一种姜厚朴和厚朴的鉴别方法与流程

本发明涉及中药材检测
技术领域：
，具体涉及一种姜厚朴和厚朴的鉴别方法。厚朴为木兰科植物厚朴magnoliaofficinalisrehd.etwils.或凹叶厚朴magnoliaofficinalisrehd.etwils.var.bilobarehd.etwils.的干燥干皮、根皮及枝皮。始载于《神农本草经》，列为中品。临床上常用其炮制品姜厚朴，厚朴经姜炙后，能减少对咽喉的刺激性，而且能增强宽中和胃的功效。姜厚朴按照《中国药典》2015版一部姜厚朴项下规定：取厚朴丝，照姜汁炙法（通则0213）炒干。本品形如厚朴丝，表面灰褐色，偶见焦斑。略有姜辣气。目前，在对姜厚朴药材和厚朴药材进行鉴别时，主要采用传统的眼看、口尝、鼻闻、手摸等方法进行；但传统的方法很大程度取决于鉴别者的经验，不同的鉴别者由于鉴别经验的差异容易导致结论的偏差。因此，开发一种色谱鉴别方法对于提高鉴别的准确性具有重要的意义。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是，为了克服传统的方法在鉴别姜厚朴和厚朴中存在偏差的不足，提供一种姜厚朴和厚朴的鉴别方法。该方法采用uplc-ms法进行鉴别，大大提高了鉴别的准确性。本发明所要解决的上述技术问题，通过以下技术方案予以实现：一种姜厚朴和厚朴的鉴别方法，采用uplc-ms法进行鉴别，具体包含如下步骤：（1）制备供试品溶液；（2）将供试品溶液注入到uplc中进行梯度洗脱；（3）对梯度洗脱后的成分进行质谱检测；若梯度洗脱后的成分中含有6-姜辣素和6-姜烯酚，则供试品为姜厚朴；若梯度洗脱后的成分中不含有6-姜辣素和6-姜烯酚，则供试品为厚朴。本发明首次以6-姜辣素、6-姜烯酚作为姜厚朴中的特有成分来鉴别姜厚朴和厚朴；若梯度洗脱后的成分中含有6-姜辣素和6-姜烯酚，则供试品为姜厚朴；反之则为厚朴。此外，由于姜厚朴药材中仅含有微量的6-姜辣素和6-姜烯酚，且6-姜辣素和6-姜烯酚结构相似，通过液相色谱能很好的将二者进行分离而不会造成检测干扰。在本发明中供试品溶液的制备可以按照本领域常规方法进行制备；优选地，采用如下方法进行制备：取需要鉴别的饮片粉末0.08~0.12g，精密称定，精密加甲醇40~80ml，称定重量，超声处理，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液。取需要鉴别的饮片粉末0.1g，精密称定，精密加体积分数为60%的甲醇50ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用体积分数为60%的甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液；其中超声功率为250w，频率为40khz。优选地，步骤（2）中所述的梯度洗脱是以甲醇和乙腈作为流动相a，以水作为流动相b。进一步优选地，流动相a中甲醇和乙腈的体积比为3~5:1。最优选地，流动相a中甲醇和乙腈的体积比为4:1。优选地，所述梯度洗脱过程中，进样量为3~10µl；柱温为20~35℃；流速为0.3~0.5ml/min。最优选地，所述梯度洗脱过程中，进样量为5µl；柱温为30℃；流速为0.4ml/min。优选地，步骤（2）中所述的梯度洗脱，其洗脱条件为：0~2min时，流动相a的体积分数为35%，流动相b的体积分数为65%；2~5min时，流动相a的体积分数由35%变为45%，流动相b的体积分数由65%变为55%；5~6.5min时，流动相a的体积分数为45%，流动相b的体积分数为55%；6.5~9min时，流动相a的体积分数由45%变为55%，流动相b的体积分数由55%变为45%；9~15min时，流动相a的体积分数为55%，流动相b的体积分数为45%；15~25min时，流动相a的体积分数由55%变为100%，流动相b的体积分数由45%变为0%。由于6-姜辣素和6-姜烯酚结构相似，采用上述梯度洗脱条件能够将6-姜辣素和6-姜烯酚充分的进行分离，在检测过程中不会造成6-姜辣素和6-姜烯酚检测信号的重叠，从而造成检测干扰。在试验过程中，在上述色谱条件下，通过在液相色谱中注入6-姜辣素和6-姜烯酚的标准品，经检测，6-姜辣素和6-姜烯酚分别在13.55min和20.11min出现检测信号，检测信号的保留时间相差7分钟，这说明在上述色谱条件下能够实现对6-姜辣素和6-姜烯酚的充分分离，从而不会实现检测干扰。此外在上述色谱条件下，检测信号可以在25min内出现，检测时间短，可以实现快速液相色谱检测，提高了检测效率。优选地，步骤（3）中对梯度洗脱后的成分进行检测的具体方法为：在检测图谱中，若在供试品溶液图谱中与混合对照品溶液图谱中相应位置同时出现响应信号，说明梯度洗脱后的成分中含有6-姜辣素和6-姜烯酚，则供试品为姜厚朴；若在供试品溶液图谱中与混合对照品溶液图谱中相应位置均无响应信号，说明梯度洗脱后的成分中不含有6-姜辣素和6-姜烯酚，则供试品为厚朴；优选地，在检测图谱中，若存在质荷比为295和质荷比为277的离子碎片，说明梯度洗脱后的成分中含有6-姜辣素和6-姜烯酚，则供试品为姜厚朴；若不存在质荷比为295和质荷比为277的离子碎片，说明梯度洗脱后的成分中不含有6-姜辣素和6-姜烯酚，则供试品为厚朴。发明人还研究发现，采用质谱检测器，可以提高对6-姜辣素和6-姜烯酚相应信号的检测灵敏度。有益效果：本发明提供了一种全新的姜厚朴和厚朴的鉴别方法，该方法采用uplc-ms首次以6-姜辣素、6-姜烯酚作为姜厚朴中的特有成分来鉴别姜厚朴和厚朴，方法准确可靠；在本发明所述色谱条件下能够实现对6-姜辣素和6-姜烯酚的充分分离，从而不会造成检测干扰，提高了检测的准确率。此外在上述色谱条件下，检测信号可以在25min内出现，检测时间短，可以实现快速液相色谱检测，提高了检测效率。附图说明图1为ms-scan模式下6-姜辣素的扫描图；其中图1a为厚朴饮片的扫描图，图1b为姜厚朴饮片的扫描图；图1c为6-姜辣素的扫描图。图2为ms-scan模式下6-姜烯酚扫描图；其中图2a为厚朴饮片的扫描图，图2b为姜厚朴饮片的扫描图；图2c为6-姜烯酚的扫描图。图3为sim模式下扫描图；其中图3a为厚朴饮片的扫描图，图3b为姜厚朴饮片的扫描图；图3c为6-姜辣素和6-姜烯酚的扫描图。具体实施方式以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例对本发明不做任何形式的限定。1材料1.1仪器及试剂仪器：waters液质联用仪（液相部分acquityuplch-class、质谱部分watersxevotqdms）。xp26百万分之一天平（mettlertoledo）、me204e万分之一天平（mettlertoledo）。试剂：乙腈（色谱纯，德国merck公司）；甲酸（色谱级）；超纯水。试药：6-姜辣素（批号：110885-200102，中国食品药品检定研究院)；6-姜烯酚（批号：110753-201716，含量≧98%，中国食品药品检定研究院)；2方法2.1色谱条件固定相：acclaimc18(2.2µm，2.1x100mm)进样量：1µl流速：0.4ml/min柱温：30℃监测模式：esi+，sim，msscan洗脱梯度见下表：以甲醇：乙腈（4:1）为流动相a，以水为流动相b，按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温为30℃；流速为0.4ml/min；采用质谱检测器，电喷雾正离子模式（esi+），进行单离子监测（sim），选择质荷比（m/z）295、质荷比（m/z）277离子作为检测离子。分别吸取供试品溶液1μl、混合对照品溶液1μl，注入高效液相色谱-质谱联用仪，测定。以质荷比（m/z）295、质荷比（m/z）277离子提取的供试品离子流色谱中，应同时呈现与对照品溶液色谱保留时间一致的色谱峰。sim参数设置：msscan参数设置：序号名称扫描范围（m/z）锥孔电压（v）16-姜辣素200-7002026-姜烯酚200-700202.2对照品溶液制备取6-姜辣素、6-姜烯酚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含100μg的溶液，摇匀，即得。2.3供试品溶液制备分别取姜厚朴饮片和厚朴饮片粉末（过三号筛），取约0.1g，精密称定，精密加60%甲醇50ml，称定重量，超声处理（功率250w，频率40khz）30分钟，放冷，再称定重量，用60%甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液。3结果分别将6-姜辣素和6-姜烯酚的混合对照品溶液，姜厚朴饮片和厚朴饮片供试品溶液按2.1所述的色谱条件进行检测。结果见图1、2和3所示。如图1所示，图1b姜厚朴饮片的扫描图与图1c6-姜辣素的扫描图有相同的离子碎片（即质荷比（m/z）295的离子碎片）；而图1a厚朴饮片的扫描图中则没有相关离子碎片；说明姜厚朴中含有6-姜辣素成分，厚朴中不含有6-姜辣素成分。如图2所示，图2b姜厚朴饮片的扫描图与图2c6-姜烯酚的扫描图有相同的离子碎片（即质荷比（m/z）277的离子碎片）；而图2a厚朴饮片的扫描图中则没有相关离子碎片；说明姜厚朴中含有6-姜烯酚成分，厚朴中不含有6-姜烯酚成分。如图3所示，姜厚朴饮片在质荷比（m/z）295、质荷比（m/z）277检测离子的扫描图中，同时呈现与6-姜辣素、6-姜烯酚的保留时间一致的离子峰；其中6-姜辣素的保留时间为13.55min，6-姜烯酚的保留时间为20.11min；而厚朴饮片扫描图中则没有相关离子峰。实施例1姜厚朴和厚朴的鉴别（1）制备供试品溶液；取需要鉴别的饮片粉末（过三号筛），取约0.1g，精密称定，精密加60%甲醇50ml，称定重量，超声处理（功率250w，频率40khz）30分钟，放冷，再称定重量，用60%甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，得供试品溶液。（2）将供试品溶液注入到高效液相色谱仪中进行梯度洗脱；具体按2.1所述的色谱条件进行；（3）对梯度洗脱后的成分进行检测；检测图谱中（sim模式下扫描图），若在13.55min和20.11min同时出现离子峰，说明梯度洗脱后的成分中含有6-姜辣素和6-姜烯酚，则供试品为姜厚朴；若在13.55min和20.11min均无离子峰，说明梯度洗脱后的成分中不含有6-姜辣素和6-姜烯酚，则供试品为厚朴。实施例2姜厚朴和厚朴的鉴别（1）制备供试品溶液；取需要鉴别的饮片粉末（过三号筛），取约0.1g，精密称定，精密加60%甲醇50ml，称定重量，超声处理（功率250w，频率40khz）30分钟，放冷，再称定重量，用60%甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，得供试品溶液。（2）将供试品溶液注入到高效液相色谱仪中进行梯度洗脱；具体按2.1所述的色谱条件进行；（3）对梯度洗脱后的成分进行检测；检测图谱中（ms-scan模式下6-姜辣素的扫描图），若存在质荷比为295的离子碎片，说明梯度洗脱后的成分中含有6-姜辣素，则供试品为姜厚朴；若不存在质荷比为295的离子碎片，说明梯度洗脱后的成分中不含有6-姜辣素，则供试品为厚朴。实施例3姜厚朴和厚朴的鉴别（1）制备供试品溶液；取需要鉴别的饮片粉末（过三号筛），取约0.1g，精密称定，精密加60%甲醇50ml，称定重量，超声处理（功率250w，频率40khz）30分钟，放冷，再称定重量，用60%甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，得供试品溶液。（2）将供试品溶液注入到高效液相色谱仪中进行梯度洗脱；具体按2.1所述的色谱条件进行；（3）对梯度洗脱后的成分进行检测；检测图谱中（ms-scan模式下6-姜烯酚扫描图），若存在质荷比为277的离子碎片，说明梯度洗脱后的成分中含有6-姜烯酚，则供试品为姜厚朴；若不存在质荷比277的离子碎片，说明梯度洗脱后的成分中不含有6-姜烯酚，则供试品为厚朴。实施例4姜厚朴和厚朴的鉴别（1）制备供试品溶液；取需要鉴别的饮片粉末（过三号筛），取约0.1g，精密称定，精密加60%甲醇50ml，称定重量，超声处理（功率250w，频率40khz）30分钟，放冷，再称定重量，用60%甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，得供试品溶液。（2）将供试品溶液注入到高效液相色谱仪中进行梯度洗脱；具体按2.1所述的色谱条件进行；（3）对梯度洗脱后的成分进行检测；检测图谱中（ms-scan模式下6-姜辣素的扫描图以及ms-scan模式下6-姜烯酚扫描图），若存在质荷比为295以及质荷比为277的离子碎片，说明梯度洗脱后的成分中含有6-姜辣素和6-姜烯酚，则供试品为姜厚朴；若不存在质荷比为295以及质荷比为277的离子碎片，说明梯度洗脱后的成分中不含有6-姜辣素和6-姜烯酚，则供试品为厚朴。当前第1页12