本发明涉及化学分析
技术领域：
，具体涉及一种玻璃酸钠分子量和分子量分布的检测方法。
背景技术：
：玻璃酸钠(sodiumhyaluronate,sh)是由(1y4)-o-b-d-葡糖醛酸-(1y3)-2-乙酰氨基-2脱氧-b-d-葡萄糖双糖单位重复连接构成的糖胺聚糖的钠盐，为酸性粘多糖。sh可用做眼科的保护剂及关节腔内注射剂，具有较高的临床价值，sh还用于软组织修复和作为药物载体等，特别是在预防和减少外科术后粘连中取得了较大进展。sh的上述各功能与其相对分子质量大小密切相关。sh的临床疗效与其分子质量紧密相关，不同用途具有不同的分子量范围，用于滴眼剂、骨科、眼科手术和药用辅料的重均分子量及分子量分布分别有不同的规定。所以分子量控制就成为sh质控的重要指标，也是难点和重点。用于玻璃酸钠分子量测定的方法主要有特性黏度法，体积排阻色谱法(sec法)，激光散射-凝胶渗透色谱联用法(sec-malls法)。sec法是国内外药典普遍采用的分子质量控制方法，目前局限于采用示差检测器(rid)，用0.2mol/l氯化钠溶液为流动相，示差检测器(rid)受环境影响较大，数据采集比较苛刻，检测分子量存在结果稳定性差和重复性差的缺陷。应用多角度激光光散射仪比较昂贵，难以普及使用。cn105548420a公开了一种mops(3-(n-吗啉)丙磺酸，3-(n-morpholino)propane-sulfonicacid)的的检测方法，该方法以高效液相色谱法进行检测，采用线性归一法对mops进行定量，色谱柱为acclaimtrinityp1，虽然此高效液相色谱法也采用电喷雾检测器，但是其是一种检测微量mops的方法，目的是克服现有技术不能检测微量mops残留的缺陷，能够检测出hpv疫苗成品中mops残留量，提高检测精密度、检测灵敏度和准确性。cn106290614a公开了一种医用透明质酸钠凝胶中透明质酸钠重均分子量和分子量分布系数的检测方法。首先，精密量取药物制剂溶液适量，加流动相稀释成所需浓度的供试液，摇匀，进样，记录色谱图。另取聚苯乙烯磺酸钠对照品，同法测定，用gpc软件绘制校准曲线，使用普适校正法即得。行业标准中采用激光散射-凝胶渗透色谱联用法测定医用透明质酸钠凝胶中透明质酸钠重均分子量和分子量分布系数，因多角度激光光散射仪比较昂贵，难以普及使用。利用此方法检测，使用的仪器普遍性强，测定成本低，结果准确、可靠、稳定性良好。但其使用的仍然是示差检测器(rid)数据采集比较苛刻，检测分子量存在结果稳定性差和重复性差的缺陷。技术实现要素：针对现有技术中存在的问题，本发明的目的之一是提供一种可以对玻璃酸钠分子量及分子量分布进行有效分析的方法，具有良好的结果稳定性和检测重复性。可以克服示差检测器(rid)受环境影响较大的缺点，为玻璃酸钠分子量及分子量分布检测方法提供依据。为达此目的，本发明采用如下技术方案：本发明提供一种玻璃酸钠分子量和分子量分布的检测方法，包括如下步骤：(1)制备供试品溶液：称取玻璃酸钠供试品，用流动相将其稀释成玻璃酸钠浓度为0.9-1.1g/l的溶液，作为供试品溶液；(2)制备对照品溶液：取聚苯乙烯磺酸钠系列对照品pss140k、pss280k、pss1m和pss2m，用流动相将其稀释成浓度为0.9-1.1g/l的溶液，作为对照品溶液；(3)采用液相色谱系统，取所述对照品溶液90-110μl进样，例如90μl、92μl、95μl、98μl、100μl、102μl、105μl、108μl或110μl等，用电喷雾检测器进行检测，记录色谱图i；再取所述供试品溶液90-110μl进样，例如90μl、92μl、95μl、98μl、100μl、102μl、105μl、108μl或110μl等，用电喷雾检测器进行检测，记录色谱图ii，用gpc软件绘制校正曲线，使用普适校正法，对照品的k值为0.0018，α值为0.65；玻璃酸钠的k值为.00057，α值为0.75；计算结果，得到玻璃酸钠的分子量和分子量分布系数；所述流动相为90-110mol/l的醋酸铵水溶液，例如mol/l、9mol/l、95mol/l、98mol/l、100mol/l、102mol/l、105mol/l、108mol/l或110mol/l等。本发明采用了电喷雾检测器(cad)测定玻璃酸钠分子量及分子量分布的方法，对玻璃酸钠分子量及分子量分布进行有效分析，供试品溶液和对照品溶液的浓度均为1g/l，具有良好的检测稳定性和重复性。解决了示差检测器(rid)受环境影响较大，平衡时间长，检验效率低的问题。为获得玻璃酸钠分子量及分子量分布准确的结果提供有效检测分析技术手段。现有技术中上没有公开过用电喷雾检测器代替示差检测器进行玻璃酸钠分子量及分子量分布的技术方案，例如cn105548420a公开了一种mops(3-(n-吗啉)丙磺酸，3-(n-morpholino)propane-sulfonicacid)的的检测方法，该方法以高效液相色谱法进行检测，采用线性归一法对mops进行定量，色谱柱为acclaimtrinityp1，虽然此高效液相色谱法也采用电喷雾检测器，但是其是一种检测微量mops的方法，目的是克服现有技术不能检测微量mops残留的缺陷，能够检测出hpv疫苗成品中mops残留量，提高检测精密度、检测灵敏度和准确性。本申请不是对含量的测定，而是针对玻璃酸钠分子量和分子量分布的检测方法，针对的待测物是玻璃酸钠，与上述mops的含量检测属于完全不同的技术问题。由于玻璃酸钠属于糖类，既无紫外吸收又不产生荧光，故现有检测玻璃酸钠分子量及分子量分布的技术目前局限于采用示差检测器，没有公开过用电喷雾检测器代替示差检测器进行玻璃酸钠分子量及分子量分布的技术方案。优选地，所述液相色谱系统中的色谱柱为shodex8.0mm×300mm凝胶色谱柱。为进一步提高准确度，优选地，所述供试品溶液中玻璃酸钠的浓度为0.98-1.02g/l，例如0.98g/l、0.99g/l、1.00g/l、1.01g/l或1.02g/l等。优选地，所述对照品溶液的浓度为0.98-1.02g/l，例如0.98g/l、0.99g/l、1.00g/l、1.01g/l或1.02g/l等。优选地，所述对照品溶液和供试品溶液的进样量各自独立地为95-105μl。为进一步提高样品的分离效果，优选地，所述流动相为98-102mol/l的醋酸铵水溶液。优选地，所述液相色谱系统中的蒸发管温度为50℃。优选地，所述液相色谱系统的液相采集频率在4-5hz，例如4hz、4.2hz、4.5hz、4.8hz或5hz等。优选地，所述液相色谱系统中的液相流速为0.5ml/min。优选地，所述液相色谱系统中的柱温为35℃。优选地，步骤(1)所述供试品溶液在1-5℃下震荡8-12h，充分溶解。作为本发明优选的技术方案，所述的玻璃酸钠分子量和分子量分布的检测方法包括如下步骤：(1)制备供试品溶液：称取玻璃酸钠供试品用流动相稀释成玻璃酸钠浓度为1g/l的溶液，在1-5℃下震荡8-12h，作为供试品溶液；(2)制备对照品溶液：取聚苯乙烯磺酸钠系列对照品pss140k、pss280k、pss1m和pss2m，用流动相稀释成浓度为1g/l的溶液，作为对照品溶液；(3)采用液相色谱系统，取所述对照品溶液100μl进样，用电喷雾检测器进行检测，记录色谱图i；再取所述供试品溶液100μl进样，用电喷雾检测器进行检测，记录色谱图ii，用gpc软件绘制校正曲线，使用普适校正法，对照品的k值为0.0018，α值为0.65；玻璃酸钠的k值为.00057，α值为0.75；计算结果，得到玻璃酸钠的分子量和分子量分布系数；所述液相色谱系统中的色谱柱为shodex8.0mm×300mm凝胶色谱柱；柱温为35℃；蒸发管温度为50℃；液相采集频率在4-5hz；时间常数为3.6s；液相流速为0.5ml/min；流动相为100mol/l的醋酸铵水溶液。与现有技术方案相比，本发明至少具有如下有益效果：1.本发明采用了电喷雾检测器(cad)代替现有技术中的示差检测器测定玻璃酸钠分子量及分子量分布，具有良好的检测稳定性和重复性，解决了示差检测器(rid)受环境影响较大的缺点，为获得玻璃酸钠分子量及分子量分布准确的结果提供有效检测分析技术手段；2.通过选择电喷雾检测器配合合适的色谱条件，进一步提高检测稳定性和重复性。附图说明图1为实施例1不同分子量pss对照品cad分析图谱；图2为实施例1用cad检测器所得pss对照品分子量m与保留时间tr的标准曲线；图3为实施例1用cad检测器采集分子量152000pss对照品重复性曲线；图4为实施例1用cad检测器采集玻璃酸钠s1-s3分析谱图。具体实施方式下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。但下述的实施例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。实施例1一种玻璃酸钠分子量和分子量分布的检测方法，包括如下步骤：(1)制备供试品溶液：称取玻璃酸钠供试品用流动相稀释成玻璃酸钠浓度为1g/l的溶液，在4℃下震荡12h，作为供试品溶液；(2)制备对照品溶液：取聚苯乙烯磺酸钠系列对照品pss140k、pss280k、pss1m和pss2m(分子量分别为15.2万、25.8万、113.7万、226.7万)，用流动相稀释成浓度为1g/l的溶液，作为对照品溶液；(3)色谱条件建立：所述液相色谱系统中的色谱柱为shodex8.0mm×300mm凝胶色谱柱；柱温为35℃；蒸发管温度为50℃；液相采集频率在4hz；时间常数为3.6s；液相流速为0.5ml/min；流动相为100mol/l的醋酸铵水溶液。测定：取所述对照品溶液100μl进样，用电喷雾检测器进行检测，记录色谱图；再取所述供试品溶液100μl进样，用电喷雾检测器进行检测，记录色谱图，用gpc软件绘制校正曲线，使用普适校正法，对照品的k值为0.0018，α值为0.65；玻璃酸钠的k值为.00057，α值为0.75；计算结果，得到玻璃酸钠的分子量和分子量分布系数。为分析重复性，用如上相同方法检测s1、s2、s3三个样品。表1为用cad检测器不同分子量pss对照品保留时间。表1分子量m保留时间tr，min226700015.48113700016.2425800017.8215200018.55表2用rid检测器不同分子量pss对照品保留时间。表2分子量m保留时间tr，min226700015.44113700016.2625800017.7215200018.58表3为玻璃酸钠s1-s3分子量分析结果。表3样品s1s2s3峰顶处保留时间(tr,min)14.7614.6814.84数均分子量(numberaveragemn)196572620185111982064重均分子量(weightaveragemw)943685097946569327296z均分子量zaveragemz295298453059193328587028z+1均分子量((z+1)averagemz+1)529072185465934249992392峰顶处分子量492537953602204515248分布宽度指数(polydispersitypd(mw/mn))4.84.854.71结果分析：a)电喷雾检测器(cad)可以对不同分子量pss(如图1所示)和玻璃酸钠样品(如图4所示)进行分析，通过gpc软件进行分子量及分子量分布计算，得到保留时间与分子量对数的对应关系，如表1所示，由此绘制标准曲线，如图2所示，曲线的方程为logm＝-0.3877×tr+12.35，相关系数为r2＝0.998；且对照表1和表2可知，电喷雾检测器(cad)得到的保留时间与示差检测器(rid)一致；b)由表3可知，三个玻璃酸钠样品s1-s3的重均分子量mw基本都在94万左右；c)如图3所示，以152000分子量pss对照品为例，保留时间重复性rsd＝0.02％；如图4所示，三个玻璃酸钠样品s1-s3保留时间重复性rsd＝0.42％，说明本发明电喷雾检测器(cad)可以对玻璃酸钠分子量及分子量分布进行有效分析，具有良好的检测重复性。实施例2与实施例1的区别仅在于：色谱条件不同：供试品溶液的浓度为0.98g/l，对照品溶液的浓度为1.02g/l，进样量均为105μl，流动相为98mol/l的醋酸铵水溶液。液相色谱系统中的色谱柱为shodex8.0mm×300mm凝胶色谱柱；柱温为30℃；蒸发管温度为45℃；液相采集频率在4.5hz；时间常数为3.6s；液相流速为0.7ml/min。实施例3与实施例1的区别仅在于：色谱条件不同：供试品溶液的浓度为1.02g/l，对照品溶液的浓度为0.98g/l，进样量均为95μl，流动相为102mol/l的醋酸铵水溶液。液相色谱系统中的色谱柱为shodex8.0mm×300mm凝胶色谱柱；柱温为35℃；蒸发管温度为55℃；液相采集频率在4.8hz；时间常数为3.6s；液相流速为0.5ml/min。实施例2-3与实施例1的结果类似，在此不再赘述。实施例4与实施例1的区别仅在于：色谱条件不同：供试品溶液的浓度为0.9g/l，对照品溶液的浓度为1.1g/l，进样量均为110μl，流动相为90mol/l的醋酸铵水溶液。液相色谱系统中的色谱柱为shodex8.0mm×300mm凝胶色谱柱；柱温为40℃；蒸发管温度为40℃；液相采集频率在5hz；时间常数为3.6s；液相流速为0.4ml/min。以152000分子量pss对照品为例，保留时间重复性rsd＝0.05％，三个玻璃酸钠样品s1-s3保留时间重复性rsd＝0.45％。实施例5与实施例1的区别仅在于：色谱条件不同：供试品溶液的浓度为1.1g/l，对照品溶液的浓度为0.9g/l，进样量均为90μl，进流动相为110mol/l的醋酸铵水溶液。液相色谱系统中的色谱柱为shodex8.0mm×300mm凝胶色谱柱；柱温为25℃；蒸发管温度为60℃；液相采集频率在4hz；时间常数为3.6s；液相流速为0.8ml/min。以152000分子量pss对照品为例，保留时间重复性rsd＝0.04％，三个玻璃酸钠样品s1-s3保留时间重复性rsd＝0.52％。对比例1与实施例1的区别仅在于：检测器为示差检测器。结果重复性相较于实施例1变差。以152000分子量pss对照品为例，保留时间重复性rsd＝1.56％，三个玻璃酸钠样品s1-s3保留时间重复性rsd＝1.23％。实施例6与实施例1的区别仅在于：供试品溶液的浓度为1.3g/l。实施例7与实施例1的区别仅在于：供试品溶液的浓度为0.7g/l。实施例8与实施例1的区别仅在于：对照品溶液的浓度为1.3g/l。实施例9与实施例1的区别仅在于：对照品溶液的浓度为1.3g/l。实施例10与实施例1的区别仅在于：对照品溶液的进样量均为80μl。实施例11与实施例1的区别仅在于：对照品溶液的进样量均为120μl。实施例12与实施例1的区别仅在于：供试品溶液的进样量均为80μl。实施例13与实施例1的区别仅在于：供试品溶液的的进样量均为120μl。实施例6中，以152000分子量pss对照品为例，保留时间重复性rsd＝0.08％，三个玻璃酸钠样品s1-s3保留时间重复性rsd＝0.89％，实施例7-13的结果类似于实施例6，在此不再赘述。对照实施例1与实施例6-13、对比例1可知，本发明采用了电喷雾检测器(cad)代替现有技术中的示差检测器测定玻璃酸钠分子量及分子量分布，具有良好的检测稳定性和重复性，解决了示差检测器(rid)受环境影响较大的缺点，玻璃酸钠分子量及分子量分布结果准确度高，重复性好。且通过对照品和样品的浓度和进样量互相配合，控制供试品溶液中玻璃酸钠的浓度为0.98-1.02g/l，对照品溶液的浓度为0.98-1.02g/l对照品溶液和供试品溶液的进样量为95-105μl，能够进一步优化准确度和重复性。申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属
技术领域：
的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。当前第1页12