测定石墨烯在水稻体内亚细胞分布的方法与流程

本发明专利涉及到一种测定石墨烯在水稻体内亚细胞分布的方法，属于纳米技术在农业领域的应用开发。

背景技术：

石墨烯是由平滑的单层碳原子组成的二维蜂巢晶格结构，是其他石墨材料的基本构件。石墨烯裹起来能形成零维富勒烯，卷起来能形成一维碳纳米管，或者堆积起来形成三维石墨。自2004年由英国曼彻斯特大学geim和novoselov首次从石墨上剥离出石墨烯以来，由于其拥有许多非比寻常的物理化学性质，如高热导率、内在强度、高导电性、高透光度、气体不渗透性和易官能化，石墨烯研究就飞速发展，石墨烯的研究也拓展至各科学研究领域，例如电子、光学、传感器、能源储存和转换、环境污染处理等方面。

近年来，随着纳米技术的进一步发展，科学家逐渐将纳米技术应用于农业领域。其中主要涉及的研究方向为纳米农药、纳米肥料、纳米疫苗、纳米饲料和添加剂以及纳米激素等。有科学家研究了纳米颗粒型抗氧化剂与从植物体内提取出来的叶绿体之间的相互作用，结果发现纳米颗粒型抗氧化剂能够消耗叶绿体中产生的活性氧物种，从而能够保护叶绿体的光活性，这也间接表明纳米颗粒能够保护叶绿体活性，从而促进植物的光合作用。对于碳纳米材料，由于其具有较好的稳定性以及独特的光学、电子性质，因此一旦其进入植物体内，其可能大大促进叶绿体的光合作用。例如，有研究表明单壁碳纳米管能够吸收较宽波长范围的光子，因此能够吸收更多的太阳能，从而将其储存起来以促进植物光合作用中的光电传递速率。然而目前存在的主要问题是石墨烯进入植物体内，如何准确定量其在体内亚细胞内的分布，这对于评估植物体内石墨烯的存在对植物光合作用中光电传递效率以及对植物生长等方面的影响具有重要的研究意义。此外，与其他关于可溶性有机物在植物体内亚细胞分布的研究不同的是，石墨烯作为一种纳米粒子，在通过差速离心法将亚细胞各组分分离时，石墨烯可能会聚集、沉降或吸附在各组分表面，如果按照常规的方法来测定石墨烯在各亚细胞组分中的规律可能会得出阳性结果。

为避免出现这种阳性结果的出现，本发明设置了多个对照组实验以扣除石墨烯在亚细胞各组分分离过程中出现的聚集、沉降或吸附等因素的影响。对于准确定量石墨烯在植物体内亚细胞分布规律具有重要的意义。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明公开了一种测定石墨烯在水稻体内亚细胞分布的方法。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种测定石墨烯在水稻体内亚细胞分布的方法，其步骤包括：

(1)对水稻种子进行发芽处理，待种子萌发后，挑选芽和根系发育一致的幼苗分别转移到含有石墨烯母液和不含有石墨烯母液中进行培育，其中在不含石墨烯母液中培育的幼苗为空白对照组，其中芽和根系发育一致是指芽和根系的发育的长度比例比较均衡，优选为芽和根系的长度基本一致的幼苗；

(2)对上述水稻幼苗培育7-21天，培育结束后，先将其剪碎、液氮冷冻后充分研磨；待液氮蒸发完毕后加入预冷的匀浆介质继续研磨，随后将匀浆液倒入离心管中，再用匀浆介质清洗研钵数次，清洗液均汇入盛有匀浆液的离心管中，将离心管中的液体摇匀，过滤，滤液用作随后的离心；

(3)通过差速离心法将步骤(2)收集的匀浆液分离出5个部分：细胞壁、叶绿体、细胞核、线粒体和可溶性部分；

(4)检测步骤(3)得到的在石墨烯溶液中培育的幼苗的5个组分的石墨烯含量；

(5)离心管中分别加入步骤(3)中获得的空白对照组的5个亚细胞组分，然后滴加石墨烯母液振荡摇匀，再分别按照权利要求1步骤(3)中的离心条件进行离心，最后分别测定5个亚细胞组分匀浆介质中的石墨烯含量；

(6)将同样含量的石墨烯母液滴加到5份同样体积的匀浆介质不含亚细胞组分的样品中振荡摇匀，再分别按照步骤(3)中的离心条件进行离心，最后测定滴加石墨烯母液的匀浆介质中石墨烯含量；

(7)将步骤(6)中得到的石墨烯含量减去步骤(5)中的得到的石墨烯含量即为细胞器吸附的石墨烯的含量；

(8)石墨烯在水稻体内亚细胞的绝对含量为步骤(4)中的石墨烯含量减去步骤(7)得到的石墨烯含量。

优选的，石墨烯母液的浓度为50-250μg/l，石墨烯母液的溶剂为水。

优选的，匀浆介质中含有0.25mmol/l蔗糖，50mmol/ltris-hcl(ph7.5)，和1mmol/l二硫赤藓糖醇，溶剂为水，步骤(2)中每0.2g剪碎的幼苗中加入1ml预冷到4℃匀浆介质进行研磨。优选的，步骤(2)中每次用1ml匀浆介质清洗研钵，清洗4次。

优选的，步骤(2)中采用80μm孔径的尼龙网过滤。

优选的，步骤(5)中在4℃条件下将1μg石墨烯的母液滴加到5ml空白对照组的各亚细胞组分中。

优选的，步骤(6)中在4℃条件下将1μg石墨烯的母液滴加到5ml匀浆介质中。

优选的，分别测定石墨烯在幼苗的茎或叶中的亚细胞分布状态。

与其他关于可溶性有机物在植物体内亚细胞分布的研究不同的是，石墨烯作为一种纳米粒子，在通过差速离心法将亚细胞各组分分离时，石墨烯可能会聚集、沉降或吸附在各组分表面，如果按照常规的方法来测定石墨烯在各亚细胞组分中的规律可能会得出阳性结果。

为避免出现这种阳性结果的出现，本发明设置了多个对照组实验以扣除石墨烯在亚细胞各组分分离过程中出现的聚集、沉降或吸附等因素的影响。对于准确定量石墨烯在植物体内亚细胞分布规律具有重要的意义。

本发明所涉及的一种测定石墨烯在水稻体内亚细胞水平分布的方法，该方法简单，易操作，并且设置了不同的对照组，避免了在分离过程中石墨烯聚集、沉降或在亚细胞各组分的吸附等因素对分布结果的影响。因此本发明可以更加准确的测定亚细胞各组分中石墨烯的含量，即石墨烯在水稻组织的细胞壁、叶绿体、细胞核、线粒体中的分布水平。对于探索石墨烯在水稻体内亚细胞的分布规律与植物的光合作用之间的关系有重要意义。

附图说明

图1为石墨烯在茎叶中的亚细胞分布分离步骤简图。

图2为不同暴露时间下石墨烯在水稻茎的亚细胞分布结果图。

图3为不同暴露时间下石墨烯在水稻叶的亚细胞分布结果图。

图2和图3中x轴标注名称：

f1：细胞壁

f2：叶绿体

f3：细胞核

f4：线粒体

f5：可溶性部分。

具体实施方式

实施例1石墨烯在有/无细胞器时离心的沉降效率及细胞器对石墨烯的富集效率

(1)种子发芽及石墨烯暴露：将新收获的种子先浸泡在30％的h2o2溶液中15min，再用去离子水清洗三次以确保种子表面无菌。然后把种子浸泡在去离子水中，30℃黑暗中存放48h。最后浸泡好的种子均匀陈列在消毒过的培养皿中，培养皿底部垫有两层消毒过的湿润滤纸，将培养皿盖好放置在30℃的光照培养箱中培养7天。发芽结束后，将其转移到包含2l暴露液的容器中，其中石墨烯的浓度为0μg/l。

(2)暴露7天后，收集水稻叶片，准确称取0.2g，将其匀浆离心获得叶绿体组分，滴加5ml匀浆介质重新悬浮获得的叶绿体。将石墨烯母液滴加到重悬浮匀浆液中，其中石墨烯的浓度梯度为50-250μg/l。

(3)由于石墨烯的吸收或吸附可能会使悬浮液中的叶绿体变得更重，因此设置300g和1500g两种离心速度，离心时间为10min。离心完毕后，除去上清液，再次用匀浆介质重悬浮沉淀。利用紫外分光光度计检测叶绿体含量(λ＝664nm和647nm)。同时测定0-200μg/l纯石墨烯悬浮液在这两种波长下的吸光度。

(4).4℃条件下，5个10ml离心管分别加入5ml从水稻叶片中获得的5个亚细胞组分中。然后滴加含有1μg石墨烯的母液振荡摇匀3h。然后分别按照差速离心法进行离心。最后测定5个亚细胞组分中的石墨烯含量。

(5).4℃条件下，将含有1μg石墨烯的母液滴加到5个只含5ml匀浆介质不含亚细胞组分的样品中，振荡3h，然后分别按照差速离心法进行离心。最后测定匀浆介质中的石墨烯含量。

(6).4℃条件下，将含有1μg石墨烯的母液滴加到对照组植株的亚细胞样品中，振荡摇匀3h。分别按照步骤(3)中的离心条件离心。离心完毕后，倒去上清液，将去离子水轻轻加入到离心管中重新悬浮亚细胞组分，避免团聚沉降的自由态石墨烯悬浮。最后测定悬浮液中石墨烯的含量。

实施例2不同暴露时间下石墨烯在水稻茎的亚细胞分布结果

(1)种子发芽及石墨烯暴露：将新收获的种子先浸泡在30％的h2o2溶液中15min，再用去离子水清洗三次以确保种子表面无菌。然后把种子浸泡在去离子水中，30℃黑暗中存放48h。最后浸泡好的种子均匀陈列在消毒过的培养皿中，培养皿底部垫有两层消毒过的湿润滤纸，将培养皿盖好放置在30℃的光照培养箱中培养7天。发芽结束后，将其转移到包含2l暴露液的容器中，其中石墨烯的浓度为250μg/l。同时，另设一组空白对照组，即发芽结束后，将其转移到2l不含石墨烯的的溶液中。

(2)分别暴露7天、14天和21天后，分别收集石墨烯暴露组合空白对照的水稻的茎组织，将其剪碎，液氮冷冻后充分研磨；其次待液氮蒸发完毕后加入1ml预冷的匀浆介质继续缓慢研磨15s。随后将匀浆液缓慢倒入10ml离心管中，再用1ml匀浆介质清洗研钵四次，清洗液都汇入盛有匀浆液的离心管中。将离心管中的液体摇匀，用一层尼龙网过滤，滤渣为未研碎组织，滤液用作随后的离心。

(3)首先将石墨烯暴露组的匀浆液以300g转速离心30s，沉淀即为细胞壁，主要包括细胞壁和细胞壁碎片。滤液以1500g转速离心10min，沉淀即为色素体部分。上清液以5000g转速离心20min，沉淀即为细胞核部分。上清液以15000g转速离心30min，沉淀即为线粒体部分，上清液即为可溶性部分。

(4)将步骤(3)中所得到的茎的亚细胞组分利用生物氧化仪燃烧处理，收集生成的二氧化碳，然后通过液体闪烁计数器测定各组分中的石墨烯含量，设为a。

(5)其次将空白对照组中的匀浆液按照步骤(3)的方法得到各亚细胞组分，然后向5ml的各亚细胞组分中滴加含有1μg石墨烯的母液并振荡摇匀3h。然后分别按照差速离心法进行离心，最后测定匀浆介质中的石墨烯含量，设为b。另外，将含有1μg石墨烯的母液滴加到5个只含5ml匀浆介质不含亚细胞组分的样品中，振荡3h，然后分别按照差速离心法进行离心。最后测定匀浆介质中的石墨烯含量，设为c。通过c-b计算得到各亚细胞组分对石墨烯的吸附量。

(6)最后计算各亚细胞组分中石墨烯的真实含量，设为d，即d＝a-(c-b)。

实施例3不同暴露时间下石墨烯在水稻叶的亚细胞分布结果

(1)种子发芽及石墨烯暴露：将新收获的种子先浸泡在30％的h2o2溶液中15min，再用去离子水清洗三次以确保种子表面无菌。然后把种子浸泡在去离子水中，30℃黑暗中存放48h。最后浸泡好的种子均匀陈列在消毒过的培养皿中，培养皿底部垫有两层消毒过的湿润滤纸，将培养皿盖好放置在30℃的光照培养箱中培养7天。发芽结束后，将其转移到包含2l暴露液的容器中，其中石墨烯的浓度为250μg/l。同时，另设一组空白对照组，即发芽结束后，将其转移到2l不含石墨烯的的溶液中。

(2)分别暴露7天、14天和21天后，分别收集石墨烯暴露组合空白对照的水稻的叶组织，将其剪碎，液氮冷冻后充分研磨；其次待液氮蒸发完毕后加入1ml预冷的匀浆介质继续缓慢研磨15s。随后将匀浆液缓慢倒入10ml离心管中，再用1ml匀浆介质清洗研钵四次，清洗液都汇入盛有匀浆液的离心管中。将离心管中的液体摇匀，用一层尼龙网过滤，滤渣为未研碎组织，滤液用作随后的离心。

(3)首先将石墨烯暴露组的匀浆液以300g转速离心30s，沉淀即为细胞壁，主要包括细胞壁和细胞壁碎片。滤液以1500g转速离心10min，沉淀即为色素体部分。上清液以5000g转速离心20min，沉淀即为细胞核部分。上清液以15000g转速离心30min，沉淀即为线粒体部分，上清液即为可溶性部分。

(4)将步骤(3)中所得到的叶的亚细胞组分利用生物氧化仪燃烧处理，收集生成的二氧化碳，然后通过液体闪烁计数器测定各组分中的石墨烯含量，设为a。

(5)其次将空白对照组中的匀浆液按照步骤(3)的方法得到各亚细胞组分，然后向5ml的各亚细胞组分中滴加含有1μg石墨烯的母液并振荡摇匀3h。然后分别按照差速离心法进行离心，最后测定匀浆介质中的石墨烯含量，设为b。另外，将含有1μg石墨烯的母液滴加到5个只含5ml匀浆介质不含亚细胞组分的样品中，振荡3h，然后分别按照差速离心法进行离心。最后测定匀浆介质中的石墨烯含量，设为c。通过c-b计算得到各亚细胞组分对石墨烯的吸附量。

(6)最后计算各亚细胞组分中石墨烯的真实含量，设为d，即d＝a-(c-b)。

根据建立的测定石墨烯在水稻体内亚细胞水平分布的方法，首先测定了石墨烯在有/无细胞器时离心的沉降效率及细胞器对石墨烯的富集效率，结果如表1中所示。从表1中可以看出，在不同的离心条件下，纯的石墨烯悬浮液的沉降率分别为(86.1±1.2)％、(88.4±0.7)％、(93.7±1.3)％和(95.8±1.9)％。当细胞器存在时，不同离心条件下，石墨烯的沉降率分别为(90.1±0.5)％、(93.8±1.7)％、(96.1±0.7)％和(99.5±0.9)％。在相对应的离心条件下，两者之间的差异分别为4.0％、5.4％、2.4％和1.7％，该差异称作为计算吸附量。此外，在细胞器存在时，离心后，将上清液去掉后，再加入去离子水重新悬浮亚细胞组分(沉积在底部石墨烯不会悬浮)，重新悬浮后，测定各组分悬浮液中的石墨烯含量，依次为(3.0±0.3)％、(4.9±0.5)％、(2.5±0.4)％和(1.1±0.2)％，即有1.1-4.9％的石墨烯会吸附在细胞器上。通过对比两种数据，我们发现实验所得的石墨烯在细胞器上的吸附量与计算吸附量相当，具有可比性。因此本方法对于评估石墨烯在茎叶中的亚细胞分布的方法是可行的。

基于此方法，我们测定了暴露于250μg/l石墨烯中的水稻叶的亚细胞组分中的石墨烯含量，结果发现其中32.4％的石墨烯在细胞壁和细胞膜上，43.8％的石墨烯在叶绿体上，以及17.5％的石墨烯在细胞核中。

基于此方法，我们又进一步测定了不同暴露时间下石墨烯在水稻茎和叶的亚细胞的分布规律结果分别如附图2和附图3所示。

图2为不同暴露时间下石墨烯在水稻茎的亚细胞分布变化图。结果显示石墨烯主要分布在细胞壁，其次是叶绿体中，另有少量的石墨烯分布着细胞核和线粒体以及可溶性部分中。随着暴露时间的变化，石墨烯在各亚细胞组分的含量也发生了变化，其中暴露7天后细胞壁中的石墨烯含量为0.33μg，暴露14天后增加到0.1μg，暴露21天后石墨烯在细胞壁中含量没有发生显著性的变化。对于叶绿体而言，暴露7天后，其中的石墨烯含量为0.04μg，并且随着暴露时间的延长，叶绿体中的石墨烯含量不断降低，暴露21天后，其中的石墨烯含量仅为0.01μg。

图3是不同暴露时间下石墨烯在水稻叶的亚细胞分布变化图，其变化规律与石墨烯在茎的亚细胞分布规律类似，也是主要分布在细胞壁、其次是叶绿体中，并且随时间的变化与茎的亚细胞分布变化规律一致。两者不同的是，叶的亚细胞各组分中的石墨烯含量要比茎中相应组分中的石墨烯含量少，例如叶组织中的细胞器中的石墨烯暴露7天后，含量为0.198μg，暴露14天后，石墨烯的含量为0.039μg。

表1石墨烯在有/无细胞器时离心的沉降效率及细胞器对石墨烯的富集效率

a差值所指的是石墨烯在细胞器存在的条件下沉降比例减去细胞器不存在条件下石墨烯的沉降比例。该差值称作为石墨烯在细胞器上的吸附量。

b将去离子水加入到离心管中使得细胞器悬浮，而沉积在底物的石墨烯不悬浮。测定出悬浮液中细胞器上石墨烯的含量称作为细胞器上的石墨烯吸附量。

c石墨烯暴露浓度为250μg/l的条件下，暴露7天后，各亚细胞器中的石墨烯含量。

参考文献

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