作物真菌孢子抗药性检测装置的制作方法

本实用新型涉及微生物领域，尤其涉及一种作物真菌孢子抗药性检测装置。

背景技术：

目前，针对孢子抗药性诊断技术尚未出现，病害处置具有较大的滞后性，给农作的高产带来了严重的打击。研究发现，随着农药的大量、广泛适应，抗性问题也随之产生。到目前为止，有各种作物真菌对农药均具有抗药性的报道。由于病害主要通过病菌的有性孢子在气流等方式中传播，因此，在空气中检测真菌孢子，判断农作物是否被病害侵染，对实现农作物早期诊断、预防具有重大的意义。

技术实现要素：

实用新型目的：为了解决现有技术的不足，本实用新型提供了一种作物真菌孢子抗药性检测装置与检测方法，能够简单直观地对孢子的抗药性能进行检测，并提高准确性。

技术方案：为解决上述技术问题，本实用新型中作物真菌孢子抗药性检测装置，该装置包括注射泵、微流控芯片、温控设备、CMOS图像传感器，所述微流控芯片上设置有单向反应通道，在该单向反应通道上依次设置有样品入口、缓冲液入口、染色剂溶液入口和反应物排出口，根据反应物的行进阶段将单向通道依次分为第一芯片反应区、第二芯片反应区、芯片检测区，所述样品入口和缓冲液入口通过微混合器接入第一芯片反应区，第一芯片反应区和染色剂溶液入口通过微混合器接入第二芯片反应区，第二芯片反应区与芯片检测区连接，反应物排出口设置在芯片检测区的末端；所述样品入口、缓冲液入口和染色剂溶液入口分别与装有相应物质的注射泵连接；所述样品入口至少有两组，其中一组作为孢子溶液入口，其余作为农药溶液入口；所述温控设备布设在所述微流控芯片周围为其供温、所述CMOS图像传感器对芯片检测区进行图像采集。

所述样品入口中各组的位置关系为：以孢子溶液入口的位置为中心轴，其余组中的样品入口为偶数个，且关于该中心轴对称。

有益效果：本实用新型中的作物真菌孢子抗药性检测装置利用微流控芯片为孢子提供反应区和反应检测区，操作简单，仅需将要检测的试剂量和孢子从设定好的入口注入，等待观测结果即可；该装置具备样品预处理功能，降低了整个检测过程的复杂度，不需专业人员操作和固定场所；利用微流控生物芯片和CMOS图像传感器相结合，提高孢子检测的准确性；通过设置多组样品入口不仅能实现检测孢子对单种药品不同浓度的抗药性，利用上述装置操作简单，还可同时检测孢子对多种药品的抗药性，避免重复性的操作，节约时间，并且提高了检测效率。

附图说明

图1是本实用新型中作物真菌孢子抗药性检测装置的结构示意图；

图2是微流控芯片的结构示意图；

图3是微流控芯片的微混合器的结构示意图；

图4是微流控芯片的芯片检测区在CMOS图像传感器检测目标显示示意图；

图5是本实用新型中作物真菌孢子抗药性检测方法的流程图；

图中，1为注射泵，2为微流控芯片，3为单片机，4为温控设备，5为CMOS图像传感器，6为上位机，7为电源，201为样品入口，202为缓冲液入口，203为染色剂溶液入口，204为微混合器，205为芯片反应区，206为芯片检测区，207为反应物排出口。

具体实施方式

下面结合实施例对本实用新型做进一步的详细说明。

图1中的作物真菌孢子抗药性检测装置，包括注射泵1、微流控芯片2、单片机3、温控设备4、CMOS图像传感器5、上位机6和电源7，注射泵1与微流控芯片2相连，用于完成对所需样品的进样任务；温控设备4、CMOS图像传感器5均位于微流控芯片2的周围，单片机3分别与温控设备4、CMOS图像传感器5以及上位机6相连，单片机3用于控制温控设备4的工作情况，保证孢子抗药性检测过程中可以达到检测环境所需的最佳温度，单片机3控制CMOS图像传感器5工作以及接收并存储CMOS图像传感器5传输过来的图片；单片机3将采集到的图片数据传输至上位机6上实时显示出来，便于检测者的观测；电源7与单片机3、上位机6以及注射泵1相连，电源7给这三者供电，保证其正常运行。

如图1和2所示，微流控芯片2上设置有单向反应通道，在该单向反应通道上依次设置有样品入口201、缓冲液入口202、染色剂溶液入口203和反应物排出口207，根据反应物的行进阶段将单向通道依次分为第一芯片反应区、第二芯片反应区、芯片检测区206，第一芯片反应区和第二芯片反应区统称为芯片反应区205，样品入口201、缓冲液入口202通过微混合器204接入第一芯片反应区，第一芯片反应区和染色剂溶液入口203通过微混合器204接入第二芯片反应区；第二芯片反应区与芯片检测区206连接，反应物排出口207设置在芯片检测区206的末端。其中，样品入口201采用Y型通道，Y型通道分别连接相应的注射泵，通过Y型通道进入的反应物也通过微混合器204接入单向反应通道，根据实验的需要样品入口201可分为N+1组，分别记为1-1号、1-2号、1-2，号、1-3号、1-3，号···1-N号、1-N，号，1-1号作为孢子溶液入口，其余各组作为农药溶液入口，且其余各组中的样品入口个数为偶数个，如图2所示，1-2号和1-2，号入口是关于1-1号相对称，依次类推，1-3号、1-3，号入口是关于1-1号相对称，以及1-N号、1-N，号入口关于-1号对称。样品号入口201与注射泵1相连，若根据实验需要设置有N组样品入口201，则各入口分别与装有不同物质的注射泵1对应相连，温控设备4放置在微流控芯片2的芯片反应区205的下方，CMOS图像传感器5放置于微流控芯片2的芯片检测区206的下方。

该芯片不仅能实现检测孢子对单种药品不同浓度的抗药性，还可同时实现检测孢子对多种药品的抗药性，从而实现检测对象多元化，自动化程度高。

如图3所示，为了增加混沌程度，提高混合效率，微流控芯片2上的微混合器204的扩散通道中放置按一定规律排列的长方形平板阻碍物以此增加对流。

如图4所示，微流控芯片2上的芯片检测区206采用弯曲通道形状，弯曲通道增加了芯片检测区206的长度，使得检测结果可以更好的呈现出来；本实用新型使用CMOS图像传感器5来观测孢子被侵染后的颜色，以此判断孢子的存活状态，方便检测结果的拍摄。

如图5所示，利用图1中的装置检测孢子对药品的抗药性时，包括以下步骤：

(1)将孢子原液和水分别从样品入口201的1-1号Y型通道两端注入，将农药和水分别从样品入口201的其他组Y型通道的两端注入，如1-2和1-2，号口，完成前期溶液配制混合的预处理工作；

(2)配制好的溶液(农药溶液和孢子溶液)经过微混合器204混合充分后进入第一芯片反应区进行持续预设时间的反应；

(3)将染色剂原液和水分别从染色剂溶液入口203的Y型通道两端注入，并进行充分混合，完成染色剂溶液的配制，后与通过农药侵染的孢子溶液进行混合；

(4)混合液(染色剂溶液和被农药侵染的孢子溶液的混合液)通过微混合器204的扩散通道进行完全混合，并在第二芯片反应区中进行染色，第二芯片反应区中混合通道的长度设置保证染色完全；

(5)当混合液混合完全并流至芯片检测区206时，利用CMOS图像传感器5检测已经完成染色的孢子，并将图片传送给单片机3，单片机3将采集到的图片数据传输至上位机6上实时显示出来。

同上述原理，利用图1中的装置检测孢子对一种药品不同浓度的抗药性时，相应的作物真菌孢子抗药性检测方法包括以下步骤：

(1)不同浓度农药溶液的配制以及与农药溶液与孢子的混合

1)在样品入口201的1-1号口Y型通道对应的注射泵中分别加入相应剂量的水和孢子，在1-2和1-2，号口Y型通道对应的注射泵中分别加入相应剂量的水和农药，在1-3和1-3，号口Y型通道对应的注射泵中分别加入相应剂量的水和农药，其中水和农药的比例按照实验需要进行设置，依次类推，直至完成需要检测的浓度组数；

在缓冲液入口202对应的注射泵中加入缓冲液；

在染色剂溶液入口203的Y型通道两侧样品入口对应的注射泵中分别按比例加入FDA和PI溶液(两者混合形成染色剂溶液)；

2)同时推动与样品入口201、缓冲液入口202和染色剂入口203相连的2(N+1)+1+2个注射泵，样品入口201的1-1号口经过微混合器204混合后流出的孢子溶液，其他组入口经过微混合器204混合后流出的不同浓度的农药，缓冲液入口202注入的是缓冲液，因通道的长度是等长的，所以各通道的混合液和缓冲液可同时流至样品入口201、缓冲液入口202连接点前部分，停止推动；

3)先推动与1-1号口连接的注射泵，设定注射液体体积为1ul，停止其他注射泵的注射，当该注射泵完成注射后停止注射，此时的孢子溶液是未经药液侵染的样品，其检测结果可与后面被药品侵染的孢子形成空白对照，以此判断该种药品哪种浓度的侵染能力最强；

启动缓冲液入口202的注射泵注射缓冲液，设定注射液体体积为0.1ul，当注射泵完成注射后停止注射；

同时推动与1-1号口、1-2号口和1-2，号口连接的注射泵，设定本次注射液体体积为1ul，注射任务完成后，停止注射，再次启动连接2号口的注射泵注射缓冲液，设定注射液体体积为0.1ul，注射任务完成后，停止注射，以此类推，直到N种(N的大小根据实验需要设置)浓度的药品均注射完毕得到不同浓度药品与孢子混合溶液。

(2)孢子溶液和农药溶液经过微混合器204混合充分后进入第一芯片反应区进行持续预设时间的反应。

1)被农药侵染的孢子溶液进入微混合器204，该过程保证孢子溶液和药品充分的混合，得到被药品侵染的孢子溶液。

2)农药溶液和孢子溶液的混合溶液进入第一芯片反应区反应，第一芯片反应区的长度保证了孢子浸染所需的时长(若时间不足，可整体调慢注射泵的进样速度来协调药品侵染孢子所需的时间长度)。

(3)染色剂溶液对被农药侵染的孢子进行染色。

当芯片中的液体流至染色剂溶液入口203前，连接染色剂溶液入口203的注射泵开始注射混合好的FDA-PI溶液。

(4)被农药侵染的孢子溶液和FDA-PI溶液的混合液在注射泵的推送下再次进入微混合器204，之后进入第二芯片反应区，FDA-PI溶液给已被不同浓度的同种药剂侵染过的孢子溶液进行染色。

孢子悬浮液经FDA单染后，在具有荧光检测功能让的CMOS图像传感器5下观察活孢子呈亮绿色荧光；茄病镰刀菌加热致死孢子悬浮液经PI单染后，死孢子发出红色荧光。将新鲜孢子与加热致死孢子混合，经FDA-PI双染后，在荧光显微镜下可见绿色和红色荧光区别清晰，说明用FDA-PI双荧光染色可以对孢子死活进行判断，其中活孢子呈绿色荧光，死亡孢子呈红色荧光。

(5)当孢子溶液被FDA-PI溶液完全浸染后，液体流至芯片检测区206，通过CMOS图像传感器5对显示区域进行拍摄，已经死亡的孢子呈现红色荧光，活的孢子呈现绿色荧光，所得图片传至上位机6显示，便于观察和判断孢子的活性，以此完成孢子对该种药品不同浓度的抗药性检测。

同上述原理，利用图1中的装置检测孢子对不同种药品的抗药性时，相应的作物真菌孢子抗药性检测方法与上述方法的步骤相同，唯一不同的是在步骤(1)中实现的是不同农药溶液的配制以及与孢子的混合。在对多种样品药液进行检测时，在样品入口2011-1号口的Y型通道两侧样品入口按比例分别加入相应剂量的水和孢子，在1-2和1-2，号口的Y型通道两侧样品入口分别按比例加入相应剂量的水和第一种药品，在1-3和1-3，号口添加分别按比例加入相应剂量的水和第二种药品，以此类推，得到需要的实验组数。

以上仅是本实用新型的优选实施方式，应当指出以上实施列对本实用新型不构成限定，相关工作人员在不偏离本实用新型技术思想的范围内，所进行的多样变化和修改，均落在本实用新型的保护范围内。