本发明涉及一种基于pefc的自供能mirna生物传感器及其应用，属于生物传感技术领域。
背景技术：
光电生物燃料电池(pefc)是一种特殊的燃料电池，其能在温和条件下，利用光激发提供可持续能源，受到广泛关注。基于pefc的自供能生物传感器，是一种以电池性能输出作为分析检测信号的一类传感器，该传感器信号与被检测分析污浓度成比例关系。与传统传感器相比，光电自供能生物传感器检测过程中无需施加额外电源，其具体优点主要表现在：(1)设备简单。检测过程不同于传统的电化学检测三电极体系，仅需两根电极，即pefc的阴阳两极，便可实现检测；(2)抗干扰能力强。测试体系未施加额外电源，能有效避免易发生氧化还原的电活性物质在电极表面反应，从而提高了传感器的抗干扰能力；(3)能实现简单、快速、实时检测。检测过程中无需电化学工作站等供电设备，仅需简易电压表和适宜的光源便可实现检测，故检测设备易携带，能实现实时监测。
microrna(mirna)，约22个核苷酸大小的内源性非编码rna，在多种生物过程如细胞分化、凋亡、增殖和免疫反应中具有重要作用，已成为用于检测多种癌症的诊断和预后评估的新生物标志物。目前，检测mirna表达的方法主要有northern印迹法、mirna阵列和实时逆转录聚合酶链反应(rt-pcr)、电化学方法。northern印迹法灵敏度低、费时费力、样品需求量大。微阵列检测法同样存在灵敏度较低的缺点，并且特异性较弱。rt-pcr具有高特异性与高灵敏度，但该方法操作繁琐、rna需分离纯化。mirna小尺寸的特点也限制了传统rt-pcr的直接应用，并且mirna家庭成员之间高的序列同源性也使定量分析成为挑战。因此，设计制备基于生物燃料电池的自供能生物传感器，实现mirna简单、方便、高灵敏、高特异性检测非常必要。
技术实现要素：
针对现有技术存在的上述缺陷，本发明构建了基于pefc的mirna生物传感器，核心技术便为pefc的构建，其中以氧化石墨烯/碳纳米管/金纳米粒子(go/cnts/aunps)作为laccase的载体，构建生物阴极催化氧气；以aunps-g-c3n4作为光阳极检测mirna。首先将与mirna部分互补的发卡dna固定到电极表面，发卡dna一端连接电极表面，一端修饰cdsqds。当无目标mirna时，由于发卡dna没有被打开，cdsqds靠近电极表面对g-c3n4起到敏化作用，此时阳极光电流较大，流向阴极的电子较多，电池输出电压高；当目标mirna存在时，由于mirna打开发卡dna，目标mirna与互补链形成刚性双螺旋结构，使cdsqds远离g-c3n4表面，cdsqds对g-c3n4敏化作用减弱。目标mirna的引入，达到使cdsqds远离电极表面的目的，流向阴极的电子减少，电压输出信号减小，用于定量检测目标mirna。本发明设计的基于pefc的自供能mirna生物传感器，可实现目标物简单、快速、灵敏、高效检测。
本发明是采用以下的技术方案实现的：
一种基于pefc的自供能生物传感器，包括阳极、阴极和电解液；所述阳极为aunps-g-c3n4光阳极，所述阴极为go/cnt/aunps/laccase生物阴极，所述电解液为含0.1m葡萄糖ph7.4的0.1mpb缓冲体系。
所述aunps-g-c3n4光阳极的制备方法如图1所示，包括如下步骤：
步骤a：将三聚氰胺与尿素按质量比1:1混合，置于管式炉中，以2～8℃/min升温至500～1000℃后维持2～5h，获得的黄色块状固体即为c3n4，研磨至粉末备用；
步骤b：取一定量的步骤a中制得的c3n4，加入到100～200ml、5～10m的hno3中100～200℃回流8～16h，将回流得到的白色产物8000～15000rpm多次离心洗涤至中性，将得到的洗涤液在3000～8000rpm下离心10～30min，取上清液得到白色泛蓝胶体，即为剥离好的g-c3n4纳米片；
步骤c：取2～8ml步骤b中制得的剥离好的g-c3n4纳米片溶解在4～8ml二次水中并超声0.5～1h，将20～50μl的haucl4在搅拌条件下加入到上述溶液中，超声10～30min，在室温下搅拌0.5～1h，重复加入三次haucl4，将100～200μl、0.01～0.1m新配制的nabh4快速加入到上述溶液中，持续搅拌10～30min，将100～500μl、0.01～0.05m的柠檬酸钠逐滴加入到上述溶液中，持续搅拌10～40min，之后将上述溶液5000～10000rpm离心10～30min，二次水清洗一次，得到的沉淀分散于4～8ml二次水中，得到aunps-g-c3n4混合物；
步骤d：将20～50μl步骤c中制得的aunps-g-c3n4滴涂在ito电极表面，二次水冲洗后，置于4℃下备用。
所述go/cnt/aunps/laccase生物阴极的制备方法，包括如下步骤：
步骤ⅰ：取一定量的go分散在10～20ml二次水中，超声1～2h，再取一定量的cnts，加入到溶解完全的go悬浮液中，继续超声2～4h，取一定量的40～100nm的aunps加入到上述溶液中继续超声2～4h得到均匀悬浊液，将上述得到的悬浊液至于反应釜中150～300℃反应2～5h，得到go/cnt/aunps；
步骤ⅱ：取一定量步骤ⅰ中制得的go/cnt/aunps超声溶解于二次水中，将20～50μl制得的go/cnt/aunps溶液滴涂在ito电极表面，37℃下干燥2～4h；
步骤ⅲ：滴涂10～50μl、10～50mg/ml的laccase溶液于步骤ⅱ中得到的go/cnt/aunps电极表面，37℃下干燥12～24h，二次水冲洗后，置于4℃下备用。
一种基于pefc的自供能mirna生物传感器，包括阳极、阴极和电解液；所述阳极为aunps-g-c3n4/hs-dna-nh2/mch/cds光阳极，所述阴极为go/cnt/aunps/laccase生物阴极，所述电解液为含0.1m葡萄糖ph7.4的0.1mpb缓冲体系。
所述aunps-g-c3n4/hs-dna-nh2/mch/cds光阳极的制备方法，包括如下步骤：
将20～50μl发卡dna滴涂到修饰有aunps-g-c3n4的ito电极表面4～8℃孵育8～12h，二次水冲洗电极表面；向修饰有发卡dna的电极表面滴加20～50μl含有20～40mmedc及10～20mmnhs的cds-coohqds溶液，室温下反应1～2h后，二次水冲洗电极表面，向电极表面滴加20～50μl、1～3mm的mch溶液，室温孵育1～3h，进行封板，二次水冲洗电极表面，得到aunps-g-c3n4/hs-dna-nh2/mch/cds光阳极。
一种如上述所述的基于pefc的自供能mirna生物传感器的应用，将其用于检测mirna。
所述检测方法包括如下步骤：
步骤(1)：将aunps-g-c3n4/hs-dna-nh2/mch/cds光阳极、go/cnt/aunps/laccase生物阴极、含0.1m葡萄糖ph7.4的0.1mpb缓冲体系组装为电池，测量电池的eocv，记为e0ocv；
步骤(2)：向aunps-g-c3n4/hs-dna-nh2/mch/cds光阳极电极表面滴涂mirna，孵育，二次水冲洗电极表面，得到aunps-g-c3n4/hs-dna-nh2/mch/cds/mirna光阳极；
步骤(3)：将aunps-g-c3n4/hs-dna-nh2/mch/cds/mirna光阳极、go/cnt/aunps/laccase生物阴极、含0.1m葡萄糖ph7.4的0.1mpb缓冲体系组装为电池，测量电池的eocv，记为enocv。
基于pefc的自供能mirna生物传感器超灵敏检测mirna的原理如图1和图2所示：
当无目标mirna时，cdsqds靠近电极表面，对g-c3n4起到敏化作用，光阳极光电流较大，流向生物阴极的电子较多，此时，pefc的开路电压较大；当引入目标mirna时，目标mirna与发卡dna由于配对作用形成的刚性双螺旋结构，使得cdsqds远离g-c3n4电极表面，使得cdsqds对g-c3n4的敏化作用减弱，随着引入mirna浓度的增加，远离g-c3n4表面发卡dna的量增加，cdsqds远离g-c3n4电极表面的量增加，光电流减弱，流向阴极的电子减少，从而导致pefc的开路电压减小，通过开路电压减小值与目标mirna对应关系得出mirna含量。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供了一种基于pefc的自供能mirna生物传感器，实现mirna简单、方便、快速、灵敏、高效检测，相对现有的mirna检测方法，具有以下特点：
(1)本发明所述的基于pefc的自供能mirna生物传感器，检测过程中无需外加电源，仅需两根电极即光引发生物燃料电池的阴阳两极和适宜的光源，整个检测设备简单，便于实现现场实时监测；
(2)本发明所述的cdsqds对g-c3n4的敏化作用，敏化效果良好，稳定性高，重复性好；
(3)本发明所述的基于pefc的自供能mirna生物传感器采用dna杂交配对进行分子识别，不仅具有极高选择性，还具有成本低、操作简单等优点；
(4)本发明所述的基于pefc的自供能mirna生物传感器中，具有优异光电活性的g-c3n4在pefc阳极提供电子，同时生物阴极go/cnts/aunps/laccase对氧气具有良好的电催化活性，实现对目标物mirna的超灵敏检测，大大提高了检测灵敏度；
(5)通过构建无额外供电设备的自供能生物传感器，不需要昂贵的仪器设备，可实现mirna检测的微型化、便携化和集成化。
附图说明
图1为基于pefc的自供能mirna生物传感器超灵敏检测mirna的原理图之一；
图2为基于pefc的自供能mirna生物传感器超灵敏检测mirna的原理图之二；
图3为基于pefc的自供能mirna生物传感器装置示意图；
图4(a)为修饰有不同浓度mirna的aunps-g-c3n4/hs-dna-nh2/mch/cds光阳极和go/cnt/aunps/laccase生物阴极联合的eocv值；
图4(b)为将mirna的不同浓度作为横坐标、mirna的不同浓度下测得的enocv值作为纵坐标的对数线性关系图。
具体实施方式
为了使本发明目的、技术方案更加清楚明白，下面通过实施例，对本发明作进一步详细说明。
实施例一：
基于pefc的自供能mirna生物传感器用于mirna-141的检测
(1)c3n4的制备：
将三聚氰胺与尿素按质量比1:1混合，置于管式炉中，以3℃/min升温至550℃后维持2h，获得的黄色块状固体即为c3n4，研磨至粉末备用；
(2)g-c3n4的制备：
取1g的步骤(1)中制得的c3n4，加入到100ml、5m的hno3中110℃回流8h，将回流得到的白色产物9000rpm多次离心洗涤至中性，将得到的洗涤液在3000rpm下离心15min，取上清液得到白色泛蓝胶体，即为剥离好的g-c3n4纳米片；
(3)aunps-g-c3n4的制备：
取2ml步骤(2)中制得的剥离好的g-c3n4纳米片溶解在4ml二次水中并超声0.5h，将20μl的haucl4在搅拌条件下加入到上述溶液中，超声10min，在室温下搅拌0.5h，重复加入三次haucl4，将126μl、0.04m新配制的nabh4快速加入到上述溶液中，持续搅拌20min，将200μl、0.01m的柠檬酸钠逐滴加入到上述溶液中，持续搅拌30min，之后将上述溶液5000rpm离心10min，二次水清洗一次，得到的沉淀分散于4ml二次水中，得到aunps-g-c3n4混合物；
(4)aunps-g-c3n4/hs-dna-nh2/mch/cds光阳极的制备：
将20μl步骤(3)中制得的aunps-g-c3n4滴涂在ito电极表面，将发卡dna用pb缓冲溶液稀释，用移液枪移取20μl发卡dna滴涂到修饰有aunps-g-c3n4光电活性材料的ito电极表面，将滴涂好的ito电极4℃孵育12h，用二次水多次冲洗；用pb缓冲溶液配制20mmedc和10mmnhs的混合溶液，使用edc和nhs的混合溶液将cds-coohqds溶液稀释至200nm，室温下避光放置，用移液枪移取20μl含有20mmedc及10mmnhs的cds-coohqds溶液滴涂到修饰有发卡dna的电极表面，室温下反应1h，二次水冲洗电极表面，滴加20μl1mm的mch室温孵育1h，封板，二次水冲洗电极表面，置于4℃备用。
(5)go/cnt/aunps的制备：
取0.08g的go分散在10ml二次水中，超声1h，再取0.04的cnts，加入到溶解完全的go悬浮液中，继续超声2h，取4ml的60nm的aunps加入到上述溶液中继续超声2h得到均匀悬浊液，将上述得到的悬浊液至于反应釜中180℃反应3h，得到go/cnt/aunps。
(6)go/cnt/aunps/laccase生物阴极的制备：
取一定量步骤(5)中制得的go/cnt/aunps超声溶解于二次水中，将20μl制得的go/cnt/aunps溶液滴涂在ito电极表面，37℃下干燥2h，滴涂10μl、30mg/ml的laccase溶液于修饰有go/cnt/aunps电极表面，37℃下干燥12h，二次水冲洗后，置于4℃备用。
(7)基于pefc的自供能mirna生物传感器的搭建和测量：
如图3所示，将修饰有go/cnt/aunps/laccase的ito电极作为生物阴极，修饰有aunps-g-c3n4/hs-dna-nh2/mch/cds的ito电极作为光阳极，转移到盛有含0.1m葡萄糖的0.1mpb缓冲溶液(ph＝7.4)的小池子中，利用两电极体系，工作电极夹生物阴极，参比电极和对电极接在一起夹光阳极，进行信号测试，测量pefc的eocv，记为e0ocv；
向aunps-g-c3n4/hs-dna-nh2/mch/cds光阳极电极表面滴涂20μl目标mirna，37℃孵育2h，得到aunps-g-c3n4/hs-dna-nh2/mch/cds/microrna光阳极，将该光阳极和go/cnt/aunps/laccase生物阴极组装成电池，测量pefc的eocv，记为enocv；
更换目标mirna的浓度，得到一系列enocv值，将mirna的不同浓度设为横坐标，将一系列mirna的不同浓度下测得的enocv值设为纵坐标，得到mirna浓度与enocv之间的线性关系，以便于通过测定的enocv值，根据线性关系得知具体的mirna浓度，达到检测mirna的目的。
本实施例中，mirna-141的dna序列为：5′-uaacacugucugguaaagaugg-3′；发卡dna的序列为5′-h2n-(ch2)6-ccatctttaccagacagtgttacaagatggttt-(ch2)6-sh-3′。
图4(a)为修饰有不同浓度mirna的aunps-g-c3n4/hs-dna-nh2/mch/cds光阳极和go/cnt/aunps/laccase生物阴极联合的eocv值，a-j分别为50.0am、100.0am、500.0am、1.0fm、5.0fm、10.0fm、50.0fm、100.0fm、500.0fm和1.0pm；图4(b)为将mirna的不同浓度作为横坐标，mirna的不同浓度下测得的enocv值作为纵坐标，得到的对数线性关系图。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而己，并不以本发明为限制，凡在本发明的精神和原则之内所作的均等修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的专利涵盖范围内。