一种精准可控双相色谱微柱的制作方法

本实用新型涉及色谱微柱，尤其是涉及可以实现同一根色谱微柱中精准可控地填充两种固定相材料，用于复杂生物样品在线二维分离的一种精准可控双相色谱微柱。

背景技术：

液相色谱是目前最为常用的用于实际生物样品分析的分离技术。近年来，随着高效液相色谱仪器的不断进步以及色谱填料技术的不断改进，液相色谱的分辨率有了很大的提升，然而即便是使用高效的色谱柱在非常缓的梯度下运行，液相色谱的峰容量都将达到一个理论峰容量在1400～1600之间的极限，对于高度复杂的生物样品来说单一分离模式的液相色谱的峰容量仍显不足。

多维分离是通过耦合不同模式的单维分离技术以构建更高分辨率的分离系统，理论上多维分离的峰容量为每一维峰容量的乘积，因此多维分离是进一步提高峰容量的有效方法。构建理想多维分离平台有两个标准，第一个标准是维与维之间必须是正交的，即每一个分离维度都是基于不同的分离机制对样品进行分离。在多维分离系统中，耦合正交的单维分离技术是获得高峰容量的一个先决条件。第二个标准是在后一个维度的分离中不能损失前一维已经获得的分辨率，即对第一维的样品不能采样过疏，样品在转移至下一维的过程中也不能出现区带展宽或返混的现象。

构建二维液相色谱分离平台最为直接的方法是将两种不同分离机理的色谱柱直接相连，传统的方法是将两根含有不同填料的色谱柱用连接管或者二通进行连接，将样品捕集在第一根柱子的柱头后使用台阶梯度以此洗脱，每一个洗脱的组分经第二根色谱柱分离后进入光学检测器或进行质谱检测。近些年还出现了一种多维蛋白鉴定技术(MudPIT)用于大规模蛋白质组学分析，即在同一根空毛细管中先后填充反相C18填料和强阳离子交换填料，这种含有两种固定相材料的双相色谱柱省去了柱间的连接管，减少了操作的繁琐性，同时降低了柱外峰展宽对于分离效率的影响。该多维蛋白鉴定技术对啤酒酵母全蛋白组进行分析鉴定出1484种蛋白质，充分展现了其在高通量蛋白组分析中的应用潜质。但传统的双相色谱柱由于无法将两种填料物理性地区隔开，无法分别精确控制两种填料柱床的长度，使得分离重现性难以保障。因此，研制一种精准可控的双相色谱微柱是这一技术领域的关键问题。

技术实现要素：

为了解决上述技术问题，本实用新型的目的在于提供可精确控制两种固定相柱床长度，有效解决分离重现性的问题，方法操作简单，使用方便，利于推广的一种精准可控双相色谱微柱。

本实用新型设有一根毛细管，毛细管内分别填充有两种色谱固定相，两种色谱固定相之间设有一个二氧化硅多孔微球作为填料定位点进行区隔，毛细管两端分别设有柱塞，所述柱塞为二氧化硅多孔微球。

所述毛细管可采用中空石英毛细管，所述毛细管的内径可为25～500μm。

本实用新型可采用以下方法制备：

1)截取所需长度的毛细管，根据所需两种固定相柱床长度在毛细管外标出填料定位点，将一颗多孔微球压入毛细管一端，然后将微球推至填料定位点；所述多孔微球可采用二氧化硅多孔微球；所述毛细管可采用中空石英弹性毛细管，毛细管的内径可为25～500μm；所述在毛细管外标出填料定位点可用记号笔在毛细管外标出填料定位点；所述将微球推至填料定位点可使用外径小于毛细管内径的石英丝将微球推至填料定位点。

2)将所要填充的色谱左固定相加入溶剂中，超声震荡制成匀浆，通过外力驱动使得匀浆通过毛细管，溶剂被填料定位点处的多孔微球滤过，填料本身则在毛细管中逐步堆砌成柱床；在填充完成后，毛细管一端压入一个同上述一致的多孔微球作为柱塞；所述左固定相可选自反相C18填料、阴离子交换填料、阳离子交换填料、亲水作用填料等中的一种。

3)将所要填充的第二种右固定相加入溶剂中，超声震荡制成匀浆，通过外力驱动从毛细管另一端进入毛细管中，待填充完成后，压入同样的多孔微球作为柱塞，从而完成整根两相色谱微柱的制备。所述右固定相可选自反相C18填料、阴离子交换填料、阳离子交换填料、亲水作用填料等中的一种。

在步骤2)和3)中，所述作为柱塞的多孔微球可采用二氧化硅多孔微球；所述溶剂可采用密度和黏度较大的有机溶剂，所述有机溶剂可选自二氧六环、环己烷、四氯化碳等中的一种；所述外力驱动可采用液流驱动或气流驱动；所述左固定相和右固定相可为同种色谱填料或不同种色谱填料。

本实用新型具有以下技术效果：

1)可以在同一根毛细管内精准可控地填充两段不同种类的色谱填料作为固定相，可精确控制两种固定相柱床长度。

2)本实用新型可用于毛细管液相色谱系统中，利用单颗粒多孔微球作为柱塞以及填料定位点，将两种不同材料的色谱固定相依次填充在同一毛细柱管中，可以实现对蛋白质、多肽等复杂生物样品的在线二维分离，大幅度提高对复杂生物样品的分辨能力，缩短实验所需时间，简化操作步骤，提高分离重现性。

3)集成化程度高，一根柱子内即可实现两种分离模式的串联，无需额外的连接装置。同时本实用新型利用单颗粒多孔微球作为柱塞和填料定位点，可以精准控制两种固定相的柱床长度，大幅度提高了多次实验间的分离重现性，提高分离效率。

4)方法操作简单，使用方便，利于推广。

附图说明

图1为本实用新型实施例的结构示意图。

图2为使用本实用新型得到的牛血清白蛋白酶解物二维分离(离子交换-反相)色谱图。

具体实施方式

以下结合图1和2详细说明本实用新型的几种可选实施例。

参见图1，本实用新型实施例设有一根中空石英毛细管1，毛细管1内分别填充有左固定相3和右固定相5两种色谱固定相，左固定相3和右固定相5之间设有一个二氧化硅多孔微球作为填料定位点4进行区隔，毛细管1两端分别设有柱塞2和6，所述柱塞2和6为二氧化硅多孔微球。

所述毛细管1的内径为25～500μm。

本实用新型可采用以下方法制备：

1)截取所需长度的毛细管，根据所需两种固定相柱床长度在毛细管外用记号笔标出填料定位点，将一颗多孔微球压入毛细管一端，然后使用外径小于毛细管内径的石英丝将微球推至填料定位点；所述多孔微球可采用二氧化硅多孔微球；所述毛细管可采用中空石英弹性毛细管，毛细管的内径可为25～500μm。

2)将所要填充的色谱左固定相加入溶剂中，超声震荡制成匀浆，通过外力驱动使得匀浆通过毛细管，溶剂被填料定位点处的多孔微球滤过，填料本身则在毛细管中逐步堆砌成柱床；在填充完成后，毛细管一端压入一个同上述一致的多孔微球作为柱塞；所述左固定相可选自反相C18填料、阴离子交换填料、阳离子交换填料、亲水作用填料等中的一种。

3)将所要填充的第二种右固定相加入溶剂中，超声震荡制成匀浆，通过外力驱动从毛细管另一端进入毛细管中，待填充完成后，压入同样的多孔微球作为柱塞，从而完成整根两相色谱微柱的制备。所述右固定相可选自反相C18填料、阴离子交换填料、阳离子交换填料、亲水作用填料等中的一种。

在步骤2)和3)中，所述作为柱塞的多孔微球可采用二氧化硅多孔微球；所述溶剂可采用密度和黏度较大的有机溶剂，所述有机溶剂可选自二氧六环、环己烷、四氯化碳等中的一种；所述外力驱动可采用液流驱动或气流驱动；所述左固定相和右固定相可为同种色谱填料或不同种色谱填料。

以下给出具体实施例。

实施例1：精准可控双相色谱微柱的制备

截取内径100μm，外径365μm的弹性石英毛细管15cm(河北永年锐沣色谱器件有限公司)，在距离一端出口10cm处用记号笔标出填料定位点，将毛细管一端置于盛有直径110μm的多孔二氧化硅微球(英国X-tec公司)的离心管中，将单颗多孔二氧化硅微球压入毛细管一端，然后使用外径为90μm的石英毛细管(河北永年锐沣色谱器件有限公司)在显微镜下将多孔二氧化硅微球推至填料定位点。

称取10mg粒径为5μm的C18反相硅胶键合填料(Waters公司)作为左固定相，将所取填料加入到1mL二氧六环中制备成匀浆，超声震荡使其充分混匀。取1mL所得匀浆装入湿法填柱机的匀浆罐中，将毛细管长端通过接头与匀浆罐出口相连。打开湿法填柱机的泵开关，在液流驱动下，匀浆罐中的匀浆被压入毛细管中，其中溶剂被位于填料定位点的多孔二氧化硅微球滤过，填料颗粒在柱管内逐步堆砌成柱床。待柱床增长至毛细管端口时，关闭湿法填柱机开关，取下毛细管，在端口处按上述同样方法压入一颗多孔二氧化硅微球作为柱塞。

将所得毛细管柱倒置使得短端空管与湿法填柱机相连，称取10mg粒径为5μm的强阳离子交换填料(Waters公司)作为右固定相，按上述同样方法制成匀浆后，在湿法填柱机的液流驱动下从短端填入，待填充完成后按上述方法在端口处压入一颗多孔二氧化硅微球作为柱塞。从而完成整根双相色谱微柱的制作。

实施例2：精准可控双相色谱微柱用于牛血清白蛋白酶解物的二维分离(强阳离子交换-反相)

将实施例1中所制备的双相色谱微柱安装在纳流液相色谱仪(美国Dionex公司)上，安装方向需使得液流先流经短端即强阳离子交换柱床，然后流经长端即反相柱床。配制1M的NaCl溶液，含有0.1％三氟乙酸的乙腈溶液和含有0.1％三氟乙酸的超纯水分别作为色谱流动相A、B、C，待系统压力平衡后，使用系统自带的自动进样器吸取样品20μL，将流动相流路设置为A+C，分别使用0％A，0.1％A，1％A，5％A，10％A，50％A，100％A的流动相配比(对应色谱图中NaCl浓度分别为PMD、1mM、10mM、50mM、100mM、500mM、1000mM)对样品进行台阶式等度洗脱，流速为300nL/min，每次洗脱10min。每进行一次洗脱后将流路切换至B+C，使用5％～40％B对柱床进行梯度洗脱，流速为300nL/min，每次洗脱60min洗脱后的溶液进入色谱柱后端紫外检测器进行检测，检测波长为214nm。所得色谱图如图2所示。