一种甲状腺髓样癌联合检测胶体金免疫层析试纸条的制作方法

本发明涉及免疫分析检测领域，更具体的，涉及一种甲状腺髓样癌联合检测胶体金免疫层析试纸条及其制备方法。

背景技术：

甲状腺髓样癌(mtc)来源于甲状腺滤泡旁细胞(又称c细胞)癌变，属于神经内分泌细胞。其主要特征为分泌降钙素及多种物质包括癌胚抗原，并产生淀粉样物质。1959年由hazand等首先提出作为一个独立的临床病理类型，其发病、诊断和治疗都独具特点。甲状腺髓样癌较少见，约占甲状腺癌的3～10％，属中度恶性。肿瘤侵犯血管，发生远处转移高达15％，常见肝、肺、骨转移，为mtc病人主要死因。mtc可以分为散发性和遗传性两大类，可见于任何年龄，散发性发病以中、老年多见，家族性发病年龄较早，男女发病无明显差异，病史较长，中等程度恶性，淋巴结转移多见且较早出现，转移率高，约10％出现双颈淋巴结转移，初诊颈淋巴结转移率可高达70％，其中1/4患者以此为首诊症状，晚期可经血行转移到肺、肝、骨等远处器官。生存率略低于乳头状癌，预后受多种因素影响，多发性内分泌肿瘤ⅱ-a型预后最好。

c细胞属于神经内分泌细胞，可合成分泌多种生物学活性物质，如降钙素、癌胚抗原、促肾上腺皮质激素、组织胺和血管活性肽等，其中降钙素是髓样癌特异性的肿瘤标志物，可作为甲状腺髓样癌诊断及判断手术疗效和术后复发的指标。

降钙素是一类多肽类激素，主要功能是降低血钙，降钙素增高对起源于滤泡旁细胞的甲状腺髓样癌的诊断、判断手术疗效和观察术后复发等有重要意义。降钙素是mtc敏感而特异性的指标，在未经刺激的情况下，血清降钙素明显高表达则提示mtc的存在。降钙素水平与mtc的肿瘤大小和分期呈正相关，降钙素水平翻倍时间反映了病变进展程度，与预后有关。

降钙素术后1周左右降至稳定水平，故此可将此时降钙素水平作为一个监测点，术前降钙素水平增高经手术治疗的mtc患者术后1个月血清降钙素水平降至正常说明肿瘤切除彻底，降钙素仍高于正常的患者多有肿瘤残留较易复发，术后血清降钙素水平升高表明肿瘤复发或远处转移。术后随访甲状腺髓样癌患者若发现降钙素持续增高，提示肿瘤残留复发或有远处转移，应行颈部b超、ct、mr等检查，必要时可行pet-ct检查，如能手术治疗者要选择二次手术或者进行放疗或分子靶向药物等治疗，很大程度上减少了患者辗转检查的痛苦，且节省了时间与成本。但临床上也发现有相当一部分mtc患者降钙素水平不高，这部分患者不能用降钙素来判断复发及预后。经过文献查证及反复试验，发现同样由c细胞分泌的癌胚抗原与mtc的病变程度也呈正相关关系。

癌胚抗原(cea)最初发现于结肠癌和胎儿肠组织中，cea升高常见于大肠癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌、甲状腺髓样癌等，但吸烟、妊娠期和心血管疾病、糖尿病、非特异性结肠炎等疾病也会升高，所以cea不是恶性肿瘤的特异性标志，只在诊断上有辅助价值。

超过50％的mtc存在血清cea的高表达，表达水平与降钙素具有同步性。mtc患者检测到的血清cea增高一般不会像消化道肿瘤那样明显，cea升高更容易发生在肿瘤分化比较差大病例中，如果mtc患者的降钙素水平稳定而cea持续升高往往说明肿瘤去分化，是预后不佳的标志。所以cea在预后阶段的跟踪监测是十分必要的。

由于血清cea半衰期较降钙素长，约为2-8天，因此mtc术后血清cea恢复正常的时间将更长。如肿瘤切除彻底，降钙素及cea在术后3个月一般全部恢复正常，但血清cea下降的过程较降钙素滞后。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种操作简单、灵敏度高、准确度高、低成本的甲状腺髓样癌降钙素、癌胚抗原联合检测胶体金免疫层析试纸，实现对人降钙素、癌胚抗原两种成分的同时联合检测。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种甲状腺髓样癌联合检测胶体金免疫层析试纸条，包括底板和依次设在所述底板上的样品垫、结合垫、分析膜和吸水垫，其特征在于，所述结合垫上结合有胶体金标记的抗人降钙素检测抗体和胶体金标记的抗癌胚抗原检测抗体，所述分析膜上设有人降钙素检测带t1线、癌胚抗原检测带t2线和质控带c线，所述降钙素检测带t1线、所述癌胚抗原检测带t2线和所述质控带c线上分别包被有抗人降钙素捕获抗体、抗癌胚抗原捕获抗体和羊抗鼠igg多克隆抗体，人降钙素和癌胚抗原的氨基酸序列分别为seqidno:1和seqidno:4所示，所述抗人降钙素检测抗体对应具有如seqidno:2～seqidno:3任一所示氨基酸序列的抗原表位，所述抗人降钙素捕获抗体对应seqidno:2～seqidno:3中余下一项所示的氨基酸序列的抗原表位，所述抗癌胚抗原检测抗体对应具有如seqidno:5～seqidno:6任一项所示氨基酸序列的抗原表位，所述抗癌胚抗原捕获抗体对应seqidno:5～seqidno:6中余下一项所示的氨基酸序列的抗原表位。

试纸条的检测原理：当待检测样品加样到样品垫上之后，样品中的人降钙素和癌胚抗原分别与结合垫上的胶体金标记的人降钙素检测抗体、癌胚抗原检测抗体形成免疫复合物，由于毛细血管效应，免疫复合物向吸水垫方向泳动，分别与包被在人降钙素检测带t1线和癌胚抗原检测带t2线上的捕获抗体结合，金标人降钙素检测抗体-人降钙素抗原-人降钙素捕获抗体三联体复合物被截留在人降钙素检测带t1线上，金标癌胚抗原检测抗体-癌胚抗原-癌胚抗原捕获抗体三联体复合物被截留在癌胚抗原检测带t2线上，逐渐富集形成较深的紫红色条带，金标标记的人降钙素检测抗体和癌胚抗原抗体与包被在质控线c线上的羊抗鼠igg多克隆抗体发生免疫反应被截留，逐渐富集在质控线c线上形成较深的紫红色条带，多余的未结合物质继续泳动到吸水垫上，因此在检测带和质控带都出现条带的判断为阳性结果；若血清样品中不含有降钙素和癌胚抗原，金标的检测抗体到达检测带时，不与包被在检测带上的捕获抗体发生免疫反应，因此在检测带处没有出现显色带，而金标标记人降钙素和癌胚抗原检测抗体继续向前泳动与包被于质控线c线处的相应的羊抗鼠igg多克隆抗体发生特异性的免疫反应而被截留，逐渐富集在质控线c线上形成紫红色条带，因此质控带c线出现条带而检测带t1、t2线为形成条带判断为阴性结果，若质控带与其中一条检测带显色，另一条检测带不显色，则判断结果为阴性。

与现有技术相比，本发明的优点为：使用方便快速，便于基层或现场使用，所有反应可以在20min内完成；成本低，不需要特殊的仪器设备；应用范围广，可适用多种检测条件；可以进行多项检测，弱阳性样本比较难获得，多项检测可以节省样品，降低成本；对温度无特殊要求，无需冷冻保存，存储运输方便，室温可保存24个月；胶体金本身为红色，不需要加入发色试剂，省却了酶标的致癌性底物及终止液的步骤，对人体无毒害；检测特异性及灵敏度高。

本发明还提供了一种上述甲状腺髓样癌联合检测胶体金免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：

(1)制备抗人降钙素检测抗体、抗人降钙素捕获抗体、抗癌胚抗原检测抗体、抗癌胚抗原捕获抗体和羊抗鼠igg多克隆抗体，；

(2)将抗人降钙素检测抗体和抗癌胚检测抗体用胶体金进行标记，并喷涂在玻璃纤维膜或聚酯膜上，制得结合垫；

(3)将抗人降钙素捕获抗体、抗癌胚抗原捕获抗体以及羊抗鼠igg抗体分别包被在硝酸纤维素膜的降钙素检测带t1线、癌胚抗原检测带t2线以及质控带c线上制备得到分析膜；

(4)将样品垫、结合垫、分析膜和吸水垫裁成合适的尺寸，并依次搭接在底板上，制得甲状腺髓样癌联合检测胶体金免疫层析试纸条。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进：

进一步，所述所述样品垫的材质为玻璃纤维素膜或聚酯膜。

进一步，所述样品垫为玻璃纤维膜或聚酯膜经样品垫处理液浸泡后于室温、湿度不高于30％的条件下干燥制得，所述样品垫处理液包括0.01mpbs缓冲液，0.1wt％tween-20,1wt％牛血清蛋白和10wt％蔗糖。

进一步，所述步骤(2)的具体步骤为：取胶体金溶液100ml，调节ph至6.5～8.0，依次加入0.5～2mg抗人降钙素检测抗体和抗癌胚抗原检测抗体，室温搅拌1h，用酪蛋白或bsa封闭，12000r/min离心30min，弃上清，用胶体金工作液复溶至70ml，喷涂至玻璃纤维膜上，于室温、相对湿度不高于30％的条件下干燥得到所述结合垫。

进一步，所述胶体金的直径为25～35nm。

进一步，所述胶体金工作液包括1wt％牛血清白蛋白、0.1mtris-hcl缓冲液和20wt％蔗糖。

进一步，所述步骤(3)的具体步骤为：将所述抗人降钙素捕获抗体和抗癌胚抗原捕获抗体分别用包被缓冲液稀释至0.5～1.5mg/ml,将羊抗鼠igg多克隆抗体稀释至1～2mg/ml，然后以1～2ul/cm分别喷涂于人降钙素检测带t1线、癌胚抗原检测带t2线和质控带c线上，于室温、相对湿度不高于30％的条件下干燥。

进一步，所述包被缓冲液为硼酸盐、碳酸盐、磷酸盐、tris-盐酸或tris-磷酸盐缓冲液中的任一种，所述包被缓冲液的浓度为0.01m，所述包被缓冲液的ph值为6.5～7.5，更优选的，ph为7.0～7.4。

本发明还提供上述甲状腺髓样癌联合检测胶体金免疫层析试纸条的使用方法，包括以下步骤：

(1)样品处理：取血清、血浆或全血样本，用加样缓冲液稀释0～100倍；

(2)取上述处理过的样品80ul滴加到试纸条的样品垫上，静置5～20min，观察t1、t2和c线；

(3)结果判断：t1、t2线和c线均呈现条带，结果为阳性；t1、t2线无条带呈现，c线呈现条带，结果为阴性；t线和c线均不呈现条带，提示试纸失效。

附图说明

图1为本发明甲状腺髓样癌联合检测胶体金免疫层析试纸条结构示意图；

图2为本发明不同检测结果示意图，其中a是条带示意图，b为阳性结果图，c、d、e为隐性结果图，f和g表示试纸条失效结果图；

附图中，各标号所代表的部件列表如下：

1、样品垫，2、结合垫，3、分析膜，4、人降钙素检测带t1线，5、癌胚抗原检测带t2线，6、质控带c线，7、吸水垫，8、底板。

具体实施方式

以下结合附图及具体实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1抗降钙素(ct)、癌胚抗原(cea)特异性抗体的制备

(1)人抗降钙素(ct)、癌胚抗原(cea)抗原表位肽制备

根据ncbi等数据库查找人降钙素(ct)、癌胚抗原(cea)的氨基酸序列，其中人降钙素和癌胚抗原的序列氨基酸序列分别为seqid:1和seqidno:4,具体序列如下：

人降钙素(ct):csnlstcvlgklsqelhklqtyprtntgsgtp(seqidno:1)；

人癌胚抗原

(cea):mespsapphrwcipwqrllltaslltfwnppttakltiestpfnvaegkevlllvhnlpqhlfgyswykgervdgnrqiigyvigtqqatpgpaysgreiiypnaslliqniiqndtgfytlhviksdlvneeatgqfrvypelpkpsissnnskpvedkdavaftcepetqdatylwwvnnqslpvsprlqlsngnrtltlfnvtrndtasykcetqnpvsarrsdsvilnvlygpdaptisplntsyrsgenlnlschaasnppaqyswfvngtfqqstqelfipnitvnnsgsytcqahnsdtglnrttvttitvyaeppkpfitsnnsnpvededavaltcepeiqnttylwwvnnqslpvsprlqlsndnrtltllsvtrndvgpyecgiqnelsvdhsdpvilnvlygpddptispsytyyrpgvnlslschaasnppaqyswlidgniqqhtqelfisniteknsglytcqannsasghsrttvktitvsaelpkpsissnnskpvedkdavaftcepeaqnttylwwvngqslpvsprlqlsngnrtltlfnvtrndarayvcgiqnsvsanrsdpvtldvlygpdtpiisppdssylsganlnlschsasnpspqyswringipqqhtqvlfiakitpnnngtyacfvsnlatgrnnsivksitvsasgtspglsagatvgimigvlvgvali(seqidno:4)。

将人ct和cea氨基酸序列分别导入抗原表位设计软件，将位于蛋白质构象外部氨基酸序列统计出来，再将ct和cea氨基酸序列分别导入dnastar软件，通过抗原表位预测工具进行预测，并并通过westernblot和elisa试验进行筛选，最终分别得到两种具有良好抗原性的抗原表位肽。其中ct的两种抗原表位肽分别为肽段ct-1和肽段ct-2，cea的两种抗原表位肽分别为肽段cea-1和肽段cea-2，肽段ct-1和肽段ct-2的氨基酸序列分别为seqidno:2和seqidno:3，其中ct-1为人ctn端第1位至第14位氨基酸，其氨基酸序列为：csnlstcvlgklsq(seqidno:2)，ct-2为人ctc端第18位至第32位氨基酸，其氨基酸序列为：klqtyprtntgsgtp(seqidno：3)；cea-1为人cean端第35位至第114位氨基酸，其氨基酸序列为kltiestpfnvaegkevlllvhnlpqhlfgyswykgervdgnrqiigyvigtqqatpgpaysgreiiypnaslliqniiq(seqidno：5)，cea-2位人ceac端第502位至第593位氨基酸，其氨基酸序列为：kpsissnnskpvedkdvavftcepeaqnttylwwvngqslpvsprlqlsngnrtltlfnvtrndarayvcgiqnsvsanrsdpvtldvlygp(seqidno：6)。

上述肽段均具有亲水性、抗原性强并且易于合成的特点，抗原表位肽的制备利用美国abi431a型多肽自动合成仪，通过固相法合成，并通过多肽序列鉴定所合成的抗原表位肽序列，肽段的纯度可用薄层色谱和高效液相色谱进行评定，并测定抗原表位肽的浓度。

(2)抗体的制备

分别将肽段ct-1、ct-2、cea-1、cea-2与载体蛋白连接制备免疫用抗原，利用所得免疫性抗原分别免疫动物，制备特异性的单克隆抗体。

抗原的制备：将肽段ct-1、ct-2、cea-1、cea-2分别与载体蛋白bsa连接制备成免疫用抗原，取ph为6.0的0.01mol/l的pbs和二甲亚砜(dmso)各0.25ml将5mgbsa溶解，取1.2mg2-(n-吗啡啉)乙磺酸(mbs)溶于100mldmso中，并将mbs溶液加入bsa溶液中室温搅拌30min，然后4℃5000rpm离心留取上清液，将肽段ct-1、ct-2、cea-1和cea-2分别溶于ph为7.2的0.01mol/l的pbs和dmso总计500μl中，将各肽段溶液分别和bsa-mbs溶液混合，室温搅拌60min后贮存于-20℃备用，pbs缓冲液用0.2mol/l的na2hpo481ml加0.2mol/l的nah2po419ml配制而成。

免疫动物制备单克隆抗体：将上述制备的免疫用抗原分别与等体积的弗氏完全佐剂充分混合后，免疫balb/c小鼠，按照每只小鼠50μg抗原皮下多点注射，4周后测血清效价，选择免疫反应性好的小鼠再加强免疫，取抗原与等体积的弗氏不完全佐剂充分混合后，按照每只小鼠25μg抗原皮下多点注射，加强免疫的次数为6次，融合前加强免疫两次，然后取脾细胞与sp2/0骨髓瘤细胞按常规方法用50％的peg(mw4000)介导进行融合并放入co2培养箱中37℃培养10天后，培养孔内出现较大的细胞克隆，用间接elisa进行筛选，对初筛阳性的培养孔利用有限稀释法进行4次克隆化培养(即使筛选后的细胞大量分裂繁殖)，之后扩增细胞、冻存、制备腹水，将balb/c小鼠用降植烷0.6ml/只进行处理，一周后腹腔接种杂交瘤细胞3×10⁶个/只，10天后收集腹水，测定抗体效价，用间接elisa方法测定用bsa-ct-1和bsa-cea-1制备的单克隆抗体效价达到1:35000以上，用bsa-ct-2和bsa-cea-2制备的单克隆抗体效价高达1:33000以上。

实施例2甲状腺髓样癌人降钙素和癌胚抗原联合检测胶体金免疫层析试纸条制备

如图1所示，甲状腺髓样癌人降钙素和癌胚抗原联合检测胶体金免疫层析试纸条包括底板8和依次设在底板8上的样品垫1、结合垫2、分析膜3和吸水垫7，分析膜上设有人降钙素检测带t1线、癌胚抗原检测带t2线和质控带c线，结合垫2上包被有人降钙素检测抗体和癌胚抗原检测抗体，降钙素检测带t1线上包被有人降钙素捕获捕获抗体，癌胚抗原检测带t2线上包被有癌胚抗原捕获抗体，质控带c线上包被有羊抗鼠igg抗体，其中人降钙素检测抗体和人降钙素捕获抗体分别为肽段ct-1和ct-2制备的免疫用抗原制备得到的单克隆抗体，癌胚抗原检测抗体和癌胚抗原捕获抗体分别为肽段cea-1和cea-2制备的免疫用抗原制备得到的单克隆抗体。

(1)结合垫的制备

用氯金酸-柠檬酸三钠法制备直径为25～35nm的胶体金溶液，取100ml胶体金液放在烧杯内，用0.2m的k2co3调至ph为6.5～8，再分别加入0.5～2mg人降钙素检测抗体和癌胚抗原检测抗体，室温搅拌半小时，用酪蛋白或者bsa封闭，12000r/min离心30min，弃上清，配置胶体金工作液，包括包括1％牛血清白蛋白、0.lmtris-hcl缓冲液、20％蔗糖，ph值为8.0，用胶体金工作液将沉淀复溶至70ml，结合垫的材质为玻璃纤维纸或聚酯膜，用配制好的结合垫处理液浸泡玻璃纤维纸或聚酯膜，在37℃放置17h烘干，按照包被量为1.2μl/cm的量将胶体金标记的抗人降钙素检测抗体和胶体金标记的抗癌胚抗原检测抗体喷涂在预处理的玻璃纤维膜或聚酯膜上于室温、相对湿度不高于30％(一般在15％～30％)的条件下干燥，密封保存备用。

(2)分析膜的制备

分析膜选用硝酸纤维素膜(nc)，将人降钙素捕获抗体、癌胚抗原捕获抗体、分别加入ph为7.2的10mmpb缓冲液中配制成浓度为0.4mg/ml的捕获抗体溶液，用划膜喷金仪分别喷在硝酸纤维膜上的人降钙素检测带t1线和癌胚抗原检测带t2线上，喷涂量为1μl/cm，羊抗鼠igg多克隆抗体加入ph为7.2的10mmpb缓冲液中配制成浓度为0.4mg/ml的多克隆抗体溶液中，用划膜喷金仪喷在质控带c线上，喷涂量为1μl/cm，其中人降钙素检测带ti线距离结合垫9mm，癌胚抗原检测带t2线与质控带c线的距离约为3mm，质控带c线距离吸水垫约7mm，然后分析膜37℃烘干，封装备用。

(3)样品垫的制备

样品垫的材质为玻璃纤维膜，用配制好的样品垫处理液浸泡样品垫，在37℃下干燥17h得到样品垫。其中样品垫缓冲液：ph为7.0～9.0的10mmpb缓冲液，1％bsa，10％～20％蔗糖，0.1％tween-20，样品垫也可不做预处理，直接使用。

(4)试纸条的组装

将样品垫、结合垫、分析膜和吸水垫依次裁剪成合适的尺寸，其中宽度为3～4mm，长度为7cm，t线、t2线及c线之间的间距为3mm，将分析膜贴合在底板的中间，分析膜的左右两端分别贴有结合垫和吸水垫，且分别与分析膜的两端重叠，结合垫远离分析膜的一端贴合有样品垫。

试纸条的检测原理：当待检测样品加样到样品垫上之后，样本中的人降钙素和癌胚抗原分别与结合垫上的胶体金标记的人降钙素检测抗体、癌胚抗原检测抗体形成免疫复合物，由于毛细血管效应，免疫复合物向吸水垫方向泳动，分别与包被在人降钙素检测带t1线和癌胚抗原检测带t2线上的捕获抗体结合，金标人降钙素检测抗体-人降钙素抗原-人降钙素捕获抗体三联体复合物被截留在人降钙素检测带t1线上，金标癌胚抗原检测抗体-癌胚抗原-癌胚抗原捕获抗体三联体复合物被截留在癌胚抗原检测带t2线上，逐渐富集形成较深的紫红色条带，金标标记的人降钙素检测抗体和癌胚抗原抗体与包被在质控线c线上的羊抗鼠igg多克隆抗体发生免疫反应被截留，逐渐富集在质控线c线上形成较深的紫红色条带，多余的未结合物质继续泳动到吸水垫上，因此在检测带和质控线都出现条带的判断为阳性结果；若血清样品中不含有降钙素和癌胚抗原，金标的检测抗体到达检测带时，不与包被在检测带上的捕获抗体发生免疫反应，因此在检测带处没有出现显色带，而金标标记人降钙素和癌胚抗原检测抗体继续向前泳动与包被于质控线c线处的相应的羊抗鼠igg多克隆抗体发生特异性的免疫反应而被截留，逐渐富集在质控线c线上形成紫红色条带，因此仅在质控线c线上出现条带判断为阴性结果，若质控带与其中一条检测带显色，另一条检测带不显色，则判断结果为阴性，不同的检测结果如图2所示。

试验例1试纸条性能评估

试纸条性能包括稳定性、批内不精确度和批间不精确度评估。

(1)4℃稳定性试验

将试纸条用小铝箔袋密封，放置2～28℃仓库，每月取出用质控品和阴阳性参考品各10份的阴阳性复合率的批内精密度来判断试纸的稳定性。12个月后结果显示，质控品检测结果符合预期，各个阴阳性参考品的阴阳性符合率为100％。18个月后结果显示，各个阴阳性参考品的阴阳性符合率仍为100％。24个月后检测结果显示，未出现假阴性。综合以上结果说明试纸在2～28℃贮存，2年内是稳定的。

(2)批内精确度

取各一个批次的金标试纸条，分别用高、中、低三种阳性血清和阴性血清各一份，每份血清分别用金标试纸条和胶乳试纸条重复检测10次，结果如表1所示所有阳性血清的检测结果均为阳性，所有阴性血清的检测结果均为阴性，提示本发明的胶体金试纸条批内精确度符合标准。

表1

(3)批间精确度

试纸条1～3各三个批次，用高、中、低三种阳性血清和阴性血清检测，每份血清检测10条，10min后观察结果，结果如表2所示，各三个不同批次的检测结果一致，说明批间精确度符合标准。

表2

试验例2试纸条检测及临床性能评估

用实施例2制备的试纸条检测确诊的患者和正常人血清和血浆各100例，其中检测灵敏度为在所有临床阳性病例数中试纸条检测阳性数所占的百分比，检测特异性为在所有临床阴性病例数中试纸条检测阴性数所占的百分比，检测结果如表3所示。

表3

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>施康培医疗科技（武汉）有限公司

<120>一种甲状腺髓样癌联合检测胶体金免疫层析试纸条

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>32

<212>prt

<213>人类(homosapiens)

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cysserasnleuserthrcysvalleuglylysleuserglngluleu

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<212>prt

<213>人类(homosapiens)

<400>4

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