一株高效产紫杉醇内生真菌棘孢曲霉Tax‑6及其应用的制作方法

本发明涉及植物内生真菌产药技术领域，具体涉及一株高效产紫杉醇真菌棘孢曲霉tax-6及其应用。

背景技术：

癌症是21世纪威胁人类健康的三大杀手之一，据全国肿瘤登记中心调查显示，自2013年以来我国每年新发癌症病例超过300万人，因此寻找高效抗癌药物的任务也迫在眉睫。紫杉醇（taxol）最初是从红豆杉属（taxusspp.）植物中分离得到的一种具有独特抗癌作用的二萜类化合物，它作用于细胞微管，通过与微管蛋白n端第31位氨基酸和第217~231位氨基酸结合，诱导和稳定微管蛋白聚合，抑制其解聚，增加聚合速度，使维管束不能与微管组织中心相互连接，导致有丝分裂异常或停止，组织癌细胞增殖。它具有很高的开发利用价值，是目前世界主流的抗癌药物之一。

据who组织统计：世界癌症的年并发人数达到1000多万并还在以每年20%的速度递增，要治疗这些癌症患者每年需要4000~4600kg紫杉醇，而全世界每年可生产紫杉醇300~500kg，预计消耗红豆杉树皮越700t，即使全球红豆杉资源采伐完毕也仅能满足一时之需。因此寻求紫杉醇的新资源是目前研究的重点。

近20多年来，科研工作者先后开发出了以下几种紫杉醇获取的新途径：紫杉醇全合成、半合成，细胞培养和微生物发酵等。化学合成过程复杂，收率太低，不仅需要昂贵的化学试剂且反应难以控制，与工业要求相去甚远；而由于植物细胞遗传与生理的不稳定性、细胞间的不一致性使得在培养工程中高产细胞系不能实现高产率，而且易发生遗传变异产生其他代谢物，另外植物细胞培养技术复杂，对反应器要求高，阻碍了通过细胞培养工业化生产紫杉醇的实现。相较之下，1991年美国蒙大拿州立大学植物病理系化学家andrestierle博士从短叶红豆杉皮部分分离得到了一株能产紫杉醇的真菌taxomycesandreanae。紫杉醇野生菌的发现为紫杉醇资源提供了一种新途径。由于微生物可在发酵罐中进行，容易扩大生产，有利于实现工业化。因此，利用微生物发酵产紫杉醇被认为是最有可能一劳永逸的解决资源保护和降低医疗成本的方法。

自stierle博士开启了这扇大门以来，全世界大量的研究者投入到了此研究领域。1996年strobel等从西藏红豆杉中分离得到一株产紫杉醇的内生小孢拟盘多毛孢（pestalotiopsismicrospora），这种真菌产紫杉醇的量为50µg/l；以及尼泊尔盘端角（seimatoantleriumnepalense），其产量为62~80µg/l；从南方红豆杉中分离得到了一株瘤座菌属（tuberculariasp.）真菌，紫杉醇产量为185.4µg/l。产紫杉醇内生真菌的宿主广泛，目前全世界以获得了近百种产紫杉醇内生真菌，它被认为是最有希望实现紫杉醇资源可持续利用的方法之一。然而目前该技术的瓶颈在于筛选出的内生真菌产量偏低，达不到工业化生产的水平。

技术实现要素：

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一株新的高效产紫杉醇内生真菌棘孢曲霉tax-6。本发明的另一目的是提供一种利用该产产紫杉醇内生真菌棘孢曲霉tax-6液态发酵产紫杉醇的应用。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一株高效产紫杉醇内生真菌，其分类命名为棘孢曲霉tax-6（aspergillusaculeatinus）tax-6，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：m2016614，保藏日期为2016年11月3日，保藏地址为中国武汉武汉大学。

所述的产紫杉醇内生真菌棘孢曲霉tax-6在制备紫杉醇的应用。

所述的应用，制备紫杉醇的方法为液态发酵。

所述的应用，制备微生物油脂的原料为pda培养基。

所述的液态发酵为：从4℃冰箱中取出保存有aspergillusaculeatinustax-6的pda平板，于28℃生化培养箱中，活化菌种2-3天；在灭菌台上，向已活化过的平板中加无菌水，用接种针轻轻地将菌丝上孢子刮于无菌水中，混匀，无菌过滤，制成孢子悬液，用无菌枪头吸取孢子悬液，接种到含有100mlpdb液体培养基的250ml锥形瓶中，接种好的锥形瓶放置于120rpm、30℃摇床中培养。

所述的液态发酵培养优选6-12天，最优选7天。

所述的应用，从发酵液中提取紫杉醇的方法为：用四层纱布过滤发酵液取液体部分，加入正己烷萃取，保留水相；用等体积的二氯甲烷萃取发酵液中的紫杉醇，萃取数次，合并有机相；将得到的有机相蒸干得固体产物，用二氯甲烷溶解得到的固体产物，再蒸干后加入甲醇溶解获得紫杉醇甲醇溶液。其中，正己烷萃取一次，萃取20min。二氯甲烷萃取3次，每次30min。

棘孢曲霉tax-6是从安徽省曼地亚红豆杉树皮中分离筛选所得，如图5所示，菌株tax-6中心部分是黄褐色的孢子，周围一圈为白色的菌丝。孢子是单一、透明的球状，直径在40-50µm；分身孢子梗是平滑的圆柱形，直径为8-15µm。

提取棘孢曲霉tax-6菌株的基因组dna，使用真菌通用引物its1和its4进行pcr扩增，将得到的pcr碱基序列（seqidno.1所示）在ncbi数据库中进行同源序列分析，所得结果被鉴定为一株新的棘孢曲霉，命名为棘孢曲霉（aspergillusaculeatinus）tax-6。

有益效果：与现有技术相比，本发明的筛选出了一种全新的产紫杉醇内生真菌棘孢曲霉tax-6，通过液态发酵产紫杉醇，在培养7天之后紫杉醇的产量达到334.92µg/l，具有发酵培养周期短、产量高的优点，具有很好的工业化前景。本发明利用红豆杉内生真菌产紫杉醇，即低价获得了高效抗癌药物又保护了红豆杉这一珍稀物种，具有很好的实用性。

附图说明

图1是aspergillusaculeatinustax-6的发酵产物及紫杉醇标准品的hplc图；

图2是aspergillusaculeatinustax-6的发酵产物的hplc-ms图；

图3是紫杉醇标准品的hplc-ms图；

图4是aspergillusaculeatinustax-6的紫杉醇产量随培养时间变化结果图。

图5是aspergillusaculeatinustax-6在pda培养基上生长3天后的生长形态及扫面电镜图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

液态发酵培养：从4℃冰箱中取出保存有aspergillusaculeatinustax-6的pda平板于28℃生化培养箱中，活化菌种2-3天。在灭菌台上，向已活化过的平板中加20ml左右的无菌水，用接种针轻轻地将菌丝上孢子刮于无菌水中，混匀，无菌过滤，制成孢子悬液（约1×10⁷spores/ml）。用无菌枪头吸取2ml的孢子悬液接种到含有100mlpda固体培养基的250ml锥形瓶中，接种好的锥形瓶放置于120rpm、30℃摇床中培养。

紫杉醇的提取：用四层纱布过滤发酵液取液体部分，加入10ml正己烷萃取20min去除其中脂肪酸等杂质，保留水相。用等体积的二氯甲烷萃取发酵液中的紫杉醇，萃取3次每次30min，合并有机相。将得到的有机相用旋转蒸发仪于45℃下蒸干，用5ml二氯甲烷溶解粘在壁上的不溶物，将5ml二氯甲烷蒸干并加入1ml甲醇定容，最后的产物过微孔滤膜保存在液相瓶中。

aspergillusaculeatinustax-6的发酵产物及紫杉醇标准品的hplc图如图1所示，可以看出，aspergillusaculeatinustax-6的发酵产物（图a）在9.963±0.01min处有明显响应，与紫杉醇标准品（图b）的出峰时间一致，初步判断能产紫杉醇。

aspergillusaculeatinustax-6的发酵产物的液相色谱-质谱联用图谱，如图2所示，aspergillusaculeatinustax-6的发酵产物的液相色谱-质谱联用图谱显示，以na⁺轰击后，发酵产物和标准品（图3）具有一样的特征峰（（m+na）⁺=876），进一步说明aspergillusaculeatinustax-6可以产紫杉醇。

aspergillusaculeatinustax-6的紫杉醇产量随培养时间变化结果，如图4所示，可以看出，紫杉醇在第5天开始快速积累，并且在第7天达到最大值334.92µg/l之后呈现缓慢下降的趋势。而真菌生物质量呈现出一个缓慢上升最终逐渐趋于平稳的状态。

sequencelisting

<110>南京林业大学

<120>一株高效产紫杉醇内生真菌棘孢曲霉tax-6及其应用

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