一种测定饲料中不同价态铁离子含量的方法与流程

本发明涉及饲料质量安全检测领域，更具体地说，它涉及一种测定饲料中不同价态铁离子含量的方法。

背景技术：

铁是地球上分布最广、最常见的金属之一，也是人类、动物和植物生长必须的微量元素，参与体内营养物质的代谢过程。缺铁易导致贫血等疾病，摄入过量的铁又会提高肿瘤以及心血管和内分泌疾病的风险。饲料中铁的含量会对畜禽健康产生影响，过量的铁通过畜禽废弃物排出体外，会对植物产生铁毒害，对植物的生长、叶绿素含量及抗氧化酶活性等产生影响。铁还会影响植物对其他金属离子的吸收。我国规定饲料中铁的限量标准为250mg/kg，因此，测定饲料中铁含量对保障人类、动物和植物健康安全具有重要的意义。同时，铁离子的价态对其在动物体内的吸收和利用影响较大。因此，有必要建立相应的方法对饲料中铁离子总量和价态进行测定。

铁的检测目前主要采用原子吸收光谱分析法（aas）、电感耦合等离子体-原子发射光谱法（icp-aes）、电感耦合等离子体-质谱分析法（icp-ms）等仪器分析方法，其中原子吸收光谱法是我国现行的饲料中铁离子的国家标准检测方法。原子吸收光谱法具有准确度和精密度高等特点，但需要昂贵的仪器以及配备专业的操作人员，不适用于基层试验室。同时原子吸收法样品前处理对样品进行消解，需要消耗强酸，同时消解时间较长，不适合于现场快速分析。

近年来，研究人员也开发了多种快速分析方法，如电化学检测法、分光光度法。电化学检测法具有较高的灵敏度，但是电极基底的制备和修饰过程较为复杂，且需要配备电化学工作站。分光光度法有着灵敏度高、仪器设备简单、操作简便、快速的优点，但分光光度法测定水质中铁目前应用较为广泛，主要有硫氰酸盐分光光度法、邻菲罗啉分光光度法等，但这些检测方法灵敏度低、、显色反应速度慢，不适于对饲料中铁离子的测定。同时，常规的快速分析方法不能对不同价态的铁离子进行测定。因此，本发明旨在开发一种基于微孔显色法，且灵敏度高、线性范围宽、仪器结构简单、操作方便的实验室方法，用于饲料中总铁和不同价态铁离子的快速、高通量检测。

技术实现要素：

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供解决上述问题的一种测定饲料中不同价态铁离子含量的方法，能够快速、高通量对饲料中不同价态铁离子含量进行检测，无需复杂的样品前处理和贵重仪器，成本低，抗干扰能力强，非常适合在基层实验室推广使用。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一种测定饲料中不同价态铁离子含量的方法，其测定步骤如下：

（1）配制溶液

a1液：菲咯嗪总铁工作溶液，包括.4.0mm菲咯嗪溶液、0.1m盐酸羟胺溶液和0.1m硫代硫酸钠溶液，缓冲液为ph=6的醋酸溶液；

a2液：菲咯嗪亚铁工作溶液，包括4.0mm菲咯嗪溶液和0.1m硫代硫酸钠溶液，缓冲液为ph=6的醋酸溶液；

b液：空白溶液，0.2m醋酸缓冲溶液；

c液：铁标准溶液0、0.1、0.5、1、2、4、6、8μg/ml，分别为c1-c8铁标准液；

（2）样品前处理

将饲料样品经粉碎后与1%三氯乙酸溶液混合，比例为1:100（g/ml），振荡后通过定量滤纸过滤或离心得到上清液；

（3）检测

标准曲线组：酶标板孔中每孔加入不同浓度的c1-c8铁标准液，随后每孔加入等量的a1液；

样品组：每个样品测定需两组酶标板孔，一组测定孔中先加样品液，再加等量a1液，另一组测定孔中先加样品液，再加等量a2液；

将样品组与标准曲线组进行颜色对比，通过肉眼观察对铁离子浓度进行半定量检测。

一种测定饲料中不同价态铁离子含量的方法，其测定步骤如下：

（1）配制溶液

a1液：菲咯嗪总铁工作溶液，包括.4.0mm菲咯嗪溶液、0.1m盐酸羟胺溶液和0.1m硫代硫酸钠溶液，缓冲液为ph=6的醋酸溶液；

a2液：菲咯嗪亚铁工作溶液，包括4.0mm菲咯嗪溶液和0.1m硫代硫酸钠溶液，缓冲液为ph=6的醋酸溶液；

b液：空白溶液，0.2m醋酸缓冲溶液；

c液：铁标准溶液0、0.1、0.5、1、2、4、6、8μg/ml，分别为c1-c8铁标准液；

（2）样品前处理

将饲料样品经粉碎后与1%三氯乙酸溶液混合，比例为1:100（g/ml），振荡后通过定量滤纸过滤或离心得到上清液；

（3）检测

标准曲线组：酶标板孔中每孔加入不同浓度的c1-c8铁标准液，随后每孔加入等量的a1液；

样品组：每个样品测定需两组酶标板孔，一组测定孔中先加样品液，再加等量a1液，另一组测定孔中先加样品液，再加等量a2液；

加样完毕后所有测定孔于室温20-25℃下反应30分钟后，经酶标仪在562nm处读取吸光度值；

（4）浓度计算

对吸光度值ac与标准溶液浓度cm-std进行线性拟合，根据下列公式获得标准曲线的斜率βm：

样品提取液中的总铁浓度由下面公示计算出：

cm-sample=(asample-b)/βm×n

式中，asample为样品提取液检测孔吸光值，b为标准曲线的截距，n为饲料提取液稀释倍数；计算出：加入a1液样品孔计算所得为总铁浓度，加入a2液样品孔计算所得为二价铁离子含量，两者之差为三价铁离子含量。

本发明进一步改进技术方案是，将饲料样品经粉碎后与1%-4%的三氯乙酸溶液混合，比例为1:100（g/ml），振摇5分钟，超声提取15-30分钟，通过定量滤纸过滤或离心得到上清液进行测定。

本发明更进一步改进技术方案是，每个样品测定需4个酶标板检测孔，两个为一组平行。

菲咯嗪是一种能与亚铁有效络合的显色剂，它的灵敏度高，显色反应快，与亚铁离子形成的fe-ferrozine络合物稳定性好，但菲咯嗪同时还会和铜离子发生反应，对铁离子的测定产生干扰。本发明采取硫代硫酸钠对铜离子进行掩蔽。饲料中的三价铁离子用盐酸羟胺还原为二价铁离子，二价铁离子在ph=6、室温条件下与菲咯嗪络合形成紫色络合物，反应30分钟后，通过酶标仪在562nm处读取吸光度值，通过绘制标准曲线，计算出饲料中不同价态铁的含量。本发明经过系统优化反应条件，菲咯嗪与二价铁和三价铁生成的标准曲线基本吻合，因此，本方法只需建立一套标准曲线即可测定两种价态铁离子。

本发明有益效果：

一、本发明无需复杂的样品前处理和贵重仪器，非常适合在基层实验室推广使用。

二、本发明可用于饲料样品铁离子的检测，抗干扰能力强，检测限低，基本消除其他成分对检测的干扰。

三、本发明既可用酶标仪进行定量检测，也可以用肉眼观察，比较标准溶液产生的颜色，对铁离子浓度进行半定量检测。

四、本发明采用酶标板作为载体，可一次性对大批量样品进行检测。

五、本发明充分利用显色剂与不同价态铁反应特性，可同时检测出饲料中不同价态铁含量。

附图说明

图1为标准曲线图；

图2为不同浓度铁离子的不同吸收波长曲线图；

图3为不同ph值对铁离子标准溶液形成的fe-ferrozine络合物吸光值影响情况，其中（a）图为ph值对三价铁离子标准溶液形成的fe-ferrozine络合物吸光值影响情况；（b）图为ph值对二价铁离子标准溶液形成的fe-ferrozine络合物吸光值影响情况；

图4为不同浓度铁离子与菲咯嗪在不同温度条件下反应10h内的吸光度变化情况；

图5为铁离子在不同菲咯嗪浓度条件下的吸光度变化的情况；

图6为掩蔽前其它离子对菲咯嗪反应检测铜的干扰情况，其中（a）图是掩蔽前4μg/ml各金属离子与菲咯嗪的干扰情况，（b）图是掩蔽后4μg/ml各金属离子与菲咯嗪的干扰情况。

具体实施方式

实施例1：饲料中不同价态铁离子检测方案

（1）配制溶液

a1液：菲咯嗪总铁工作溶液，包括.4.0mm菲咯嗪溶液、0.1m盐酸羟胺溶液和0.1m硫代硫酸钠溶液，缓冲液为ph=6的醋酸溶液；

a2液：菲咯嗪亚铁工作溶液，包括4.0mm菲咯嗪溶液和0.1m硫代硫酸钠溶液，缓冲液为ph=6的醋酸溶液；

b液：空白溶液，0.2m醋酸缓冲溶液；

c液：铁标准溶液0、0.1、0.5、1、2、4、6、8μg/ml，分别为c1-c8铁标准液；

（2）样品前处理

将饲料样品经粉碎后与1%三氯乙酸溶液混合，比例为1:100（g/ml），振荡后通过定量滤纸过滤或离心得到上清液；

（3）检测

标准曲线组：酶标板孔中每孔加入不同浓度的c1-c8铁标准液，随后每孔加入等量的a1液；

样品组：每个样品测定需两组酶标板孔，一组测定孔中先加样品液，再加等量a1液，另一组测定孔中先加样品液，再加等量a2液；

加样完毕后所有测定孔于室温20-25℃下反应30分钟后，经酶标仪在562nm处读取吸光度值；

（4）浓度计算

对吸光度值ac与标准溶液浓度cm-std进行线性拟合，根据下列公式获得标准曲线的斜率βm：

样品提取液中的总铁浓度由下面公示计算出：

cm-sample=(asample-b)/βm×n

式中，asample为样品提取液检测孔吸光值，b为标准曲线的截距，n为饲料提取液稀释倍数；计算出：加入a1液样品孔计算所得为总铁浓度，加入a2液样品孔计算所得为二价铁离子含量，两者之差为三价铁离子含量。

实施例2：工作曲线的绘制

取0、0.1、0.5、1、2、4、8μg/ml的fe³⁺标准溶液100μl加入96孔板中，再加入总铁工作液100μl，30min后用酶标仪在562nm处进行吸光度测定。图l为5次测定fe³⁺标准系列平均值的回归曲线。从结果看出相关系数r为0.9999，可测定浓度范围为0.1-8μg/l。铁的含量在0.1-8μg/l范围内呈线性关系，回归方程为y=0.1425x+0.0537。

实施例3：检测波长的选择

如图2所示，fe-菲咯嗪络合物的最大吸收波长为562nm，因此，为提高检测灵敏度和降低干扰，我们选择562nm作为铁离子测定的最佳波长。

实施例4：测定条件的优化

1、反应ph值的选择

首先通过调节反应体系的ph值，研究了不同ph值对fe-菲咯嗪络合物形成的影响，见图3，其中图a为ph值对三价铁离子标准溶液形成的fe-ferrozine络合物吸光值的影响，图b为ph值对二价铁离子标准溶液形成的fe-ferrozine络合物吸光值的影响。结果表明，当ph值在4-11范围内，形成的络合物吸光值无显著差异，但考虑到铁工作液中硫代硫酸钠的稳定性，避免硫代硫酸钠在酸性条件下分解产生硫沉淀，影响光度值。此外由于不同水样中酸、碱度的差异，为确保不同样品反应条件的一致性，因此本实验最终采用高浓度的醋酸钠缓冲液（0.2m，ph=6）作为反应缓冲体系。

2、反应温度及时间的选择

本发明研究了反应时间和温度对fe-ferrozine络合物形成的影响，图4为不同浓度（1、2、4、6、8μg/ml）铁离子与菲咯嗪在不同温度条件下反应10h内的吸光度变化情况。结果表明fe-菲咯嗪络合物形成速率很快，且受反应温度影响较小，在30分钟内可形成紫色稳定络合物，且fe-菲咯嗪络合物在4℃、25℃、37℃下可稳定10h。由于本研究的目的是开发一种现场检测方法，其首选条件为室温条件下进行反应。综合分析，本试验确定了室温（20-25℃）为最优反应温度。根据图4的结果，在室温下反应30分钟的吸光度值无显著差异，因此将30分钟确定为最佳反应时间。

3、显色剂浓度的选择

本实验通过调节铁工作液中菲咯嗪的浓度研究了显色剂浓度对铁检测的影响。图5为铁离子在不同菲咯嗪浓度（0.05%、0.1%、0.2%、1%）条件下的吸光度变化的情况。图5显示，随着铁工作液中菲咯嗪浓度的增大，测定的铁浓度线性范围也增大，当浓度增大到0.2%时，铁测定线性范围保持不变。因为本实验的检测范围为0-8μg/ml，所以选用0.2%的菲咯嗪浓度。

4、其他离子的干扰和掩蔽

由于饲料中存在着很多其他金属离子，铁离子的检测极有可能受到其他离子的干扰。因此，本实验对饲料中含量较高、可能对铁测定产生干扰的离子进行了交叉反应实验分析。本实验将4μg/ml的铁离子标准溶液测定的吸光值设定为背景值，向铁离子标准溶液中分别添加浓度为1-1000μg/ml的cu²⁺、zn²⁺、mg²⁺、mn²⁺、ca²⁺，再加入铁工作液测定吸光值。根据下列公式计算干扰百分比（i.p.），以定量表示其它离子的干扰情况。

交叉反应分析的结果如图6所示，当mg²⁺、mn²⁺、ca²⁺和zn²⁺浓度分别达到＞1000μg/ml、＞1000μg/ml、＞1000μg/ml和500μg/ml，干扰百分比达到5%。因此可认为饲料样品中共存的zn²⁺、mg²⁺、mn²⁺、ca²⁺对铁的检测不会产生显著影响。而当添加了大于20μg/mlcu²⁺后，干扰百分比达到5%。表明cu²⁺可对铁的测定产生较大干扰，这与文献报道一致，因此需要采用掩蔽剂对干扰离子进行掩蔽。通过优化，本实验选择硫代硫酸钠对铜离子进行掩蔽。经反复试验，确定工作液中添加0.1m的硫代硫酸钠溶液用于铜离子的掩蔽。在此基础上，测定了掩蔽铜离子后的铁离子测定的交叉反应情况。结果表明，硫代硫酸钠对铜离子有很好的掩蔽作用。因此，本实验优化的掩蔽剂配方可以有效地消除饲料中共存离子对铁离子测定的干扰。图6为掩蔽前（a）、后（b）其它离子对菲咯嗪反应检测铜的干扰情况，其中（a）掩蔽前4μg/ml各金属离子与菲咯嗪的干扰情况，（b）掩蔽后4μg/ml各金属离子与菲咯嗪的干扰情况。

实施例5：添加回收试验

取猪配合饲料和鸡配合饲料，采用原子吸收法测定各样品中铁离子本底值的含量。随后往各样本中添加高浓度的铁离子标准溶液，至饲料中添加浓度为0、20、100、200mg/kg，每个浓度6个平行。采用本发明方法进行测定。将测定值除以添加值计算回收率，同时计算6个平行测定的相对标准偏差。结果下表所示。结果表明：在添加的浓度范围内，平均回收率在89.65%-107.50%之间，相对标准偏差小于15%，满足定量分析的要求。见下表1。

表1

以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。