一种荧光检测脂肪酶活性的方法与流程

本发明属于生物质化学和可再生资源利用领域，具体涉及一种荧光检测脂肪酶活性的方法。

背景技术：

脂肪酶[e.c.3.1.1.3]是重要的工业用酶，能特异性识别羧酸酯中的酯键，并催化水解切割酯键生成脂肪酸和醇，在食品、化妆品、制药以及生物柴油等领域常作为催化剂使用。脂肪酶在生物化工中的大量应用，使脂肪酶活性的检测研究成为基础有机应用研究领域的重要课题。与其它水解酶类(如乙酰胆碱酯酶和碱性磷酸酶)不同，脂肪酶只在油-水界面上才能被活化，是一种界面反应酶，脂肪酶的催化属于异相催化(heterogeneous-catalyzed)，且不溶于水的脂肪酶底物需要被乳化，乳化剂的加入常会导致分析体系复杂化，产生信号干扰，并对测量的真实性产生重大影响。因此脂肪酶活性的检测与其它水解酶相比更为复杂。传统脂肪酶活性的检测方法，如ph滴定法、浊度法，操作繁琐，耗时较长，灵敏度低。因此，开发高灵敏度、高通量检测脂肪酶活性的分析方法具有重要的实际应用价值。

姜黄素是一种从姜黄根茎中分离出来的天然的二酮类化合物，作为抗癌药物，近年来在细胞培养和医学研究方面得到了较多的应用。姜黄素具有可见光吸收和荧光光谱特性，吸收峰位于410～430nm范围内，荧光发射位于460～560nm范围内。近年来，许多研究者利用姜黄素的光谱特性构建生物传感器，但姜黄素水溶性差，在水溶液中稳定性也差，限制了其实际应用。研究表明，姜黄素中的β-二酮结构可与金属离子结合，姜黄素的特征吸收峰位置基本保持不变，但强度发生变化。大豆多糖、磷脂脂质体以及非离子型表面活性剂吐温40和tritonx-100均能作为包封姜黄素的载体，显著提高其溶解性和吸收以及荧光性质。本课题组近年来致力于脂肪酶活性的比色和荧光检测基于姜黄素的特性，汤燕等通过制备吐温40-姜黄素复合物胶束，成功组装了脂肪酶活性检测的荧光法传感器。

技术实现要素：

为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的目的在于提供一种荧光检测脂肪酶活性的方法，该方法具有成本低廉、操作简单、灵敏度高的特点，可实现对脂肪酶活性的高通量检测。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种荧光检测脂肪酶活性的方法，包含如下步骤：

(1)将非离子型表面活性剂溶液和姜黄素溶液混合，然后加入可溶性铜盐溶液，得到混合溶液1，其中，姜黄素和可溶性铜盐的摩尔比为1:2；

(2)将巯基乙酸甲酯溶液和磷酸盐缓冲溶液混合，得到混合溶液2；

(3)将混合溶液2和待测脂肪酶样品混合；30～40℃水浴反应10～30min，过滤去除脂肪酶，得到混合溶液3；

(4)将混合溶液1和混合溶液3混合，20～40℃反应3～10min；进行荧光检测，然后采用外标法以荧光强度定量待测脂肪酶溶液脂肪酶活性；

步骤(1)中所述的非离子型表面活性剂为吐温40和tritonx-100中的至少一种；

步骤(1)中所述的非离子型表面活性剂优选为吐温40；

步骤(1)中所述的混合溶液1中非离子型表面活性剂的浓度优选为100～500μmol/l；

步骤(1)中所述的混合溶液1中非离子型表面活性剂的浓度进一步优选为300μmol/l；

步骤(1)中所述的混合溶液1中可溶性铜盐的浓度优选为0.4～0.6μmol/l；

步骤(1)中所述的混合溶液1中可溶性铜盐的浓度进一步优选为0.5μmol/l；

步骤(2)中所述的混合溶液2的ph优选为6～8；

步骤(2)中所述的混合溶液2的ph进一步优选为7；

步骤(2)中所述的磷酸盐缓冲液的浓度优选为0.2mmol/l，ph优选为7.0；

步骤(2)中所述的巯基乙酸甲酯溶液和磷酸盐缓冲溶液的体积比优选为3:1；

步骤(3)中混合溶液2和待测脂肪酶样品混合后巯基乙酸甲酯的浓度优选为0.75～1.875mmol/l；

步骤(3)中混合溶液2和待测脂肪酶样品混合后巯基乙酸甲酯的浓度进一步优选为1.125mmol/l；

步骤(3)中所述的水浴反应的条件优选为35℃水浴反应15min；

步骤(4)中所述的混合溶液1和混合溶液3的体积比优选为20:1；

步骤(4)中所述的反应的条件优选为25℃反应5min；

本发明的原理：

本研究以吐温40-姜黄素复合物胶束为荧光信号探针，cu²⁺为猝灭剂，巯基乙酸甲酯作为脂肪酶的底物，构建了检测脂肪酶活性的生物传感器。在cu²⁺的作用下，吐温40-姜黄素复合物胶束的荧光几乎被完全猝灭；脂肪酶可催化水解巯基乙酸甲酯生成巯基乙酸，巯基乙酸能夺取姜黄素-cu²⁺复合物上的cu²⁺从而使吐温40-姜黄素复合物胶束的荧光恢复，荧光强度恢复的程度与脂肪酶的活性有关。与传统的检测脂肪酶方法相比，本方法具有成本低廉、操作简单、灵敏度高的特点，可实现对脂肪酶活性的高通量检测。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)与现有技术相比，本发明以吐温40-姜黄素复合物胶束为荧光信号探针，cu²⁺为猝灭剂，巯基乙酸甲酯作为脂肪酶的底物，进行脂肪酶活性检测，相较于传统方法更加灵敏、检测下限更加低，可实现微量级的检测，应用更加广泛。

(2)本发明在信号源等方面进行了优化和探索，最终建立了一套基于荧光信号的检测系统，该系统的建立对于脂肪酶具有非常好的检测效果，可实现对脂肪酶活性的高通量检测。

(3)本发明成本低廉、操作简单，适用范围广，不论来源于什么物种只要是脂肪酶都可以应用该检测方法。

附图说明

图1是不同体系的荧光光谱图；其中，(a)吐温40+姜黄素；(b)吐温40+姜黄素+cu²⁺；(c)吐温40+姜黄素+cu²⁺+巯基乙酸甲酯+脂肪酶；(d)吐温40+姜黄素+cu²⁺+巯基乙酸甲酯+失活脂肪酶；(e)吐温40+姜黄素+cu²⁺+巯基乙酸甲酯。右上角内插照片为与光谱曲线相对应的荧光照片。

图2是不同体系的紫外-可见吸收光谱图；其中，(a)吐温40+姜黄素；(b)吐温40+姜黄素+cu²⁺；(c)吐温40+姜黄素+cu²⁺+巯基乙酸甲酯+脂肪酶；(d)吐温40+姜黄素+cu²⁺+巯基乙酸甲酯，右上角内插照片为与光谱曲线相对应的荧光照片。

图3是不同反应参数对姜黄素-吐温40体系荧光的影响的结果分析图；其中，a：cu²⁺浓度对姜黄素-吐温40体系荧光的影响；b：不同浓度的巯基乙酸甲酯对姜黄素-吐温40-cu²⁺体系荧光的影响；c：ph值对姜黄素-吐温40-cu²⁺体系荧光的影响；d：不同酶水解温度对姜黄素-吐温40-cu²⁺体系荧光的影响。

图4是不同活性的novozymes435脂肪酶的酶促反应动力学曲线图。

图5是不同活性的脂肪酶对姜黄素-吐温40-cu²⁺体系荧光光谱和荧光信号差值结果分析图；其中，a：不同活性的脂肪酶对姜黄素-吐温40-cu²⁺体系荧光光谱的影响；b：脂肪酶活性与姜黄素-吐温40-cu²⁺体系荧光信号差值的关系曲线，插图为线性关系曲线。

图6是姜黄素-cu2+复合物体系荧光检测脂肪酶选择性的结果分析图。

图7是实际样品检测结果分析图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例中涉及的主要仪器与试剂如下所示：

spectramaxm3微孔板检测系统(美国分子仪器公司)；电子天平(德国赛多利斯公司)；phs-3cph计(上海雷磁公司)；

吐温40、姜黄素、无水乙醇、na2hpo4、nah2po4、nacl、naoh等均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)；巯基乙酸甲酯(上海凌峰化学试剂有限公司)；cucl2(天津威晨化学试剂有限公司)；脂肪酶(novozymes435，诺维信投资有限公司)；食品脂肪酶(fnl)、霉脂肪酶(rnl)、猪胰脂肪酶(ppl)、洋葱假单胞脂肪酶(crl)(sigma-aldrich公司)。

实施例中的磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.2mmol/l，ph为7.0；

实施例1

(1)分别移取1ml300μmol/l吐温40和10μl25μmol/l姜黄素于2ml离心管中，振荡混匀，得到试样1；加入5μl100μmol/lcucl2，得到混合溶液1，其中，姜黄素和可溶性铜盐的摩尔比为1:2，吐温40的浓度为300μmol/l；

(2)向750μl1.5mmol/l巯基乙酸甲酯溶液中加入250μl磷酸盐缓冲溶液，得到混合溶液2(ph为7)；

(3)在混合溶液2中分别加入novozymes435脂肪酶或灭活的novozymes435脂肪酶(终浓度100u/ml)，其中，巯基乙酸甲酯的浓度为1.125mmol/l；35℃水浴反应15min后，滤去脂肪酶，得到混合溶液3，以不添加脂肪酶作为对照；

(4)取50μl混合溶液3加入混合溶液1中，室温25℃反应5min，得到混合溶液4。

采用荧光光谱验证上述传感机理，分别检测上述试样1、混合溶液1和混合溶液4的荧光强度和吸光度。其中，吐温40和姜黄素混合后，形成吐温40-姜黄素复合物胶束(试样1)，吐温40-姜黄素复合物胶束在波长540nm处发射强荧光(图1a)；加入cu²⁺(混合溶液1)后，荧光几乎消失，从测定的荧光曲线上可以看到最大吸收峰位置未发生偏移，但强度显著降低(图1b)，说明cu²⁺与姜黄素作用，所形成配合物能猝灭姜黄素的荧光；当再加入脂肪酶和巯基乙酸甲酯混合溶液(混合溶液4)时，姜黄素荧光强度显著增强(图1c)，说明巯基乙酸甲酯在脂肪酶作用下能导致荧光高度恢复；为进一步验证脂肪酶的作用，在巯基乙酸甲酯溶液中加入失活脂肪酶，姜黄素荧光强度只略有恢复(图1d)；加入未被脂肪酶水解的巯基乙酸甲酯，荧光恢复与加入失活脂肪酶时几乎一致(图1e)。上述实验结果表明，脂肪酶的活性是恢复被cu²⁺猝灭的姜黄素的荧光的必要条件，因此本方法可用于检测脂肪酶活性。

为了进一步验证此传感机理，测定了上述不同体系的紫外-可见吸收光谱。如图2所示，吐温40-姜黄素复合物胶束在430nm处有一个吸收峰(图2a)。加入cu²⁺后，430nm处的吸收峰消失，在355nm处新出现一个高强度的吸收峰(图2b)，说明cu²⁺与姜黄素的β-二酮结构形成配合物。分别加入未被脂肪酶水解的和已被脂肪酶水解的巯基乙酸甲酯，在355nm处的吸收峰均消失，430nm处的吸收峰重新出现，且加入脂肪酶的吸收峰强度要明显高于未加脂肪酶(图2c和2d)。上述实验结果表明，巯基乙酸甲酯的水解产物能与cu²⁺发生强作用，使姜黄素的荧光恢复，可用此分析策略检测脂肪酶活性。

实施例2猝灭剂cu²⁺浓度的影响

(1)分别移取1ml300μmol/l吐温40和10μl25μmol/l姜黄素于2ml离心管中，振荡混匀，得到试样1；加入5μl不同浓度的cucl2(40、60、80、100、120、140、160μmol/l)，得到混合溶液1；

(2)将试样1和混合溶液1转移到96孔板中在酶标仪进行荧光检测。以δf(δf＝fa－fb)为纵坐标，cu²⁺浓度为横坐标，绘制曲线，fa表示吐温40-姜黄素复合物的荧光强度，fb表示加入cu²⁺后吐温40-姜黄素体系的荧光强度。

结果见图3a，随着cu²⁺浓度增加，荧光差值逐渐增大，猝灭效果也相应增强，当cu²⁺浓度达到100μmol/l时，吐温40-姜黄素聚合物胶束体系荧光信号差值趋向稳定，荧光几乎被完全猝灭。因此，cu²⁺最佳浓度为100μmol/l。

实施例3底物巯基乙酸甲酯浓度的影响

(1)分别移取1ml300μmol/l吐温40和10μl25μmol/l姜黄素于2ml离心管中，振荡混匀，得到试样1；加入5μl100μmol/lcucl2，得到混合溶液1，其中，姜黄素和可溶性铜盐的摩尔比为1:2，吐温40的浓度为300μmol/l；

(2)向750μl不同浓度巯基乙酸甲酯溶液(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mmol/l)中加入250μl磷酸盐缓冲溶液，得到混合溶液2(ph为7)；

(3)在混合溶液2中加入novozymes435脂肪酶(终浓度100u/ml)，其中，巯基乙酸甲酯的浓度分别为0.375、0.75、1.125、1.5mmol/l；35℃水浴反应15min后，滤去脂肪酶，得到混合溶液3；

(4)取50μl混合溶液3加入混合溶液1中，室温25℃反应5min后，立即转移到96孔板中在酶标仪进行荧光检测。以δf(δf＝f－f0)为纵坐标，脂肪酶活性为横坐标，绘制曲线，f0表示未加入脂肪酶时测定的体系的荧光强度，f表示加入一定量脂肪酶时测定的荧光强度。

底物浓度是影响荧光传感方法的重要因素，浓度过低，底物被快速水解，导致过量的脂肪酶水解吐温40，影响实验结果的准确性；浓度过高，酶的催化水解效率被抑制。如图3b所示，随着底物浓度增加，荧光信号差值不断增大，当底物浓度达到1.5mmol/l时，荧光信号差值达到最大，超过1.5mmol/l时，荧光信号差值又逐渐降低，因此，底物最佳浓度为1.5mmol/l。

实施例4ph值的影响

(1)分别移取1ml300μmol/l吐温40和10μl25μmol/l姜黄素于2ml离心管中，振荡混匀，得到试样1；加入5μl100μmol/lcucl2，得到混合溶液1，其中，姜黄素和可溶性铜盐的摩尔比为1:2，吐温40的浓度为300μmol/l；

(2)向750μl1.5mmol/l巯基乙酸甲酯溶液中加入250μl磷酸盐缓冲溶液，采用磷酸或者氢氧化钠调整ph，得到ph分别为4、5、6、7、8的混合溶液2；

(3)在混合溶液2中加入novozymes435脂肪酶(终浓度100u/ml)，其中，巯基乙酸甲酯的浓度为1.125mmol/l；35℃水浴反应15min后，滤去脂肪酶，得到混合溶液3；

(4)具体操作同实施例3。

ph值对脂肪酶活性检测有很大的影响，如图3c所示，在ph4～7范围内，随着ph值增大，荧光信号差值不断增加，说明脂肪酶活性也在逐渐增强。ph＞7时，荧光信号差值减小，因此，选择传感体系的ph＝7。

实施例5水解温度的影响

(1)分别移取1ml300μmol/l吐温40和10μl25μmol/l姜黄素于2ml离心管中，振荡混匀，得到试样1；加入5μl100μmol/lcucl2，得到混合溶液1，其中，姜黄素和可溶性铜盐的摩尔比为1:2，吐温40的浓度为300μmol/l；

(2)向750μl1.5mmol/l巯基乙酸甲酯溶液中加入250μl磷酸盐缓冲溶液，得到混合溶液2(ph为7)；

(3)在混合溶液2中加入novozymes435脂肪酶(终浓度100u/ml)，其中，巯基乙酸甲酯的浓度为1.125mmol/l；不同温度(25、30、35、40、45℃)水浴反应15min后，滤去脂肪酶，得到混合溶液3；

(4)具体操作同实施例3。

温度同样影响脂肪酶的催化效率，如图3d所示，35℃时，酶的催化效率最高，高于或低于35℃，酶的催化效率都会下降，因此，选择35℃为脂肪酶的最适水解温度。

实施例6酶促反应动力学曲线的测定

(1)分别移取1ml300μmol/l吐温40和10μl25μmol/l姜黄素于2ml离心管中，振荡混匀，得到试样1；加入5μl100μmol/lcucl2，得到混合溶液1，其中，姜黄素和可溶性铜盐的摩尔比为1:2，吐温40的浓度为300μmol/l；

(2)向750μl1.5mmol/l巯基乙酸甲酯溶液中加入250μl磷酸盐缓冲溶液，得到混合溶液2(ph为7)；

(3)在混合溶液2中分别加入不同活性的novozymes435脂肪酶(终浓度0、25、50、75、100u/ml)，其中，巯基乙酸甲酯的浓度为1.125mmol/l；35℃水浴反应不同时间(0～30min)后，滤去脂肪酶，得到混合溶液3；

(4)具体操作同实施例3。

在最佳实验条件下，测定了不同活性的novozymes435脂肪酶的酶促反应动力学曲线。如图4所示，同一活性下的脂肪酶随着反应时间的延长，其荧光信号差值逐步增大，15min左右达到最大，之后基本不再随时间变化。同一时间内，随着脂肪酶活性的增大，荧光信号差值也不断增大，且荧光信号差值与脂肪酶活性成比例，可采用荧光信号差值(f-f0)检测脂肪酶活性。

实施例7方法的分析性能

(1)分别移取1ml300μmol/l吐温40和10μl25μmol/l姜黄素于2ml离心管中，振荡混匀，得到试样1；加入5μl100μmol/lcucl2，得到混合溶液1，其中，姜黄素和可溶性铜盐的摩尔比为1:2，吐温40的浓度为300μmol/l；

(2)向750μl1.5mmol/l巯基乙酸甲酯溶液中加入250μl磷酸盐缓冲溶液，得到混合溶液2(ph为7)；

(3)在混合溶液2中分别加入不同活性的novozymes435脂肪酶(终浓度0、25、50、75、100u/ml)，其中，巯基乙酸甲酯的浓度为1.125mmol/l；35℃水浴反应15min后，滤去脂肪酶，得到混合溶液3；

(4)取50μl混合溶液3加入混合溶液1中，室温25℃反应5min后，立即转移到96孔板中在酶标仪进行荧光检测。以δf(δf＝f－f0)为纵坐标，脂肪酶活性为横坐标，绘制标准曲线，f0表示未加入脂肪酶时测定的体系的荧光强度，f表示加入一定量脂肪酶时测定的荧光强度。

在最佳实验条件下，对不同活性的脂肪酶进行了检测。如图5a所示，随着脂肪酶活性的不断增加，反应体系的荧光强度逐渐升高。以荧光强度的差值(δf)为纵坐标，脂肪酶的活性为横坐标绘制标准曲线，结果如图5b所示，体系的δf值与脂肪酶活性在2～80u/ml范围内呈线性关系，线性方程为δf＝5.6842c+31.5013(r2＝0.9963，检出限为0.01u/ml(0.3mg/l)，(s/n＝3)，本方法与基于吐温-姜黄素复合物的荧光探针检测脂肪酶活性方法相比，线性范围更宽，检出限显著降低，灵敏度显著提高。

实施例8选择性实验

选取5种常见的蛋白质：碱性磷酸酯酶(alp)、牛血清白蛋白(bsa)、辣根过氧化物酶(hrp)、葡萄糖氧化酶(gox)和溶菌酶(lys)，检测本发明构建的方法对脂肪酶的选择性，具体操作同实施例7，其中，用于检测的novozymes435酶溶液的活性为60u/ml，alp、hrp、gox、lys酶溶液的活性为600u/ml，bsa溶液的质量浓度为12mg/ml(以上均为初始浓度)。

如图6所示，脂肪酶可以使体系的荧光显著恢复，而其它蛋白质对体系没有明显影响，表明本发明提供的方法具有高选择性。

实施例9实际样品分析

参照实施例7检测初始酶活性为60u/ml的novozymes435及另外4种商业脂肪酶溶液，采用外标法以荧光强度定量待测脂肪酶溶液脂肪酶活性；

如图7所示，被猝灭的吐温40-姜黄素复合物胶束的荧光均发生一定程度的恢复，测得的酶活力顺序为novozymes435＞洋葱假单胞脂肪酶(crl)＞猪胰腺脂肪酶(ppl)＞根酶脂肪酶(rnl)＞食品脂肪酶(fnl)。同时，采用了传统的恒电位滴定法测定上述5种商业脂肪酶活性，两种方法的测量结果列于表1。由表1可知，虽然恒电位滴定法和本方法所用的酶活参数不同，但两种方法测量的酶活性的变化趋势和相对大小完全一致，表明采用本方法检测脂肪酶活性的可靠性。

表1不同方法检测的脂肪酶活性

本发明利用具有抗癌效用的姜黄素的荧光性质，将姜黄素与吐温40复合构建荧光探针，实验操作简单，省去了合成复杂探针的实验步骤。选取巯基乙酸甲酯作为脂肪酶底物，建立了检测脂肪酶活性的荧光传感方法，无需乳化底物，灵敏度显著提高。利用本方法成功检测了商业脂肪酶活性，表明本方法具有良好的实用性，可用于高通量检测脂肪酶活性。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。