本发明公开了一种免疫荧光层析检测卡，具体地说，是一种用于检测犬c-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡，本发明还公开了该免疫荧光层析检测卡的制备方法。
背景技术：
：c反应蛋白(crp)是机体非免疫系统的组成成分，在多种哺乳动物疾病的急性期有重要的诊断警示作用。crp在肝脏的合成反应主要由il-1、il-6和tnf-α等炎症因子所调节。crp浓度受年龄、性别和体重的影响不大。在人类临床医学诊断中，crp作为炎性或非炎性疾病的诊断标志物进行检测已超过30年。在兽医临床上，犬crp的检测在临床应用中也比较广泛，包括急性感染性疾病的诊断和鉴别诊断、手术后感染的监测、抗生素疗效的观察、病程监测及预后判断等。犬crp对疾病敏感度高，能在疾病早期快速升髙，及时反映病情；而且crp的浓度不受到抗生素及免疫抑制剂的影响，在治疗中可以准确地对疾病的发展进行监测，在临床诊疗中具有很高的价值。因此作为炎症标记物，crp在兽医临床上的作用日趋显著，检测犬crp对临床诊断、疗效及预后观察等具有重要价值。crp是由肝脏合成的一种能与肺炎链球菌c多糖反应形成复合物的急性时相反应蛋白。它由5个相同的亚基单位以非共价方式联接，与人crp不同，犬crp的5个亚基中有两个被糖基化。研究表明，各种抗其他物种crp蛋白的抗血清，都不能和急性期犬血清或者分离的犬crp发生交叉反应，说明其他物种crp和犬crp没有共同的抗原性，这种现象也说明犬crp的快速检测方法不能依赖于人的商品化crp快速检测试纸条。目前，临床中快速检测犬crp的方法多是依赖于临床检测仪器，这在普通宠物医院并不具备。而且，对于动物疫病诊断行业，很多情况下，对于疾病的诊断需要在野外进行，这对于现行犬crp检测方法是没有办法完成的。时间分辨荧光免疫层析技术采用稀土元素(如eu3+等)克服了荧光微球灵敏度较差的缺点。与放射性免疫分析相比，时间分辨荧光免疫层析技术无放射性污染，具有灵敏度高、抗基质干扰性好，稳定性强等优点。中国专利zl201710468614.6公开了一种犬c反应蛋白胶体金免疫层析试纸条，由样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫、底板依次组成，所述结合物释放垫上包被有鼠抗犬c反应蛋白单克隆抗体-胶体金标记物，所述反应膜上包括检测区和质控区，所述检测区包被有鸡抗犬c反应蛋白多克隆抗体，所述质控区包被有羊抗鼠抗抗体。该方法选用了胶体金作为示踪物，免疫标记物依靠静电吸附，存在灵敏度较低、难以定量、重复性和稳定性较差等缺陷，无法完全满足临床的检测需求。中国专利zl201710468621.6公开了一种犬c反应蛋白荧光检测试纸条，由样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫、底板依次组成，所述结合物释放垫上包被有鼠抗犬c反应蛋白单克隆抗体-荧光微球标记物，所述反应膜上包括检测区和质控区，所述检测区包被有鸡抗犬c反应蛋白多克隆抗体，所述质控区包被有羊抗鼠抗抗体；但是该方法存在下述缺点:检测线包被抗体为多克隆抗体，可能会影响到检测的特异性；另外反应膜检测区和质控区发生免疫反应时，共用一种标记物：鼠抗犬c反应蛋白单克隆抗体-荧光微球标记物，当样本中c反应蛋白变化是，c线荧光值将相应变化，从而可能影响c值和t/c值的稳定性，从而严重影响定量的准确性。技术实现要素：针对上述问题，本发明的目的是提供一种灵敏度高，检测结果重现性的用于检测犬c-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡。本发明的第二个目的是提供上述检测试剂卡的制备方法。为此，本申请提供的第一个技术方案是这样的:一种用于检测犬c-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡，包括底板，在底板上依次衔接有样品垫、结合垫、硝酸纤维膜和吸水垫,所述结合垫上设有荧光微球标记的crp单克隆抗体和荧光微球标记的羊抗鸡igy，所述的硝酸纤维膜设有一条包被鸡igy的质控c线，以及一条包被crp单克隆抗体的检测t线。进一步的，上述的用于检测犬c-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡，还包括样品稀释液瓶。进一步的，上述的用于检测犬c-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡，所述的样品稀释液瓶中含的样品稀释液为含1％s9和0.1％tritonx-100的的0.1m的ph7.8tris-盐酸缓冲液。本发明的第二个技术方案是提供上述检测试剂卡的制备方法。一种用于检测犬c-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡的制备方法，在底板上依次衔接有样品垫、结合垫、硝酸纤维膜和吸水垫，a)所述的样品垫的制备方法为：1)配制样品垫处理液：含1％牛血清白蛋白、2％聚乙二醇4000和0.5％tritonx-100的ph9.00.1m的甘氨酸缓冲液；2)将步骤1)中制备的缓冲液5.0μl/cm的浓度喷涂于玻璃纤维上；b)所述的结合垫的制备方法为：1)将用荧光微球标记crp单克隆抗体和用荧光微球标记的羊抗鸡igy按照体积比20:1混合均匀，超声2s，间歇5s，重复3次；2)按3.5μl/cm、0.02mpa喷至剪裁后的结合垫上；c)所述的反应膜的制备方法为：1)用含3％蔗糖的ph7.4的0.01m的磷酸盐缓冲液将鸡igy稀释到1mg/ml，即为c质控线工作液；2)用含3％蔗糖的ph7.4的0.01m的磷酸盐缓冲液将crp单克隆抗体稀释到1mg/ml，即为t检测线工作液；3)取底板粘贴硝酸纤维膜；4)在硝酸纤维膜上划t线和c线，划线浓度均为1μl/cm；5)完成后将片材放置在37℃干燥箱中干燥过夜。进一步的，上述的一种用于检测犬c-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡的制备方法，荧光微球标记crp单克隆抗体的制备方法为：1)稀释荧光微球：取一离心管，加入1ml标记缓冲液0.1mmes缓冲液，加入荧光微球1mg，涡旋混匀；2)微球的活化：在上述离心管中加入20μl-50μl标记活化剂a和20μl-50μl标记活化剂b，旋转培养器上反应30min；3)活化淬灭：将活化后的荧光微球20000g离心30min，弃上清，留取沉淀，加入5000μl淬灭剂，超声2s；4)抗体的标记：在超声重悬后的荧光微球中加入20-200μgcrp单克隆抗体，涡旋混匀，置于旋转培养器上反应30min；5)封闭：加入2ml标记封闭液，超声2s，间歇5s，重复3次，超声完成后置于旋转培养器上反应30min；6)纯化：完成上述反应后，19000g离心30min，吸去上清，留取沉淀，加入2ml标记荧光微球稀释液，超声，工作2s，间歇5s，重复3次。进一步的，上述的一种用于检测犬c-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡的制备方法，荧光微球标记的羊抗鸡igy的制备方法为：1)稀释微球：取一离心管，加入1ml的标记缓冲液标记缓冲液0.1mmes缓冲液，取荧光微球1.0mg，涡旋混匀；2)微球的活化：在上述离心管中加入20μl-50μl标记活化剂a和20μl-50μl标记活化剂b，旋转培养器上反应30min；3)活化淬灭：将活化后的荧光微球19000g离心30min，弃上清，留取沉淀，加入2ml淬灭剂，90w超声，工作2s，间歇5s，重复1次；4)抗体的标记：在超声重悬后的荧光微球中加入1000μg羊抗鸡igy，涡旋混匀，置于旋转培养器上反应30min；5)封闭：加入500μl标记封闭液，封闭30min；6)纯化：完成上述反应后，19000g离心30min，吸去上清，留取沉淀，加入2ml标记荧光微球稀释液，90w超声，工作2s，间歇5s，重复3次。进一步的，上述的一种用于检测犬c-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡的制备方法，所述的微球为含有稀土铕元素的荧光错配物的聚苯乙烯微球；密度：1.05g/cm3；折射率：1.59@589nm，25℃；直径300nm；功能基团：羧基；外观：白色。进一步的，上述的一种用于检测犬c-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡的制备方法，所述的标记封闭液为含3％牛血清白蛋白的0.04mph8.0乙醇胺溶液；所述的标记荧光微球稀释液为含1％牛血清白蛋白、0.5％牛丙种球蛋白、3％蔗糖的ph9.00.1m的甘氨酸缓冲液；所述的淬灭剂为含0.25％甲醇的0.1m的mes缓冲液。进一步的，上述的一种用于检测犬c-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡的制备方法，所述的标记活化剂a为含50mg/mlnhs的0.05mes缓冲液；所述标记活化剂b为含50mg/mledc的0.05mmes缓冲液。与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有如下优点：1、本发明提供的技术方案操作步骤简单，对样品预处理方法进行优化，只需要采集犬血清，稀释后加入到检测卡的加样孔中即可检测，检测速度快，10分钟出结果，结果即可定性观察又可定量测定，大大降低检测成本，减少工作量。2、本发明提供的技术方案，通过对样品垫处理液和标记荧光微球稀释液的优化，相比传统工艺，灵敏度明显高，最低检测限(lod)可达到0.86mg/l(原工艺1.56mg/l)，线性更好，剂量-反应曲线的决定系数由0.9874提升到0.9989。3、本发明提供的技术方案对结合垫、硝酸纤维膜制备过程严格考究、优化，进一步提高了检测卡的精密度。4、本发明采用样品垫处理液处理后的荧光微球释放更充分，重复性好，低中高三个水平质控变异系数均低于10％(7.21％、6.24％和4.26％)；另外缓冲液中加入生物防腐剂proclin300，可以有效保持检测试剂的稳定性，并且防止减少了常规催化剂对检测结果的影响，确保检测结果的精确度，并保护检测者不受常规防腐剂例如叠氮钠等的危害。附图说明图1是本发明提供的检测试纸卡结构示意图；图2是本发明提供的检测试纸条结构示意图；图3是本发明提供的另一种检测试纸卡结构示意图；图4是本发明提供的检测卡判定结果为阳性时示意图；图5是本发明提供的检测卡判定结果为阴性示意图；图6是本发明本发明提供的检测卡判定结果为无效时一种示意图；图7是本发明本发明提供的检测卡判定结果为无效时另一种示意图；图8是本申请提供的病毒抗原浓度检测的标准曲线图。图9是对比例提供的病毒抗原浓度检测的标准曲线图。具体实施方式下面结合具体实施方式，对本发明的权利要求作进一步的详细说明。实施例1本发明提供的一种用于检测犬c-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡，参阅图1至图2，包括壳体7，所述的壳体7内设有用于检测犬c-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡，所述用于检测犬c-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡包括卡底板1，在底板1上依次衔接有样品垫2、结合垫3、硝酸纤维膜4和吸水垫5,所述结合垫3上设有荧光微球标记的crp单克隆抗体和荧光微球标记的羊抗鸡igy；所述的硝酸纤维膜4设有一条包被鸡igy的质控c线，以及一条包被crp单克隆抗体的检测t线。所述的壳体7上设有与样品垫2相适配的加样孔72，与结合垫3相适配的观察窗口71，所述的壳体7上表面还设有防滑条，方便试剂卡的取出与放入。实施例2本申请提供的另一种用于检测犬c-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡，参阅图1至图3，包括盒体9，所述的体9内设有样品稀释液瓶6，吸管8以及检测卡，所述检测卡位于壳体7内，所述用于检测犬c-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡包括底板1，在底板1上依次衔接有样品垫2、结合垫3、硝酸纤维膜4和吸水垫5,所述结合垫3上设有荧光微球标记的crp单克隆抗体和荧光微球标记的羊抗鸡igy。所述的硝酸纤维膜4设有一条包被鸡igy的质控c线，以及一条包被crp单克隆抗体的检测t线。所述的壳体7上设有与样品垫2相适配的加样孔72，与结合垫3相适配的观察窗口71，所述的壳体7上表面还设有防滑条，方便试剂卡的取出与放入。更为具体的说，所述的样品稀释液瓶中样品稀释液为含1％s9、1％sds、0.1％tritonx-100的0.1mph7.8的tris-盐酸缓冲液。实施例3实施例1或者2中提供的一种用于检测犬c-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡的制备方法是在温度(18～26)℃、湿度≤30％的环境下进行装配，在底板1上依次衔接有硝酸纤维膜4、吸水垫5、结合垫3和样品垫2；将粘贴好的大板切成4.0mm宽的试纸条，装入塑料卡壳内，即cdv检测卡；将每一检测卡置于铝膜袋中，加入干燥剂1包，热合封口备用。具体制备方法如下：1.1结合垫的制备1.1.1crp单克隆抗体的标记1)选择微球：微球为含有稀土铕元素的荧光错配物的聚苯乙烯微球；密度：1.05g/cm3；折射率：1.59@589nm，25℃；直径300nm；功能基团：羧基；外观：白色。2)稀释荧光微球：取一离心管，加入1ml0.1m的mes标记缓冲液(2-(n-吗啡啉)乙磺酸，加入荧光微球1mg，涡旋混匀。3)微球的活化：在上述离心管中加入(20-50)μl(优选30μl)10mg/ml标记活化剂a[10mg/mln-羟基琥珀酰亚胺(nhs)的0.05m的mes缓冲液(2-(n-吗啡啉)乙磺酸)]，涡旋混匀后加入(20-50)μl(优选30μl)50mg/ml标记活化剂b[10mg/ml1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)的0.05mmes缓冲液(2-(n-吗啡啉)乙磺酸)]，旋转培养器上反应30min；4)活化淬灭：将活化后的荧光微球20000g离心30min，弃上清，留取沉淀，加入2ml淬灭剂(含0.25％甲醇的0.1m的mes缓冲液)，超声2s；5)抗体的标记：在超声重悬后的荧光微球中加入20μgcrp单克隆抗体，涡旋混匀，置于旋转培养器上反应30min；6)封闭：加入200.0μl标记封闭液[含3％牛血清白蛋白(bsa)的0.04mph8.0乙醇胺溶液]，超声2s，间歇5s，重复3次，超声完成后置于旋转培养器上反应30min；7)纯化：完成上述反应后，19000g离心30min，吸去上清，留取沉淀，加入600.0μl标记荧光微球稀释液[含1％牛血清白蛋白(bsa)、0.5％牛丙种球蛋白、3％蔗糖的ph9.00.1m的甘氨酸缓冲液]，超声，工作2s，间歇5s，重复3次。1.1.2质控c线抗体的标记1)稀释微球：取一离心管，加入1ml的标记缓冲液，取荧光微球0.5mg，涡旋混匀；2)微球的活化：在上述离心管中加入20μl-50μl(优选30μl)标记活化剂a[含10mg/mln-羟基琥珀酰亚胺(nhs)的0.05m的mes缓冲液(2-(n-吗啡啉)乙磺酸)]和20μl-50μl(优选30μl)标记活化剂b[含10mg/ml1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)的0.05mmes缓冲液(2-(n-吗啡啉)乙磺酸)]，旋转培养器上反应30min；3)活化淬灭：将活化后的荧光微球19000g离心30min，弃上清，留取沉淀，加入1ml淬灭剂(含0.25％甲醇的0.1m的mes缓冲液)，90w超声，工作2s，间歇5s，重复1次；4)抗体的标记：在超声重悬后的荧光微球中加入0.25mg羊抗鸡igy，涡旋混匀，置于旋转培养器上反应30min；5)封闭：加入标记封闭液[含3％牛血清白蛋白(bsa)的0.04mph8.0乙醇胺溶液]，封闭30min；6)纯化：完成上述反应后，19000g离心30min，吸去上清，留取沉淀，加入1ml标记荧光微球稀释液[含1％牛血清白蛋白(bsa)、0.5％牛丙种球蛋白、3％蔗糖的ph9.00.1m的甘氨酸缓冲液]，90w超声，工作2s，间歇5s，重复3次。1.1.3喷膜1)将璃纤维裁切为(10±1)mm×(300±10)mm大小为结合垫；2)将标记后的t、c线抗体按20:1(v：v)混合均匀，90w超声，工作2s，间歇5s，重复3次；3)按5.0μl/cm、0.02mpa喷至剪裁后的结合垫上；4)喷完后，37℃干燥箱中干燥过夜(16～18)h。1.2反应膜的制备1)用含3％蔗糖的ph7.4的0.01m的磷酸盐缓冲液(pbs)将鸡igy稀释到1mg/ml，即为c线工作液。2)用含3％蔗糖的ph7.4的0.01m的磷酸盐缓冲液(pbs)将另一株crp单克隆抗体稀释到1mg/ml，即为t线工作液。3)取pvc底板，粘贴硝酸纤维膜。4)在硝酸纤维膜上划t线和c线，划线浓度均为1μl/cm。5)完成后将片材放置在37℃干燥箱中干燥过夜(16～18)h。1.3样品垫制备1)配制样品垫处理液：含1％牛血清白蛋白(bsa)、2％聚乙二醇4000和0.5％tritonx-100的ph9.00.1m的甘氨酸缓冲液；2)以5.0μl/cm的浓度将缓冲液喷涂于玻璃纤维上。对比试验本对比例提供的检测试剂卡结构实施例1提供的检测试剂卡结构基本一致，其不同之处在于，在制备过程中将实施例3中标记荧光微球稀释液和样品垫处理液换为常规缓冲液，比如样品垫处理液为含0.5％tween-20、0.1％牛血清白蛋白、0.5％trtion-100的50mmph8.010mmol/ltris-hcl缓冲液；比如标记荧光微球稀释液为含2％bsa、0.1％peg4000、5％海藻糖、5％蔗糖、0.05％叠氮钠的ph8.010mmol/ltris-hcl缓冲液，其它参数和条件均与实施例3一致。检测方法为了便于使用本申请提供的检测卡，下面给出本申请提供的检测卡提供两种检测方法。方法一：采用紫外灯照射，参阅图4至图7：用手持式紫外线灯照射观察窗口，当质控线和检测线都有量荧光出现时(图4)，说明样品中crp抗原为阳性；当只有质控线有荧光而检测线无荧光出现时(图5)，说明样品中crp抗原为阴性；质控线未出现荧光(图6、图7)，则代表操作有误或检测结果无效，需重复试验。方法二：免疫荧光检测仪检测结果：1)收集犬血清；2)取10μl加入含有1.0ml样品稀释液(含1％s9和0.1％tritonx-100的的0.1m的ph7.8tris-盐酸缓冲液的样品管中，充分混匀；3)取出检测卡，打开干式免疫荧光检测仪；4)吸取稀释后的样本75μl，加入到检测卡的加样孔中，将检测卡放入到仪器的卡槽中，开始计时；5)10min后，点击仪器上的“测试”按键，仪器将开始测试；6)荧光强度与样品中的crp浓度成正比，通过内置标准曲线进行曲线拟合和浓度的计算，剂量反应曲线log(y)＝0.59476log(x)–0.5267，r＝0.9994(r2＝0.9989)，参阅图3。免疫荧光检测仪检测结果：1、线性范围1.1.1将crp校准品用阴性血清分别稀释到0mg/l、2.5mg/l、7.5mg/l、20mg/l、50mg/l、100mg/l、200mg/l、300mg/l、400mg/l、500mg/l、600mg/l、700mg/l和800mg/l；1.1.2将以上各浓度样本分别取75μl，加入至制备好的犬crp检测试剂中，每浓度重复测试2次；1.1.3反应10min后，将试纸放入干式免疫荧光分析仪中，读取t/c值，通过内置标准曲线进行曲线拟合和浓度的计算。1.1.4测试结果显示：试剂在检测2.5～300mg/l的crp线性拟合关系较好，r＞0.9900，当crp浓度增加到400mg/l时，线性拟合r值小于0.9900，t/c增长减缓，crp在400～500mg/l时t/c值平缓，crp达到600mg/l时，t/c值反而降低。因此本检测的最大检测范围可以达到300mg/l。2、最低检出限将阴性血清，重复测试20次，计算t/c均值，将其代入剂量-反应曲线中，得出本方法的最低检出限为0.86mg/l。具体见表1和图8；表1用同样方法检测对比对比试验制备的检测卡，其检测具体见表2和图9表23、精密度将crp校准品用阴性血清稀释至10mg/l、30mg/l、100mg/l，用本方法检测卡每浓度重复测试10次，计算测试浓度的变异系数。结果表3所示，由此可以看出，本试剂盒检测的变异系数均小于10％(三个浓度分别为7.21％、6.24％和4.26％)，因此本检测方法具有较高的精密度。表3浓度cv质控ⅰ10mg/l7.21％质控ⅱ30mg/l6.24％质控ⅲ100mg/l4.26％为了更好的说明本发明的有益效果，下面给出采用本发明提供的检测试剂与其他方法(胶体金法、荧光层析法)等在检测犬c-反应蛋白时的检测性能比较，见表4。表4上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12