本发明属于分子生物技术技术，尤其涉及一种联合检测多种炎症生物标志物的方法及其试剂盒。
背景技术：
免疫荧光技术是利用荧光素标记的抗体(或抗原)检测组织、细胞或血清中的相应抗原(或抗体)的方法。由于荧光抗体具有安全、灵敏的特点，因此广泛应用在免疫荧光检测和流式细胞计数领域。目前常用的免疫荧光技术包括：放射免疫，酶联免疫，乳胶比浊，干式荧光免疫，时间分辨荧光免疫，化学发光免疫等等。化学发光免疫是目前最主流的免疫检测方法，检测原理通常为：将磁性微球作为固相材料偶联单克隆抗体(一抗)，与抗原反应后，加入酶标记的单克隆抗体(二抗)，充分反应后经洗涤、分离和纯化去除未反应的试剂。然后加入发光底物(发光显色剂)，在适当的孵育条件下，底物被酶催化显色。最后根据反应液整体发光强度判断抗原浓度，对单个项目进行定量测定。该方法检测速度快、灵敏度高，广泛应用在检验科中心实验室。但一方面，由于检测阶段须测定反应液的整体发光值，因此在抗原抗体反应阶段，需要加入过量的二抗试剂，来获得充分反应，进而在孵育之后要进行多步骤的洗涤和磁分离，来去除过量未反应的二抗试剂。这使得整个仪器结构复杂，成本变高，体机变大，检测速度变慢。另一方面，化学发光免疫仅能够使用血清作为测定样本，临床收集全血后还要进行血液分层和血清抽提，增加了临床使用的复杂程度和污染风险，无法在门急诊和基层医疗机构广泛开展。此外，采用化学发光免疫技术每次检测只能测定一个项目，无法实现多个项目的同时检测。
干式荧光免疫由于其操作方便，广泛应用。干式荧光免疫技术的方法通常为：全血或血清样本经过滤网后进入样品垫，样本中如有待测抗原，待测抗原首先在结合垫下与荧光素标记的单克隆抗体(一抗)结合，形成抗原-抗体*荧光素复合物，并靠毛细作用向测试线移动。测试线上固定有另一单克隆抗体(二抗)，当反应液层析至测试线时，可以进一步形成标记有荧光素的双抗夹心复合物，用相应波长的激光照射检测线上聚积的反应物产生荧光，从而进行定量测定。但采用干式荧光免疫检测时，由于固相液相反应本身存在更大的不确定性，而且反应物在测试线位置的堆积是有厚度的，而激光仅能把测试线表面的荧光素激发，因此干式荧光试条的批内精密度cv通常超过10％(cv＝同一个样本20次测定的标准差/平均值*100％)，即精密度不足，这限制了干式荧光免疫技术的应用。此外，干式试条每个测试都要有固相载体、nc膜、干式反应需要大量的抗体，因此试剂成本远高于液相的试剂(如化学发光免疫、悬浮阵列免疫等)。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种联合检测多种炎症生物标志物的方法及其试剂盒，旨在解决现有的炎症标志物的免疫检测方法，只能针对血清样本进行检测，而且检测时间长、操作复杂、价格高，且每个测试只能测定一个项目的问题。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明一方面提供一种联合检测多种炎症生物标志物的试剂盒，包括融血试剂、微球试剂和荧光试剂，
所述融血试剂中含有表面活性剂；
所述微球试剂包括直径不同的n种微球，所述n种微球上分别对应偶联n种炎症生物标志物的第一单克隆抗体，且所述第一单克隆抗体上标记有生物素，其中，n的取值范围为2～10的正整数；
所述荧光试剂包括所述n种炎症生物标志物的第二单克隆抗体，所述第二单克隆抗体上标记有荧光素，且所述第一单克隆抗体、所述第二单克隆抗体与抗原的结合位点不同。
以及，一种联合检测多种炎症生物标志物的方法，至少包括以下步骤：
提供全血样本、血清样本和如上述联合检测多种炎症生物标志物的试剂盒；
在所述血清样本中加入与所述n种炎症生物标志物对应的n种商业抗原，配置成梯度浓度的工作标准溶液，获取n种炎症生物标志物的浓度-荧光强度标准曲线；
在所述全血样本中加入融血试剂，进行融血孵育处理，得到融血样本；在所述融血样本中加入微球试剂和荧光试剂，经免疫反应获得待测样本；在与所述工作标准品相同的检测条件下，采用悬浮阵列荧光免疫分析仪对所述待测样本进行检测，将检测结果与所述浓度-荧光标准曲线进行比对，获得n种炎症生物标志物的浓度。
本发明提供的联合检测多种炎症生物标志物的试剂盒，以微球体积作为编码，在多个不同直径的的微球上分别偶联标记有生物素的n种炎症生物标志物的单克隆抗体(一抗)，当样本中有这些待测炎症生物标志物时，不同直径的微球分别捕捉不同的待测物，在加入标记有荧光素的n种炎症生物标志物的第二单克隆抗体后，微球上分别形成针对不同炎症生物标志物的双抗夹心反应物。采用悬浮阵列荧光免疫分析仪定量测定，通过对每种体积的微球逐个分析并累加计算结果，最终同时获得n种炎症生物标志物的定量测定结果。具体的，本发明提供的联合检测多种炎症生物标志物的试剂盒具有以下优点：
首先，可通过悬浮阵列荧光免疫分析仪实现n种炎症生物标志物的联合检测，且具有成本低、效率高、精密度高的优点。
其次，本发明提供的联合检测多种炎症生物标志物的试剂盒，可使用全血作为样本，反应过程在液相环境进行，无需多步的洗涤分离纯化，可以在不进行血清分离的前提下快速、方便、准确的进行炎症标志物的联合检测，填补了市场空白。
再次，本发明提供的联合检测多种炎症生物标志物的试剂盒，试剂制备核心原材料用量少，能够大幅降低检测成本。
本发明提供的联合检测多种炎症生物标志物的方法，基于联合检测多种炎症生物标志物的试剂盒的工作原理，具有以下优点：
第一，本发明可以以全血为样本检测，操作方便、检测快速，且能够一站式完成多个炎症标志物项目的检测，使炎症生物标志物的检测水准提高了一个台阶。
第二，在检测阶段针对每个微球进行定量测定，之后将结果累加，因此不需要对微球进行洗涤和分离步骤，具有设备成本更低、体机更小的优点。以同时实现三个炎症生物标志物的检测为例，悬浮阵列免疫技术使用的微球和抗体数量大概是现有化学发光技术的一半、干式荧光免疫技术的十分之一，此外，还能大幅降低外包材的包装成本，因此，本发明具有明显的成本优势。
第三，本发明基于悬浮阵列免疫技术采用双抗夹心的液相反应，精密度达到现有免疫测试的最高水平，cv<5％。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
本发明实施例提供了一种联合检测多种炎症生物标志物的试剂盒，包括融血试剂、微球试剂和荧光试剂，
所述融血试剂中含有表面活性剂；
所述微球试剂包括直径不同的n种微球，所述n种微球上分别对应偶联n种炎症生物标志物的第一单克隆抗体，且所述第一单克隆抗体上标记有生物素，其中，n的取值范围为2～10的正整数；
所述荧光试剂包括所述n种炎症生物标志物的第二单克隆抗体，所述第二单克隆抗体上标记有荧光素，且所述第一单克隆抗体、所述第二单克隆抗体与抗原的结合位点不同。
本发明实施例提供的联合检测多种炎症生物标志物的试剂盒，以微球体积作为编码，在多个不同直径的的微球上分别偶联标记有生物素的n种炎症生物标志物的单克隆抗体(一抗)，当样本中有这些待测炎症生物标志物时，不同直径的微球分别捕捉不同的待测物，在加入标记有荧光素的n种炎症生物标志物的第二单克隆抗体后，微球上分别形成针对不同炎症生物标志物的双抗夹心反应物。采用悬浮阵列荧光免疫分析仪定量测定，通过对每种体积的微球逐个分析并累加计算结果，最终同时获得n种炎症生物标志物的定量测定结果。具体的，本发明实施例提供的联合检测多种炎症生物标志物的试剂盒具有以下优点：
首先，可通过悬浮阵列荧光免疫分析仪实现n种炎症生物标志物的联合检测，且具有成本低、效率高、精密度高的优点。
其次，本发明实施例提供的联合检测多种炎症生物标志物的试剂盒，可使用全血作为样本，反应过程在液相环境进行，无需多步的洗涤分离纯化，可以在不进行血清分离的前提下快速、方便、准确的进行炎症标志物的联合检测，填补了市场空白。
再次，本发明实施例提供的联合检测多种炎症生物标志物的试剂盒，试剂制备核心原材料用量少，能够大幅降低检测成本。
本发明实施例中，所述融血试剂中含有表面活性剂，用于破坏全血样本内的血细胞的细胞膜，以去除血细胞对于检测系统的干扰，实现全血样品的检测。具体的，所述融血试剂包括融血试剂浓缩液和融血试剂稀释液，其中，所述融血试剂浓缩液作为功能液，主要用于破坏全血样本内的血细胞的细胞膜；所述融血试剂稀释液用于稀释全血样本，为所述融血试剂浓缩液的工作做准备。进一步的，所述融血试剂浓缩液和所述融血试剂稀释液的体积比为(1:20)～(1:5)，即所述融血试剂浓缩液与所述融血试剂稀释液按照体积比(1:20)～(1:5)配置成成品融血试剂。该合适的体积比，能够充分有效地分散全血样本中的血细胞，进而有利于充分、高效地破坏全血样本内的血细胞的细胞膜，去除血细胞对于检测系统的干扰。
优选的，以所述融血试剂浓缩液的总重量为100％计，所述融血试剂浓缩液包括质量百分含量如下的下列组分：
合适的融血试剂浓缩液的组分和含量，有利于全血样本中血细胞的破坏，同时，不增加后处理难度(不引入新的影响因素)，从而保证测试结果的准确度。
进一步优选的，所述表面活性剂为十二烷基硫酸钠，所述防腐剂为proclin300。优选的融血试剂浓缩液，具有更好的融血效果，从而将血细胞对检测结果的干扰降到最低，提高检测的准确度。
本发明实施例中，所述融血试剂稀释液采用200mm的pbs缓冲液，且含有质量百分含量为0.9％氯化钠，所述融血试剂稀释液ph在7-9之间，有利于全血样本中血细胞的充分分散，进而有助于所述表面活性剂将其破坏。
本发明实施例中，所述微球试剂包括直径不同的n种微球，即本发明实施例通过对微球的体积进行编码，将不同的炎症生物标志物与微球的体积对应，区分不同炎症生物标志物的检测结果。优选的，n种微球中直径较大的微球数量少于直径较小的微球数量(直径较大的微球可偶联的抗体数量相对较多)，如当n为3时，3种微球的数量按照直径从大到小的比例优选为1:50:100。所述微球为能够偶联炎症生物标志物的抗体的微球，即所述微球上含有能够偶联炎症生物标志物的抗体的修饰结构，具体的，所述微球上的修饰结构与抗体上的生物素偶联。优选的，所述微球选自链霉素修饰的聚苯乙烯微球、羟基或氨基修饰的高分子微球、羟基或氨基修饰的金属微球中的一种。优选的所述微球，不仅能够牢固偶联炎症生物标志物的抗体，而且在检测过程中不会引入其他影响检测准确性和时效性的因素，提高了检测的准确度和效率。
本发明实施例中，n的取值范围为2～10的正整数，即所述联合检测多种炎症生物标志物的试剂盒可以同时实现2～10炎症生物标志物的检测。进一步优选的，所述n的取值范围为2～5的正整数，且所述炎症生物标志物选自c反应蛋白、降钙素原、血清淀粉样蛋白a、白介素、脂蛋白相关磷脂酶a2。作为一个具体实施例，所述试剂盒联合检测c反应蛋白、降钙素原、血清淀粉样蛋白a，分别在三种不同体积的微球表面偶联针对c反应蛋白、降钙素原、血清淀粉样蛋白a的两种单克隆抗体。
作为一种实施方式，所述微球试剂可以通过下述方法制备。具体的，所述微球试剂的制备方法包括以下步骤：
预处理：提供微球悬液，用ems缓冲液稀释后离心处理，去上清液，收集微球；
活化：对微球进行活化处理，得到活化微球；
偶联：提供第一单克隆抗体溶液与所述活化微球混合，得到第一单克隆抗体偶联微球；
封闭：在所述第一单克隆抗体偶联微球进行封闭处理；
淬灭：在封闭后的所述第一单克隆抗体偶联微球进行淬灭，作为微球试剂浓缩液储存备用。
采用上述步骤完成不同体积微球(对应不同炎症生物标志物)的微球试剂，然后进行混合处理。
作为一个具体实施例，以c反应蛋白、降钙素原、血清淀粉样蛋白a作为检测对象，联合检测c反应蛋白、降钙素原、血清淀粉样蛋白a的试剂盒的微球试剂的制备方法包括以下步骤：
预处理：按需取一定体积的原材料微球悬液，用0.1-0.5m的mes缓冲液(ph为5.5-6.5)稀释10倍，在10000g室温离心10分钟，去上清，加入稀释后等体积的上述mes缓冲液，涡旋1分钟，在10000g室温离心10分钟，去上清备用。
活化：在微球中加入等体积的含有浓度为200-400mg/ml的edc和200-400mg/ml的nhs的上述mes缓冲液，涡旋1分钟，室温摇匀30-60分钟，在10000g室温离心10分钟，去上清得到活化微球。
偶联：加入等体积的含有第一单克隆抗体(抗体投入量按照每g微球投入5-20mg抗体计算)的pbs缓冲液(200mm的pbs缓冲液，含有质量百分含量为0.9％的氯化钠，ph在7-9之间)，将抗体溶液与活化后的微球混合，涡旋1分钟，36℃恒温混匀18-24小时，在10000g室温离心10分钟，去上清备用。
封闭：加入等体积的pbs缓冲液(200mm的pbs缓冲液，含有0.9wt％氯化钠、0.5wt％bsa，ph在7-9之间)，与偶联后的微球混合，涡旋1分钟，36℃恒温混匀18-24小时，在10000g室温离心10分钟，去上清备用。
淬灭：加入等体积pbs缓冲液(200mm的pbs缓冲液，含有0.9wt％氯化钠，含有0.1m甘氨酸，ph在7-9之间)，与偶联后的微球混合，涡旋1分钟，36℃恒温混匀4-6小时,在10000g室温离心10分钟，去上清，加入含0.5wt％bsa、0.02-0.05wt％tween80、0.05-0.1wt％的pc300的pbs缓冲液(200mm的pbs缓冲液，含有0.9wt％氯化钠，ph在7-9之间)，作为微球试剂浓缩液储存备用。
分别完成c反应蛋白、降钙素原、血清淀粉样蛋白a的微球试剂浓缩液按照一定比例混合(例如按照降钙素原微球数：血清淀粉样蛋白a微球数：c反应蛋白微球数为1:50:100)，调配后获得微球试剂浓缩液半成品，稀释100-400倍获得成品微球试剂。
本发明实施例中，所述荧光试剂包括所述n种炎症生物标志物的第二单克隆抗体，所述第二单克隆抗体上标记有荧光素，但所述第一单克隆抗体、所述第二单克隆抗体不同，即，第二单克隆抗体连接抗原的位点与微球试剂中所使用的第一单克隆抗体连接抗原的位点不同，以保证形成双抗夹心的反应结构。本发明实施例形成双抗夹心的反应结构，才能保证抗原被偶联有所述第一单克隆抗体的微球捕获后，带有荧光素的所述第二单克隆抗体作为信号标志与抗原连接。所述荧光素作为信号标记物，采用可被检测系统检测的荧光素，荧光素的选择具体没有严格限制。
所述荧光试剂的制备方法如下：先分别检测不同项目的单克隆抗体进行单独标记，再将两种半成品按比例混合得到成品，具体包括预处理、标记、淬灭、纯化、混合五个阶段。
作为一个具体实施例，以c反应蛋白、降钙素原、血清淀粉样蛋白a作为检测对象，联合检测c反应蛋白、降钙素原、血清淀粉样蛋白a的试剂盒的荧光试剂的制备方法包括以下步骤：
预处理：用100mm的pbs缓冲液(ph＝7-9)置换原材料抗体溶液的溶剂，可采用超滤、透析等方法完成，最终将抗体溶液的浓度定容到5mg/ml备用。
标记：按需取一定体积的抗体溶液，用pbs缓冲液(200mm的pbs缓冲液，含有0.9wt％氯化钠，ph在7-9之间)稀释5-10倍，加入适量荧光素溶液(荧光素分子与抗体分子的摩尔比不低于100:1)，避光室温混匀18-24小时。
淬灭：按照等体积加入含有1m甘氨酸的pbs缓冲液(200mm的pbs缓冲液，含有0.9wt％氯化钠，ph在7-9之间)，室温避光静置4小时。
纯化：淬灭后的溶液，对pbs缓冲液(200mm的pbs缓冲液，含有0.9wt％氯化钠，ph在7-9之间)，按照1:1000体积透析48小时，每8小时更换透析液，透析后的荧光试剂浓缩液避光储存备用。
混合：分别完成ctni和nt-probnp的荧光试剂浓缩液按照一定比例混合(例如按照ctni抗体摩尔数比nt-probnp抗体摩尔数为1:1)，调配后获得荧光试剂浓缩液半成品，稀释50-200倍获得成品荧光试剂。
相应的，本发明实施例提供了一种联合检测多种炎症生物标志物的方法，至少包括以下步骤：
s01.提供全血样本、血清样本和如上述联合检测多种炎症生物标志物的试剂盒；
s02.在所述血清样本中加入与所述n种炎症生物标志物对应的n种商业抗原，配置成梯度浓度的工作标准溶液，获取n种炎症生物标志物的浓度-荧光强度标准曲线；
s03.在所述全血样本中加入融血试剂，进行融血孵育处理，得到融血样本；在所述融血样本中加入微球试剂和荧光试剂，经免疫反应获得待测样本；在与所述工作标准品相同的检测条件下，采用悬浮阵列荧光免疫分析仪对所述待测样本进行检测，将检测结果与所述浓度-荧光标准曲线进行比对，获得n种炎症生物标志物的浓度。
本发明实施例提供的联合检测多种炎症生物标志物的方法，基于联合检测多种炎症生物标志物的试剂盒的工作原理，具有以下优点：
第一，本发明实施例可以以全血为样本检测，操作方便、检测快速，且能够一站式完成多个炎症标志物项目的检测，使炎症生物标志物的检测水准提高了一个台阶。
第二，在检测阶段针对每个微球进行定量测定，之后将结果累加，因此不需要对微球进行洗涤和分离步骤，具有设备成本更低、体机更小的优点。以同时实现三个炎症生物标志物的检测为例，悬浮阵列免疫技术使用的微球和抗体数量大概是现有化学发光技术的一半、干式荧光免疫技术的十分之一，此外，还能大幅降低外包材的包装成本，因此，本发明实施例具有明显的成本优势。
第三，本发明实施例基于悬浮阵列免疫技术采用双抗夹心的液相反应，精密度达到现有免疫测试的最高水平，cv<5％。
具体的，上述步骤s01中，所述全血样本、所述血清样本均为离体的血样本。联合检测多种炎症生物标志物的试剂盒如上文所述，为了节约篇幅，此处不再赘述。
上述步骤s02中，获取血清样本n种炎症生物标志物对应的浓度-荧光强度标准曲线。具体的，在所述血清样本中加入与所述n种炎症生物标志物对应的n种商业抗原，配置成梯度浓度的工作标准溶液，采用悬浮阵列荧光免疫分析仪对所述工作标准溶液进行检测，获取n种炎症生物标志物的相对浓度-荧光标准曲线；采用人血清为基质的标准品对所述相对浓度-荧光标准曲线进行定标，分别获得n种炎症生物标志物的浓度-荧光标准曲线。进一步的，采用人血清为基质的标准品对所述相对浓度-荧光标准曲线进行定标，包括采用人血清为基质的n种标准品分别对n种炎症生物标志物对应的相对浓度-荧光标准曲线进行定标。其中，所述人血清为基质的标准品的选择，主要包括两种情形。对于有国际标准参考物的c反应蛋白、血清淀粉样蛋白a项目，用国际标准物质对相对值标准曲线进行校准，获得最终的定量检测用标准曲线；对于没有国际标准参考物的降钙素原，以罗氏combas441电化学发光免疫分析仪和配套试剂对以健康人血清为基质的自配降钙素原样本反复测定20次进行赋值，然后用该赋值后的校准品对相对值标准曲线定标确定最终的标准曲线。
上述步骤s03中，在所述全血样本中加入融血试剂，破坏血细胞膜，避免血细胞对检测带来的干扰。优选的，采用所述融血试剂将所述全血样本稀释10-30倍，在37℃条件下恒温孵育1-5min，有利于充分有效地破坏血细胞膜。进一步的，在所述融血样本中加入微球试剂和荧光试剂，经免疫反应获得具有双抗夹心的反应结构的待测样本。优选的，所述微球试剂和所述荧光试剂的体积比为1:1，所述免疫反应的条件为37℃条件下恒温孵育2-15min。在与所述工作标准品相同的检测条件下，采用悬浮阵列荧光免疫分析仪对所述待测样本进行检测，将检测结果与所述浓度-荧光标准曲线进行比对，获得n种炎症生物标志物的浓度。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。