本发明涉及生物检测领域，具体涉及在一个检测孔内同时进行定标校准和检测的方法。
背景技术：
：传统定标方法一般每次实验先取几个孔做标准曲线，然后不同样本的检测结果都根据这同一条标准曲线进行计算，是一种外部定标分析方法，这种方法的缺点是做标准曲线的实验和样本检测是两个完全独立的实验，因为它们的反应时间、反应温度、反应环境都不同，固定的标准曲线无法校正此类偏差。另外漏加样可能会导致假阴性结果，或洗板不充分，例如elisa/化学发光法，洗板不充分一般导致假阳性结果。由于免疫反应加样量一般都很少，即使发生漏加样，溶液体积也没有明显变化，无法及时发现并纠正。采用传统定标方法，漏加样时，该孔的检测结果会很低，存在将阳性结果误报为假阴性的风险。如果洗板不充分，传统的elisa等实验的结果可能会异常偏高，导致检测结果的假阳性。技术实现要素：本发明的目的是提供一种孔内定标测试方法，以解决
背景技术：
存在的上述缺陷。本发明是通过如下的技术方案实现的：一种孔内定标测试方法，包括如下步骤：步骤一，选择n种微珠包被不同浓度梯度的人igg抗原，获得n种标准微珠；步骤二，选择m种微珠包被不同浓度梯度的抗人igg，获得m种参考微珠；步骤三，选择一种微珠不包被任何抗原，作为空白微珠；步骤四，选择a种微珠包被与检测样本抗体相对应的抗原，获得a种检测微珠；步骤五，将所述标准微珠、参考微珠、空白微珠和检测微珠转移至样本稀释液并混合，得到复合微珠悬浮液；步骤六，稀释检测样本，将所述复合微珠悬浮液与稀释后的检测样本在过滤板的一个检测微孔中混合，温育；步骤七，洗涤，然后加入荧光标记物，温育；步骤八，采用流式荧光仪检测所述检测微孔中各微珠的荧光值，其中根据标准微珠的检测值拟合成标准曲线；根据参考微珠的检测值拟合成辅助曲线，监测是否存在严重异常；根据空白微珠的检测值监测体系中是否有非特异性反应；并将检测微珠的检测值与标准曲线对比后获得检测样本的定性和定量结果；其中，n＝1-20、m＝1-20、a＝1-50；所述微珠是经不同的荧光染料染色并编码的聚苯乙烯微球；上述各步骤中微珠的编码均不相同。优选的，所述微珠的直径为5-7微米，最好是5.6微米。所述标准微珠采用如下方法制备：制备微珠活化液，然后按照每毫升微珠中包含2-18ug人igg(免疫球蛋白g)的比例加入人igg，充分混合。所述微珠活化液，是将1000单位体积微珠加入反应管，加入5-50单位体积edc(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)和5-50单位体积sulfo-nhs(n-羟基硫代琥珀酰亚胺)活化而成。所述参考微珠采用如下方法制备：制备微珠活化液，然后按照每毫升微珠中包含8-15ug抗人igg的比例加入抗人igg，充分混合。步骤二中所述抗人igg，可以是羊抗-人igg、兔抗-人igg或鼠抗-人igg等。所述空白微珠即没有加入任何抗原的微珠活化液。优选的，所述标准曲线和辅助曲线，是选取线性、三次样条、逻辑蒂斯4p、逻辑蒂斯5p中的任意一种方法拟合的。作为优选的技术方案，所述荧光标记物是藻红蛋白标记的羊抗-人igg(特异性γ链)。步骤五中所述样本稀释液是含磷酸盐的缓冲液。优选的，样本稀释液中各组分的组成及含量如下：本发明方法是基于流式荧光技术。流式荧光技术以1-100号微球作为反应固相载体，不同编码的微球分别包被不同的抗原或抗体，变成不同的检测微珠，再将这些检测微珠按照一定的比例混合在一起。可一管同时定量检测1-100种不同的生物分子；具有高通量、高灵敏度、并行检测等特点。本发明是在上述技术的基础上，在混合检测微珠中额外添加了标准微珠、参考微珠和空白微珠来实现同一孔内的定标和校正。标准微珠用于绘制标准曲线，用于检测微珠的结果计算；参考微珠用于生成辅助曲线，辅助监测判断实验过程中是否存在严重异常，如漏加样本、洗板不充分、样本中存在严重干扰物质等；空白微珠可以监测反应体系中是否有非特异性反应。本发明采用1-n种标准微珠(每种标准微珠的微珠编码均不同，并且与空白微珠、检测微珠、参考微珠的编码也不同)，获得标准曲线。通过在1-n种微球上包被不同梯度的人igg抗原，结合了不同梯度人igg的标准微珠会与荧光标记物充分结合反应，在检测时发出不同梯度强度的荧光强度。通过线性、三次样条、逻辑蒂斯4p、逻辑蒂斯5p等拟合回归曲线，本孔内的检测项目都只通过本孔拟合的曲线进行计算。本发明采用1-m种参考微珠(每种参考微珠的微球编码均不同，并且与空白微珠、检测微珠、标准微珠的编码也不同)获得辅助曲线。通过在1-m种微球个上包被不同梯度的xx抗人igg(如：羊抗人igg，兔抗人igg等)，参考微珠与检测微珠一样，先与血清中的igg抗体结合反应，洗板后，再与荧光标记物结合，最后上机检测。通过线性、三次样条、逻辑蒂斯4p、逻辑蒂斯5p等拟合辅助曲线，辅助曲线来验证结果是否在一定的范围内，判断实验过程(加样、洗板等)或样本是否异常，避免直接报告假阳性或假阴性。本发明采用1种空白微珠(微珠编码与上述各种微珠的编码均不同)，作为对照，包被步骤与检测微珠的包被相同，但包被时的抗原用稀释液代替。空白微珠可以用于监测样本中是否存在严重的非特异反应。空白微珠检测的荧光值一般比较低，如果样本中存在严重的非特异反应，导致空白微珠发生了非特异反应，荧光值就会异常升高，系统会进行报警而不是直接显示结果，避免报告错误的假阳性结果。本发明的孔内定标测试方法，将标准微珠、参考微珠、空白微珠和检测微珠混合后，一起加入到同一个检测孔内，参与实验的反应，反应时间、反应温度、反应环境都完全一致，标准微珠获得的实验结果拟合成标准曲线，参考微珠获得的实验结果拟合成辅助曲线，同一个检测孔中的检测项目通过同一个检测孔的标准曲线和辅助曲线来计算。如果实验过程中漏加样本，标准曲线的结果正常，而辅助曲线的结果异常(没有血清中的igg抗体与参考微珠结合)，在此种情况下，软件会给出报警，而不是和传统标准曲线一样直接报告错误的假阴性结果。如果洗板不充分(如洗板机针头堵塞，洗液瓶用空，漏加洗液等)，多余的igg会和标准微珠、参考微珠和检测微珠竞争结合荧光标记物，标准微珠、参考微珠和检测微珠的检测结果都会比正常洗板情况下要同步减少，通过标准微珠的校正，即标准微珠和检测微珠的检测结果同步减少，使得检测结果得到一定的修正而更准确。另外，如果标准微珠或参考微珠结果超出一定范围，异常偏低，软件也会进行报警，提示结果异常，避免发出错误的报告。如果样本中含有干扰物质，空白微珠、标准微珠、参考微珠和检测微珠的检测结果都会比正常情况下要同步增加，通过标准微珠的校正，最后的检测结果会更准确。另外，如果空白微珠、标准微珠或参考微珠结果超出一定范围，异常偏高，软件也会进行报警，提示结果异常，避免发出错误的报告。本发明孔内定标检测方法的创新点在于：可以在每个检测孔内绘制独立的标准曲线，同一孔内的检测项目根据同一孔的标准曲线进行计算，不但节约了试剂用量，而且有效解决了外部标准曲线始终无法解决的标准曲线和检测项目反应时间、反应环境、反应温度的一致性问题，提高了结果的精准度；另外提供联合运用设计的标准曲线和参考曲线，可以有效监测漏加样、洗板不充分、样本有干扰等异常情况，避免直接报告错误的检测结果。具体实施方式本方法所述标准微珠采用如下方法制备：取1-n份微珠活化液，然后按照每毫升微球中包含2-18ug人igg(免疫球蛋白g)的比例加入人免疫球蛋白g，充分混合。1-n种标准微珠中人igg的含量在2-18ug的范围内均匀的依次递增。优选n＝3，即采用三种标准微珠，当采用3种标准微珠时，人igg的浓度分别为2-5ug/ml、6-10ug/ml、12-18ug/ml。所述微珠活化液是将1000单位体积微球(1-n份的微珠活化液的微球编码均不同，并且与空白微珠、检测微珠的编码也不同)加入反应管，加入5-50单位体积1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和5-50单位体积n-羟基硫代琥珀酰亚胺活化而成。本方法所述参考微珠采用如下方法制备：取1-m份微珠活化液，然后按照每毫升微球中包含2-18ugxx抗人igg(如：羊抗人igg，兔抗人igg等)的比例加入抗人igg，充分混合。1-n种参考微珠中抗人igg的含量在2-18ug的范围内均匀的依次递增。例如，当采用3种参考微珠时，抗人igg的浓度分别为2-5ug/ml、6-10ug/ml、12-18ug/ml。优选的，m＝1，即使用一种参考微珠。所述微珠活化液是将1000单位体积微球(1-n份的微珠活化液的微球编码均不同，并且与空白微珠、检测微珠的编码也不同)加入反应管，加入5-50单位体积1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和5-50单位体积n-羟基硫代琥珀酰亚胺活化而成。本方法所述空白微珠采用如下方法制备：取1份微珠活化液(需要使用与检测微珠编码不同的微球)，不加入任何病原体抗原作为空白微球，涡旋混匀30秒，超声混匀30秒，2-8℃摇匀过夜。制成空白微珠。所述微珠活化液是将1000单位体积微球(微球编码需与检测微珠的编码均不同)加入反应管，加入5-50单位体积1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和5-50单位体积n-羟基硫代琥珀酰亚胺活化而成。本方法所述复合微珠悬浮液是将空白微珠、标准微珠、参考微珠和检测微珠分别抽滤洗涤，经洗涤后的微球转移至样本稀释液中，混合。这样，在检测过程中，空白微珠、标准微珠、参考微珠和检测微珠一起加入到同一个检测孔内，参与实验的反应。流式荧光技术的实验过程一般如下：a、样本稀释。b、复合微珠悬浮液与样本中的抗体进行反应，温育30分钟。c、洗板，除去未与微球结合的其它抗原抗体。d、加入荧光标记物，温育20分钟。e、上机读数，每个检测孔中不同编码的微球都能获得独立的结果。每个检测孔中的1-n种标准微珠都有各自对应的靶值，检测后也都有对应的荧光结果，可以拟合成标准曲线(如线性、三次样条、逻辑蒂斯4p、逻辑蒂斯5p等回归曲线)，同一个检测孔中的检测项目通过同一个检测孔的标准曲线来计算，本孔内的检测项目都只通过本孔的曲线进行计算。下面以同时检测ssa-52和m2两个项目为例，通过具体实施例对本发明进行阐述，但并不限制本发明。实施例1复合微珠悬浮液及配套试剂的制备。具体制备过程如下：1、制备样本稀释液配方如表1：表1：样本稀释液配方编号试剂名称浓度1nacl8.0g/l2na2hpo4·12h2o2.9g/l3kcl2.4g/l4kh2po42.4g/l5tris0.3g/l6nan30.5g/l2、微珠的活化取1ml5.6微米的微珠(美国luminex公司的聚苯乙烯微球)加入1.5ml离心管中，加入5-50uledc(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)和5-50单位体积sulfo-nhs(n-羟基硫代琥珀酰亚胺)进行活化，得到微珠活化液。以上微珠活化液制作7份，每份的微球编码均不同。3、复合微珠悬浮液的制备取1份微珠活化液，加入ssa-52抗原10-100ug，涡旋混匀30秒，超声混匀30秒，2-8℃摇匀过夜。制成ssa-52检测微珠。取1份微珠活化液，加入m2抗原10-100ug，涡旋混匀30秒，超声混匀30秒，2-8℃摇匀过夜。制成m2检测微珠。取3份微珠活化液，分别标记为标准微珠1、标准微珠2和标准微珠3，校准微球1中加入2-5ug/ml的人igg，校准微球2中加入6-10ug/ml的人igg，校准微球3中加入12-18ug/ml的人igg，涡旋混匀30秒，超声混匀30秒，2-8℃摇匀过夜。制成标准微珠。取1份微珠活化液，加入8-15ug/ml的抗人igg，涡旋混匀30秒，超声混匀30秒，2-8℃摇匀过夜。制成参考微珠。取1份微珠活化液，不加入任何病原体抗原作为空白对照，涡旋混匀30秒，超声混匀30秒，2-8℃摇匀过夜。制成空白微珠。将上述各微珠抽滤洗涤，经洗涤后的微珠转移至样本稀释液中，混合，最后用样本稀释液定容至120ml。检验合格后，分装成20瓶，每瓶5.5ml。分别测定标准微珠、参考微珠、空白微珠的靶值，具体如表2：表2：各微珠的靶值空白对照标准-1标准-2标准-3参考-1靶值0u/ml44u/ml213u/ml457u/ml120u/ml4、荧光标记物：藻红蛋白标记的羊抗-人igg(igg-pe)：初始浓度1mg/ml。用样本稀释液稀释至工作浓度即可。工作浓度为0.6mg/l。5、洗涤液：组分及配方和样本稀释液相同，浓度是它的10倍。即本来配成1l,现在配成100ml。6、将上述配制好的复合微球悬浮液、荧光标记物、样本稀释液、洗涤液分别装入试剂瓶中备用。实施例2本发明孔内定标测试方法的检测操作过程步骤如下：1.把各成分从储存条件中取出，避免强光，使之恢复至室温(20-25℃)。2.确定试验所需样本总的数量。每个样本都需要一个微孔(见表3样本排列)。a.复合微球悬浮液在使用前应彻底混匀以获得最佳读取结果时间。最有效的方法是将微球悬浮液用混漩器振荡30秒，然后超声仪处理30秒。b.各试剂在使用时应彻底混匀。较合适的方法包括将微孔板放在混漩器上以约800rpm混匀30秒，或使用移液器吸取约1/2体积的反应液体反复吸打至少5次。表3：样本排列12a血清样本1血清样本9b血清样本2血清样本10c血清样本3血清样本11d血清样本4血清样本12e血清样本5血清样本13f血清样本6血清样本14g血清样本7根据需要添加样本h血清样本8根据需要添加样本备注：血清样本11中含有干扰成分，可导致非特异性反应。3.在稀释板中，按1：21稀释比例稀释每个血清样本(例如：将10ul血清样本+200ul样本稀释液)。注意：正确的操作要求：样本和样本稀释液要混合均匀，可按上述注2b操作。4.在确定检测所需的微孔数后，使用多通道移液器或重复使用移液器在过滤板的每个孔中加入50ul复合微球悬浮液。5.向过滤板的每孔中加入10ul经过1：21稀释后的样本。正确的操作要求：加入的物质要与孔中的复合微球悬浮液混合均匀，可按上述注2b操作。(血清样本12加样时特意漏加，以观察漏加样时的结果报告情况)6.过滤板置室温(20-25℃)温育30分钟。7.温育后，用真空抽滤泵按以下步骤对微球进行洗涤。a.将过滤板放在真空抽滤泵的托盘上，打开真空抽滤泵，移除孔内溶液，只剩下微球在板的底部。b.关闭真空泵，向过滤板的各孔内加入1x洗涤液200ul。c.再次使用真空泵移除溶液。d.重复7b、7c步骤，总共需要进行三次洗涤。(血清样本13洗板时特意漏加洗液，造成洗板不充分，以观察洗板不充分时的结果报告情况)8.最后一次洗涤结束后，轻轻吸干过滤板的底部，在下一步操作前，允许过滤板在空气干燥3-5分钟。9.在过滤板的每孔中加入150ul荧光标记物，按照样本加入的顺序和速率依次加入到过滤板中。正确的操作要求：加入的荧光标记物要与孔中的微珠混合均匀，可按上述注2b操作。作为一种选择，当加入荧光标记物混匀时，可以把混合物转移至一个空的聚苯乙烯反应板中。(血清样本14特意加入失效的荧光二抗，以观察试剂组分失效时的结果报告情况)10.过滤板室温(20-25℃)温育30±10分钟。11.选择美国luminex公司的luminex200多功能流式点阵仪的检测模板分析试验结果。可以从过滤板或反应板中读取结果。12.过滤板在荧光标记物温育完成后的60分钟内读取结果。读数之前振荡过滤板大约15秒。这个可选择的步骤可以减少读板所需的时间。实施例3孔内定标及结果计算过程。1、空白微珠、标准微珠、参考微珠和检测微珠的荧光强度(原始结果)如表4所示。表4：各微珠的的荧光强度2、每个检测孔，以(空白对照靶值，空白对照原始结果)、(标准微珠1靶值，标准微珠1原始结果)、(标准微珠2靶值，标准微珠2原始结果)、(标准微珠3靶值，标准微珠3原始结果)拟合线性标准曲线，并统计斜率、截距和相关性，检测项目的结果等于拟合曲线计算的结果乘以该检测项目的校正系数，本例中ssa52的校正系数是1.2，m2的校正系数是1.6，曲线参数和检测项目结果如表5所示。表5：标准曲线参数及计算结果斜率截距相关系数ssa52m2样本120.4-213.40.99722829样本220.1-380.60.98433442样本318.9-274.80.98934845样本422.8-216.30.990838148样本520.6-216.30.98842440样本619.5-382.40.998718148样本720.5-367.90.97933341样本821.4-339.80.99093240样本922.9-49.50.9983228样本1023.1303.30.999342307样本1117.43685.20.9995-139-87样本1219.85864.90.4643-343-452样本1319.4-360.80.98452836样本140.18.40.997147253、每个检测孔，以(0，0)、(参考微珠1靶值，参考微珠1原始结果)拟合线性参考曲线，并计算斜率，检测项目的结果等于拟合曲线计算的结果乘以该检测项目的校正系数，本例中ssa52的校正系数是1.2，m2的校正系数是1.6，参考曲线参数和检测项目结果如表6所示。表6：参考曲线参数及计算结果斜率ssa52m2样本114.92117样本215.81415样本318.234323样本418.832161样本515.81530样本615.320221样本717.61414样本817.21618样本918.33731样本1019.768385样本1134.458127样本127.73256样本132.25158样本140.21681074、通过空白对照原始结果、标准曲线的斜率、标准曲线的截距、标准曲线的相关系数、参考曲线的斜率，通过标准曲线和参考曲线计算结果的比值(简称曲线比值)来监测判断操作过程是否异常，只要有一项指标异常，该孔就给出报警信息，提醒用户复查。本例中相关参数范围如表7。不同试剂盒相关参数范围可能不同。表7：多种参数及控制范围只有a、b、c、d、e、f、g、h参数均符合要求，才会直接报告结果，否则会报告inv+异常代码(如inv:a、inv:d、inv:acd)来提醒用户该孔结果异常，避免直接报告错误的检测结果。多种参数对样本状态结果的确认如表8。表8：多种参数对样本状态结果的确认样本11中含有造成非特异反应的物质，检测结果显示inv:aef，查看原始结果发现样本11所有微球的结果都很高；样本12加样时漏加样本，检测结果显示inv:cg，查看原始结果发现标准微珠结果正常，而参考微珠结果异常；样本13洗板不充分，检测结果显示inv:efgh，查看原始结果发现标准微珠3和参考微珠的结果要普遍比其它孔的低；样本14加入了失效的荧光二抗，检测结果显示inv:bcdgh，查看原始结果发现所有微球的原始结果都很低。本发明实现了在同一个检测孔内同时进行定标校准和检测结果的计算，同时本发明可以对结果的有效性进行监测，防止漏加样本、非特异性反应、洗板不充分、试剂失效、仪器故障等原因造成的错误结果的直接报告。以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。当前第1页12