的制备：分别称取利伐沙班对照品、乙酰草酰胺对照品、二-草酰胺-脲对照品、三胺对照品、脱氯化合物对照品、氧代邻苯二甲酰亚胺对照品、4,5-二氯化合物对照品、二胺对照品、苯胺基吗啉酮对照品、环氧代邻苯二甲酰亚胺对照品、1,1’-羰基二咪唑对照品、5-氯噻吩-2-羧酸对照品、羟基氨基邻苯二甲酰亚胺对照品、4-{4-[(5S)-5-(氨基甲基)-2-氧代-1,3-噁唑烷-3-基]苯基}吗啉-3-酮盐酸盐对照品，将各对照品分别溶于混合溶剂中，得到对照品溶液，将对照品溶液混匀，得到样品，每1L样品中含每种对照品4～6μg；

所述混合溶剂由乙腈和无机溶剂按照体积比3:1～2混匀而成，所述无机溶剂为水、磷酸溶液或含有磷酸盐及磷酸的水溶液；

(2)测定：以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，以流动相A及流动相B混合进行梯度洗脱，流动相流速为0.8～1.2mL/min，用紫外检测器进行检测，检测波长为205～280nm，色谱柱柱温箱温度为30～50℃；

其中，流动相A由甲醇和含有缓冲盐、离子对试剂及磷酸的水溶液混合而成，且流动相A中甲醇的体积分数为5～10％，含有缓冲盐、离子对试剂及磷酸的水溶液中缓冲盐的浓度为10～100mmol/L、离子对试剂的浓度为5～50mmol/L、H3PO4的浓度为2～6mmol/L；

流动相B为乙腈和水的混合液，且流动相B中乙腈的体积分数为90～95％。

优选地，步骤(1)中作为无机溶剂的磷酸溶液的浓度为0.008～0.015mol/L。

优选地，步骤(2)中所述梯度洗脱按照以下设置：

优选地，步骤(1)中所述含有磷酸盐及磷酸的水溶液中，磷酸盐的浓度为10～100mmol/L、H3PO4的浓度为2～6mmol/L。

优选地，步骤(2)中所述梯度洗脱按照以下设置：

优选地，步骤(3)中所述缓冲盐为磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐及高氯酸盐中的一种。

进一步，步骤(3)中所述缓冲盐为磷酸二氢钾。

优选地，步骤(3)中所述离子对试剂为己烷磺酸钠、庚烷磺酸钠、十二烷基磺酸钠及十二烷基硫酸钠的一种。

优选地，步骤(3)中流动相流速为1.0mL/min。

优选地，步骤(3)中所述紫外检测器的检测波长为250nm。

优选地，步骤(3)中所述色谱柱柱温箱温度为40℃。

上述以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱为普通市售产品，选自Kromasil、AgilentMicrospher和Hypersil品牌的色谱柱。

本发明采用C18色谱柱，流动相A由甲醇和含有缓冲盐、离子对试剂及磷酸的水溶液混合，可以增强保留，改善分离度，确保色谱峰的良好对称性和较高的柱效；流动相B为乙腈和水的混合液，增大了分离度，使杂质与杂质之间得到有效分离。本发明解决了利伐沙班及其有关物质的分离测定问题，从而确保了利伐沙班的质量，实现利伐沙班原料药及其有关物质的质量可控。

附图说明

图1为实施例1时的利伐沙班及其有关物质HPLC图(带有色谱峰数据)；

图2为实施例1时的空白溶剂HPLC图；

图3为实施例2时的利伐沙班及其有关物质HPLC图(带有色谱峰数据)；

图4为实施例2时的空白溶剂的HPLC图。

具体实施方式

为了使本发明的技术目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面结合具体实施例对本发明的技术方案作出进一步的说明，但所述实施例旨在解释本发明，而不能理解为对本发明的限制，实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。

实施例1

仪器与条件

高效液相色谱仪：岛津：LC-20AT，CBM-20A，SIL-20AC，SPD-M20A，CTO-10ASvp；

色谱柱：C18(Hypersil，150×4.6mm，5μm)；

流动相A：甲醇和含有缓冲盐、离子对试剂及磷酸的水溶液按照体积比5:95混合而成，其中含有缓冲盐、离子对试剂及磷酸的水溶液是将1.36g磷酸二氢钾、1.0g已烷磺酸钠、0.2mL85％的磷酸加水至1000mL而得；

流动相B：乙腈和水按照体积比90:10混匀而成；

流速：1.0mL/min；

检测波长：250nm；

柱温：40℃；

进样体积：10μL；

混合溶剂：乙腈和0.01mol/L的磷酸溶液按照体积比3:2混匀而成；其中0.01mol/L的磷酸溶液是取11.5g磷酸或取85％磷酸6.7mL，用水稀释成10.0L。

用液相色谱法分离测定利伐沙班及其有关物质的方法，包括以下步骤：

(1)样品的制备：分别称取利伐沙班对照品、乙酰草酰胺对照品、二-草酰胺-脲对照品、三胺对照品、脱氯化合物对照品、氧代邻苯二甲酰亚胺对照品、4,5-二氯化合物对照品、二胺对照品、苯胺基吗啉酮对照品、环氧代邻苯二甲酰亚胺对照品、1,1’-羰基二咪唑对照品、5-氯噻吩-2-羧酸对照品、羟基氨基邻苯二甲酰亚胺对照品、4-{4-[(5S)-5-(氨基甲基)-2-氧代-1,3-噁唑烷-3-基]苯基}吗啉-3-酮盐酸盐对照品各5mg，将各对照品分别溶于25mL混合溶剂中，得到对照品溶液，取各对照品溶液5mL混匀，并用混合溶剂稀释至200mL，得到样品；

(2)测定：以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，以流动相A及流动相B混合进行梯度洗脱，梯度洗脱表如下：

按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见附图1～2。图1中保留时间为20.3860min的色谱峰为利伐沙班，其余色谱峰为利伐沙班有关物质的色谱峰；图2为空白溶剂色谱峰。

由图1可见，在该色谱条件下，利伐沙班和各杂质峰可以完全分离，利伐沙班与前后相邻色谱峰的分离度分别为7.13及20.46，前后相邻峰的保留时间分别为18.5036min及25.5926min。

实施例2

仪器与条件

高效液相色谱仪：岛津：LC-20AT，CBM-20A，SIL-20AC，SPD-M20A，CTO-10ASvp；

色谱柱：C18(Hypersil，150×4.6mm，5μm)；

流动相A：甲醇和含有缓冲盐、离子对试剂及磷酸的水溶液按照体积比5:95混合而成，其中含有缓冲盐、离子对试剂及磷酸的水溶液是将1.36g磷酸二氢钾、1.0g已烷磺酸钠、0.2mL85％的磷酸加水至1000mL而得；

流动相B：乙腈和水按照体积比90:10混匀而成；

流速：1.0mL/min；

检测波长：250nm；

柱温：40℃；

进样体积：10μL；

混合溶剂：乙腈和含有磷酸盐及磷酸的水溶液按照体积比3:2混匀而成，磷酸盐的浓度为10mmol/L、磷酸的浓度为85ppm。

用液相色谱法分离测定利伐沙班及其有关物质的方法，包括以下步骤：

(1)样品的制备：分别称取利伐沙班对照品、乙酰草酰胺对照品、二-草酰胺-脲对照品、三胺对照品、脱氯化合物对照品、氧代邻苯二甲酰亚胺对照品、4,5-二氯化合物对照品、二胺对照品、苯胺基吗啉酮对照品、环氧代邻苯二甲酰亚胺对照品、1,1’-羰基二咪唑对照品、5-氯噻吩-2-羧酸对照品、羟基氨基邻苯二甲酰亚胺对照品、4-{4-[(5S)-5-(氨基甲基)-2-氧代-1,3-噁唑烷-3-基]苯基}吗啉-3-酮盐酸盐对照品各5mg，将各对照品分别溶于25mL混合溶剂中，得到对照品溶液，取各对照品溶液5mL混匀，并用混合溶剂稀释至200mL，得到样品；

(2)测定：以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，以流动相A及流动相B混合进行梯度洗脱，梯度洗脱表如下：

按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图。结果见附图3～4，图3中保留时间为18.7613min的色谱峰为利伐沙班，其余色谱峰为利伐沙班有关物质的色谱峰；图4为空白溶剂色谱峰。

附图3表明，在该色谱条件下，利伐沙班峰和各杂质峰可以完全分离，利伐沙班峰与前后相邻杂质峰的分离度分别为6.46及17.38，前后相邻杂质峰的保留时间分别为16.9470min及23.8416min。

溶液稳定性

取实施例1制备的样品，以实施例1中的方法，分别于0、1、2、4、6、8、10、12、24小时进样，考察供试品溶液的稳定性，结果如表1所示。由结果可见，利伐沙班及各杂质基本无变化，RSD均不大于5％，且无新杂质生成，说明本溶液在24小时内稳定。

表1供试品溶液的稳定性

耐用性

由于上述确定的色谱条件为梯度洗脱，并确定了相应的流速、柱温、85％磷酸的加入量和色谱柱型号，故将这些条件作相应的微调，考察色谱条件的耐用性。

流速变化在±0.05mL/min范围内，利伐沙班及有关物质的峰形没有变化，保留时间有相应的前移和后移，系统适用性符合要求，样品溶液杂质峰个数一致，所有杂质含量结果基本无变化；柱温变化在±2℃范围内，各物质的峰形和保留时间均无较大变化，系统适用性符合要求，样品溶液杂质峰个数一致，所有杂质含量结果基本无变化；磷酸的加入量的变化在±0.02ml范围内，各物质的峰形和保留时间也无较大变化，系统适用性符合要求，样品溶液杂质峰个数一致，所有杂质含量结果基本无变化；色谱柱的耐用性考察中，Thermo SCIENTIFIC、Agilent Microspher各物质保留时间和分离度均无较大变化，系统适用性符合要求，样品溶液杂质峰个数一致，所有杂质含量结果基本无变化；色谱柱耐用性良好。