本实用新型属于N端脑钠肽前体定量检测领域，具体涉及一种人全血中N端脑钠肽前体免疫层析定量试剂盒。
背景技术：
：N端脑钠肽前体(NT-proBNP)是由心室肌细胞合成和分泌的肽类激素，可以反映体内心肌细胞受到的容量负荷和压力负荷的大小，是一种对心血管疾病的诊断、治疗及预后评价具有重要价值的标志物。但目前在对人全血中NT-proBNP进行检测时，由于心肌细胞首先分泌pre-proBNP，pre-proBNP生成proBNP，proBNP再进一步分解成脑钠肽(BNP)和NT-proBNP。一般情况下，由于pre-proBNP和proBNP的非特异性影响，会造成NT-proBNP的非特异性检测，导致假阳性的出现，影响了NT-proBNP定量检测的准确性。技术实现要素：本实用新型的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种人全血中N端脑钠肽前体免疫层析定量试剂盒，与同类产品相比，具有特异性更高，操作简便，检测时间短，本底低，灵敏度高且线性范围较宽的特点。本实用新型解决其技术问题所采用的技术方案是：一种人全血中N端脑钠肽前体免疫层析定量试剂盒，包括试纸条和用于盛装含有吸附了抗BNP单克隆抗体的磁珠的稀释液的试剂瓶；所述试纸条包括背衬底板，该背衬底板上设置有硝酸纤维素膜、样品结合垫和吸水膜，该样品结合垫和吸水膜分别叠压在硝酸纤维素膜的两端上；该样品结合垫上包被有经标记处理的NT-proBNP单克隆抗体；该硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，该检测线包被有另一个表位的抗NT-proBNP单克隆抗体，该质控线包被有羊抗鼠IgG；所述背衬底板底部还设置有磁铁片，该磁铁片的位置与样品结合垫的位置相对应。一实施例中：所述磁珠为氨基磁珠或羧基磁珠。一实施例中：所述磁珠的粒径大小为400～800nm。一实施例中：所述抗BNP单克隆抗体的位点为1-32。一实施例中：所述经标记处理的NT-proBNP单克隆抗体的标记物为胶体金、荧光、量子点或有色乳胶。一实施例中：所述样品结合垫为玻璃纤维素膜或聚酯膜经含有表面活性剂的缓冲液浸泡处理后干燥而得。一实施例中：所述稀释剂为含有磷酸盐溶液、BSA、表面活性剂和所述吸附了抗BNP单克隆抗体的磁珠的稀释剂。本实用新型之中，除另有说明外，采用的设备、试剂、方法等均为常规技术。本技术方案与
背景技术：
相比，它具有如下优点：1.本实用新型的稀释液内含有吸附了抗BNP单克隆抗体(位点1-32)的磁珠，能够结合BNP、pre-proBNP和proBNP。样本用稀释液稀释后，样本中pre-proBNP和proBNP被磁珠捕获结合，然后加到试纸条的样品结合垫上；试纸条底部的磁铁片吸附磁珠，从而使得pre-proBNP和proBNP被固定在样品结合垫内，不会层析到T线，不影响NT-proBNP的检测，从而提高检测NT-proBNP的特异性，且操作简便，检测时间短，本底低，灵敏度高，线性范围宽。2.本实用新型采用一个样品结合垫代替传统的样品垫和结合垫，该样品结合垫上准确而均匀地分布有标记抗体，既能保证样品得到预处理，又能保证样品结合一定量的标记抗体，保证了定量反应的准确性，经检测，准确度和精密度良好；同时，也使得试纸条结构和制备过程得到简化。附图说明下面结合附图和实施例对本实用新型作进一步说明。图1为本实用新型的人全血中N端脑钠肽前体免疫层析定量试剂盒的示意图。图2为本实用新型的人全血中N端脑钠肽前体免疫层析定量试剂盒中试纸条的结构示意图。图3为proBNP分解成BNP和NT-proBNP的示意图。附图标记：试纸条A，样品结合垫1，NT-proBNP单克隆抗体2，检测线3，质控线4，吸水膜5，硝酸纤维素膜6，磁铁片7，背衬底板8；试剂瓶B。具体实施方式下面通过实施例具体说明本实用新型的内容：在本实用新型的描述中，需要理解的是，术语“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“横”、“竖”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系是基于附图中的立体图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本实用新型和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本实用新型的限制。实施例请查阅图1和图2，一种人全血中N端脑钠肽前体免疫层析定量试剂盒，包括至少一个试纸条A和至少一个试剂瓶B；所述试纸条A包括背衬底板8，该背衬底板8上设置有硝酸纤维素膜6、样品结合垫1和吸水膜5，该样品结合垫1和吸水膜5分别叠压在硝酸纤维素膜6的两端上；该样品结合垫1上包被有经胶体金、荧光、量子点或有色乳胶标记处理的NT-proBNP单克隆抗体2；该硝酸纤维素膜6上设有检测线3(T线)和质控线4(C线)，该检测线3(T线)包被有另一个表位的抗NT-proBNP单克隆抗体，该质控线4(C线)包被有羊抗鼠IgG；所述背衬底板8底部还设置有磁铁片7，该磁铁片7的位置与样品结合垫1的位置相对应。所述试剂瓶B内盛装有稀释液，该稀释液中含有磷酸盐溶液、BSA、表面活性剂和吸附了抗BNP单克隆抗体(位点1-32)的磁珠，该抗BNP单克隆抗体(位点1-32)能够结合BNP、pre-proBNP和proBNP。所述磁珠可选用氨基磁珠或羧基磁珠，磁珠的粒径大小以400～800nm为佳。上述试纸条可以通过以下制备方法制备：1)硝酸纤维素膜的处理将硝酸纤维素膜贴至背衬底板8的制定位置，取50mm的pH7.4磷酸盐缓冲液将另一个表位的抗NT-proBNP单克隆抗体稀释至1mg/ml，用于制备T线；另取羊抗鼠IgG抗体，用稀释液稀释至0.5mg/ml，用于制备C线；按1μl/cm划液量，通过biodot划膜仪将上述两种稀释后的抗体均匀的划至硝酸纤维素膜上制备T线和C线；将划好的硝酸纤维素膜放置于50℃干燥箱中，干燥过夜。2)荧光乳胶微球标记处理的NT-proBNP单克隆抗体的制备2-1)取10mg荧光微球液体置于合适大小的离心管中，加入4mlMES缓冲液，混匀；2-2)速度20000G、4℃下离心15min，倾倒上清；2-3)加入1mlMES缓冲液，超声重悬；超声时间2～3min，超声功率约为50％，在冰浴上进行；2-4)分别在5mgEDC和5mgNHS的离心管中加入各1mlMES，充分混匀后，立即进行2-5)和2-6)；2-5)向2-3)得到的溶液中加入配制好的NHS溶液0.14ml，混匀；2-6)向2-5)得到的溶液中加入配制好的EDC溶液0.032ml，混匀；2-7)37℃转盘旋转反应1h；2-8)速度20000G、4℃下离心15min，倾倒上清；2-9)加入4ml去离子水缓冲液，超声重悬；超声时间2～3min，超声功率约为50％，在冰浴上进行；2-10)速度20000G、4℃下离心15min，倾倒上清；2-11)重复步骤2-9)，2-10)。2-12)加入1mLHEPES缓冲液，超声重悬；超声时间2～3min，超声功率约为50％；2-13)按一定比例加入NT-proBNP单克隆抗体。抗体浓度大于5mg/ml时，用HEPES缓冲液稀释后加入；2-14)37℃转盘旋转反应2～12h，反应结束后请注意添加封闭缓冲液，封闭2h(封闭缓冲液含7.5％甘氨酸和10％BSA)；2-15)速度20000G、4℃下离心15min，倾倒上清；2-16)加入4mlHEPES缓冲液，超声重悬；超声时间2～3min，超声功率约为50％，在冰浴上进行；2-17)速度20000G、4℃下离心15min，倾倒上清；2-18)重复步骤2-16)，2-17)；2-19)加入4ml储存缓冲液，超声重悬；超声时间2～3min，超声功率约为50％，在冰浴上进行；2-20)转移至合适容器中，即得荧光乳胶微球标记处理的NT-proBNP单克隆抗体，抗体标识浓度5mg/ml。3)样品结合垫的处理玻璃纤维素膜用含有表面活性剂的缓冲液(配方：100mMPB(pH7.4)，其中含有2％NaCl，2％BSA、0.5％酪蛋白、0.1％T-20、0.5％S9和5％蔗糖)浸泡进行预封闭后，50℃干燥过夜；通过Biodot仪器的airjet喷头，将2)中得到的荧光乳胶微球标记处理的NT-proBNP单克隆抗体按照8μl/cm的量喷至干燥好的玻璃纤维素膜上，50℃干燥过夜。制备得到样品结合垫。4)组装将步骤3)得到的样品结合垫固定叠压在步骤1)得到的硝酸纤维素膜的一端，并将吸水膜固定叠压在硝酸纤维素膜的另一端，另在背衬底板底部与样品结合垫相应位置处粘接磁铁片，即得所述试纸条。上述稀释液可以通过以下制备方法制备：1)吸附抗BNP单克隆抗体的磁珠的处理取10mg磁珠，用4mlMES缓冲液混匀，用磁铁吸附后去除上清，反复3次；混匀；加入一定体积的鼠抗人BNP单克隆抗体(位点1-32)，混匀；震荡30min；加入5mg/ml的EDC，32ul，混匀；震荡6小时；加入封闭液；震荡12小时；用封闭液清洗3次，重悬在储存液中，即得吸附了抗BNP单克隆抗体(位点1-32)的磁珠。2)稀释液的配制配方：20mMPB(pH7.4)，其中含有1％NaCl，2％BSA、0.5％酪蛋白、0.1％T-20、0.5％S9和5％蔗糖。将1)中得到的吸附了抗BNP单克隆抗体(位点1-32)的磁珠，按照1:10～1:2000的比例加入至上述配方的溶液中，即得所述稀释液。将制得的稀释液盛装于试剂瓶中，然后将试纸条和试剂瓶放入试剂盒的盒体内，即得本实用新型的人全血中N端脑钠肽前体免疫层析定量试剂盒。本实用新型的人全血中N端脑钠肽前体免疫层析定量试剂盒可以有不同的规格，例如可以包括1个试纸条A和1个试剂瓶B，或者5个试纸条A和一个试剂瓶B，或者10个试纸条A和10个试剂瓶B，等等，并不以此为限。本实用新型的试剂盒利用双抗夹心法进行检测：样品先用稀释液处理，样品中pre-proBNP和proBNP被稀释液中的抗BNP单克隆抗体捕获结合，随后加样到试纸条上，在磁铁片的作用下，磁珠被吸附固定在样品结合垫，不会层析至检测线。而样品中的NT-proBNP与样品结合垫上荧光乳胶微球标记处理的NT-proBNP单克隆抗体结合，形成抗原-标记抗体复合物。经层析原理，依次与硝酸纤维素膜上的另一个表位的抗NT-proBNP单克隆抗体(T线)和羊抗鼠IgG抗体(C线)形成抗体-抗原-标记抗体复合物。在荧光分析仪的激发光激发下，标记元素显现荧光，结合的标记抗体越多，荧光强度越高，从而进行定量检测。实验例1.1标准曲线制作取NT-proBNP校准品一套，具体值见下表：编号C0C1C2C3C4C5C6浓度(ng/ml)00.10.52510201.2检测方法1.2.1取校准品80μl，与稀释液按1:1混合后，取80ul混合后的溶液加入试纸条中的样品结合垫；1.2.210分钟之后，用荧光定量分析仪定量检测荧光值。1.2.3每个校准品检测2次，取T/C值的平均值。具体结果见下表：1.3标准曲线制备根据上述检测结果，以T/C值的对数值为X轴，以浓度的对数值为Y轴进行线性回归。线性方程y＝0.7604x+0.2909，R2＝0.9949。2.准确性测试：配制0.5ng/mL、2ng/mL、5ng/mLNT-proBNP的校准品，加入proBNP使其终浓度为1ng/ml进行检测，并对未加入proBNP抗原的校准品进行检测，分别用含有磁珠和不含磁珠的样本稀释液进行检测。结果表明经过用含有预处理磁珠的稀释液处理的标本，检测结果受proBNP影响显著小于不含磁珠的稀释液。说明本发明可显著降低proBNP对NT-proBNP的检测影响。以上所述，仅为本实用新型较佳实施例而已，故不能依此限定本实用新型实施的范围，即依本实用新型专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本实用新型涵盖的范围内。当前第1页1 2 3