一种鉴定和评价小麦赤霉病籽粒抗性的方法与流程

本发明属于植物抗病鉴定评价技术领域，具体地，涉及一种鉴定和评价小麦赤霉病籽粒抗性的方法。

背景技术

目前赤霉病籽粒抗性评价采用的主要方法是单花滴注法接种后的籽粒感染率（fdk），即在小麦扬花期对穗部的倒3小穗的单侧小花注射孢子液，标记接种时间，接种后18-21天收获，收获后进行手工脱粒，根据籽粒干瘪、皱缩、发白等症状统计发病率（感病籽粒数占总籽粒数的百分比）进行抗性评价。因此单花滴注法主要评价的是扩展抗性，而不是籽粒本身的抗性；感病籽粒症状评价多凭借肉眼观察，不同评价者的评价标准不同，尚未存在统一的评价标准；此外，存在籽粒外表正常，但内部损坏严重的现象，通过肉眼识别无法判断抗感情况。因此只能间接评价扩展抗性，但无法准确和真实的评价籽粒抗性。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服单花滴注法无法区分扩展抗性和籽粒抗性的缺点，避免肉眼观察及评价标准的差异导致结果重现性差，从活体和离体角度建立一种准确且较为系统的鉴定和评价小麦赤霉病籽粒抗性的方法。

为了实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：一种鉴定和评价小麦赤霉病籽粒抗性的方法，其特征是：在小麦扬花期进行标花，标花时利用镊子去除麦穗所有小穗的中间小花，活体条件下，将制备好的带有绿色荧光蛋白的赤霉菌孢子液分别注射到花后5天、花后15天、花后25天麦穗的所有剩余小花，接种赤霉菌孢子液后5-7天取样，观察籽粒荧光信号强弱；离体条件下，花后10天、花后20天、花后30天及成熟期取样、脱粒，培养于加有赤霉菌菌块的培养基中，测定菌丝生长速率及don含量，以及测定赤霉菌菌液处理后籽粒发芽率，综合评价小麦的赤霉病籽粒抗性。

所述的标花是指在小麦扬花期，利用镊子去除麦穗所有小穗的中间小花，只保留每个小穗两侧的两个小花，并在穗下节间紧靠基部小穗处贴上防水标签，标签上记载标花日期。麦穗是由小穗，穗轴和小穗轴组成，每个小穗又由3-5朵小花组成。在实验中，本发明去除了每个小穗的中间小花，只留下两侧的小花用于接种。去除中间小花的目的是保证接种的一致性，也有利于鉴定，中间小花易漏接，对鉴定结果产生较大影响。所有剩余小花即保留的每个小穗两侧的两个小花。

所述的赤霉病孢子液注射是指利用医用注射器和注射针，将孢子液注射到麦穗所有剩余小花的内、外颖间，然后在穗下节间紧靠基部小穗处贴上防水标签，标签上记载接种日期和菌株名称。

所述的接种赤霉菌孢子液后5-7天取样，具体日期根据接种后平均气温情况决定，当平均气温高于25℃，接种后5天即可取样；当平均气温低于25℃，接种后6-7天取样。

籽粒荧光信号通过mvx10透射光明场观察。所述的培养基是指马铃薯琼脂糖培养基（pda）。所述的籽粒培养于加有赤霉病菌块的培养基，具体为：籽粒在pda培养基上呈圆形排列，从内到外分为3圈，每圈6粒，圈之间的间距为2cm，然后利用灭菌后的圆形打孔器从经过活化的赤霉菌株固体平板培养基上取相似位置上的菌块至培养皿中央。

所述的菌丝生长速率是指将加有籽粒与菌块的培养基置于25℃培养箱中培养不同时间后测定的菌落直径。所述的发芽率是指将赤霉菌菌液处理后的籽粒置于26℃黑暗条件下培养36h萌发出芽后统计的发芽率。所述的综合评价小麦赤霉病籽粒抗性是指评价依据接种赤霉菌后籽粒荧光信号、菌丝生长速率、don含量以及发芽率。

赤霉病籽粒抗性鉴定和评价体系的主要指标有：（1）是否排除扩展抗性的影响，即独立评估籽粒抗性；（2）鉴定指标的准确性和重要性；（3）评价方法的稳定性和一致性；对比传统的以单花滴注接种后籽粒感染率（fdk）作为指标的鉴定方法与本发明在上述3个技术指标方面的差异，本发明的优势和结果为：（1）传统方法易受扩展抗性的影响，本方法将籽粒抗性独立于扩展抗性；本发明在对扬花后不同发育阶段穗子上的所有小花进行接种，单独评价了籽粒抗性；（2）常规评价体系只以籽粒感染率（fdk）作为籽粒抗性鉴定指标，仅从植物体角度评价较为单一；本发明以活体及离体两种试验方法，从植物体和病原菌作为不同切入点研究互作关系，设立荧光信号强度、菌丝生长速率、don含量及发芽率指标全面评价籽粒抗性；(3)传统鉴定体系只通过肉眼观察籽粒干瘪、皱缩、发白等症状来统计籽粒感染率（fdk），存在人为差异，鉴定不准确；因此本发明对离体条件下培养基中don积累量以及菌丝生长速率进行测定，准确评估籽粒抗性，不同材料间重现性好。

附图说明

图1为实施例1的np152和np164抗性差异示意图。

具体实施方式

为了阐述本发明的技术方案及技术目的，下面结合附图说明及具体实施方式对本发明做进一步的介绍。

本发明的目的是通过如下措施来达到全面且准确的评价小麦赤霉病籽粒抗性，本发明的鉴定和评价小麦赤霉病籽粒抗性的方法分别针对活体及离体两部分，其步骤、流程和基本特征是：

活体部分：

[1].从经过活化的带有绿色荧光蛋白（gfp）的赤霉菌株固体平板培养基上利用圆盘取样器，取3-5块菌块放入150ml经过灭菌的液体培养基，然后置于摇床上，以180rpm，温度25-28℃，摇72-120小时，取样观察产孢情况并吸取1ul孢子液，滴到血球计数板上，置于显微镜下测定孢子浓度，然后稀释或浓缩到合适的浓度。

[2].在小麦扬花期进行标花，并利用镊子去除麦穗所有小穗的中间小花。

[3].在花后5天、花后15天、花后25天利用医用注射器和注射针，等量注射步骤[1]制备的孢子液至麦穗所有剩余小花的内颖和外颖之间。

[4].接种孢子液后第5-7天取样观察接种后籽粒荧光信号强弱。具体日期根据接种后平均气温情况决定，若平均气温高于25℃，接种后5天即可取样；若平均气温低于25℃，接种后6-7天取样。

离体部分：

1.小麦籽粒对于赤霉菌生长及产毒的影响：

[1].在小麦扬花期进行标花，并利用镊子去除麦穗所有小穗的中间小花。

[2].在花后10天、花后20天、花后30天及成熟期取样、脱粒。

[3].籽粒消毒：75%酒精浸泡籽粒30s，倒掉酒精，用次氯酸钠：无菌水=1:1消毒处理40min，倒掉液体，用无菌水冲洗3次。

[4].培养基制备：pda（马铃薯琼脂糖）：无菌水=1：25加热至完全溶解，无菌操作台下倒平板，配置25ml等量pda培养基至直径9cm的无菌培养皿中。

[5].用灭菌后的镊子放置籽粒，籽粒呈圆形排列，从内到外分为3圈，每圈6粒，圈之间的间距为2cm。

[6].籽粒放置完全后，利用灭菌后的圆形打孔器从经过活化的赤霉菌株固体平板培养基上取相似位置上的菌块至培养皿中央，然后用无菌封口膜封口后置于25℃培养箱中培养。不放置籽粒，只放置菌块的培养皿作为对照。

[7].培养后36h及之后每隔24h拍照记录籽粒对于菌丝生长速度、生长形态、色泽等的影响，游标卡尺测量菌丝生长直径。并统计菌丝生长布满整个培养基所需的时间。

[8].菌丝布满整个培养基时，测定培养基中的don含量。

2.赤霉菌对于小麦籽粒发芽的影响：

[1].籽粒消毒：75%酒精浸泡小麦成熟籽粒30s，倒掉酒精，用次氯酸钠：无菌水=1:1消毒处理40min，倒掉液体，用无菌水冲洗3次。

[2].培养皿发芽：直径9cm培养皿内铺上无菌滤纸，分别滴加赤霉菌菌液和绿豆汤溶液作为处理及对照，每个培养皿内放置16粒籽粒，26℃黑暗条件下培养36h萌发出芽，统计发芽率（以芽长超过籽粒长一半视为发芽）。

依据活体及离体试验，通过荧光信号、菌丝生长速率、don含量及发芽率综合评价小麦赤霉病籽粒抗性。

本发明对已知的公认的高抗赤霉病扩展材料np152和高感赤霉病材料np164，在活体条件和离体条件下使用本发明进行籽粒抗性接种和抗性评价。根据荧光信号、菌丝生长速率、don含量及发芽率评价不同材料间的抗性差异。

（附：实施例背景资料。为了更好的理解该发明实施方式，我们列出了该发明实验材料的背景信息。np152是中国赤霉病抗扩展品种，而np164是美国引进的高感赤霉病品种（不抗扩展））。

本发明实施例（np152和np164抗性差异）：

实施例1：

荧光信号强弱：接种所用菌液携带绿色荧光蛋白，因此籽粒荧光信号强弱是衡量抗感性的重要指标，np152的籽粒正面、背面荧光信号均强于np164（如图1，以花后5天接种籽粒为例）。

实施例2：

菌丝生长速率：加有籽粒的培养基菌丝生长速率显著快于对照（不加籽粒的培养基），加有籽粒的培养基中，菌丝需要108h长满培养基，而对照需要132h；加有np152籽粒的培养基中菌丝生长速率快于np164，但二者间没有显著差异。因此，籽粒抗性可以转化为离体诱导菌丝生长，可以明显区分不同抗感材料在赤霉病籽粒抗性方面的差异。

实施例3：

don含量：加有籽粒的培养基中don含量高于对照（不加籽粒的培养基，don含量为0）；加有np152籽粒的培养基中don含量显著高于np164，且don含量与生育期呈正相关；加有花后10天、花后20天、花后30天、成熟期籽粒的培养基中，np152的don含量分别高出np16470.0ppb、247.5ppb、381.5ppb、316.5ppb。因此，不同抗感品种籽粒在培养基中的产毒情况可以作为衡量籽粒抗性的补充条件。

实施例4：

发芽率：赤霉菌菌液处理籽粒发芽率低于对照（绿豆汤溶液处理的籽粒），其中，np152的籽粒经赤霉菌菌液处理后发芽率为11%（对照为69%），np164的籽粒经赤霉菌菌液处理后发芽率为39%（对照为59%）；np152的相对发芽率（赤霉菌处理后发芽率/绿豆汤溶液处理后发芽率）为16%，而np164的相对发芽率为66%。经赤霉菌处理后，菌丝缠绕籽粒胚部影响籽粒发芽，而菌丝对于不同抗感籽粒的响应不同，因此，发芽率可以作为衡量籽粒影响赤霉菌生长、评价籽粒抗性的条件之一。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征以及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。